專利名稱：去甲腎上腺素完全抗原的制備方法及偶聯(lián)摩爾比測定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學技術領域，具體的是說一種去甲腎上腺素(以下簡稱NE)完全抗原的制備方法以及測定去甲腎上腺素完全抗原中NE與載體的偶聯(lián)摩爾比的方法。
背景技術：
去甲腎上腺素(Norepinephrine,也稱Noradrenaline,縮寫NE或NA),舊稱“正腎上腺素”，學名1_(3，4-二羥苯基)-2-氨基乙醇，是腎上腺素去掉N-甲基后形成的物質(zhì)，在化學結構上也屬于兒茶酚胺。它既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌，是后者釋放的主要遞質(zhì)；也是一種激素，由腎上腺髓質(zhì)合成和分泌，但含量較少。多巴、多巴胺、腎上腺素與去甲腎上腺素等統(tǒng)稱為兒茶酚胺類物質(zhì)，它們都是由酪 氨酸衍生而來的系列物。兒茶酚胺作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素，與人們的健康與疾病有密切關系，它們不僅直接參與行為活動以及參與血壓、心率、呼吸和睡眠等植物神經(jīng)功能的調(diào)控，而且還與一些功能性疾病如神經(jīng)分裂癥、憂郁癥以及器質(zhì)性病變的出現(xiàn)有關。血漿及尿中兒茶酚胺的濃度水平可用于診斷高血壓、嗜鉻細胞瘤及成神經(jīng)細胞瘤等病癥，因而準確測定人體生物樣品中兒茶酚胺類物質(zhì)代謝濃度的變化，在疾病的診斷和治療中具有重要的意義。目前，人體液和組織中兒茶酚胺類物質(zhì)的不同分析方法，包括高效液相色譜法、毛細管電泳法、質(zhì)譜法、電化學法、化學發(fā)光法、熒光光度法等。NE的免疫學檢測方法不僅方法簡便，成本低廉，不需要高精密的儀器，而且檢測的靈敏度都不亞于高效液相色譜法；但建立高效免疫學檢測方法的關鍵是需要高品質(zhì)的抗體，高品質(zhì)抗體的前提是制備免疫原型較強的完全抗原，而眾所周知，NE是小分子結構，激發(fā)不了動物機體產(chǎn)生抗體，因此，研究人員需要提供一種簡單可靠的方法，以獲得一種能夠高效激發(fā)動物機體產(chǎn)生抗體的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于NE的免疫學檢測方法的免疫原型強的完全抗原。技術方案包括下述步驟，(I)將NE與載體分別溶于NaAc溶液中，分別制備NE溶液及載體溶液，然后將兩者混合后加入甲醛溶液并調(diào)節(jié)PH值在6. 0 — 6. 5 (優(yōu)選6)之間，4°C持續(xù)攪拌下進行偶聯(lián)反應20 — 28小時(優(yōu)選24小時)，得到反應混合液。(2)反應混合液通過超濾、透析或者脫鹽柱法除去反應混合液中未偶聯(lián)上的小分子物質(zhì)，緩沖液采用pH為7. 2的0. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)，得到偶聯(lián)物。(3)按照步驟(I)和步驟(2)的方法，反應體系缺失NE，維持其他各反應條件不變的條件下，制得載體mannich對照。(4)采用紫外分光光度計對載體、載體mannich對照、NE標準品及偶聯(lián)物在200-500nm之間進行掃描，在同坐標上進行圖形比對，在偶聯(lián)物與載體mannich對照蛋白濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物比載體mannich對照多出特征吸收峰，則判定偶聯(lián)成功，即得到NE完全抗原。 所述步驟(I)中，所述載體為含有游離氨基的生物大分子，具體為牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血藍蛋白。所述步驟(I)中，將NE與載體分別溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分別制備34mmoL/L NE溶液和3. 4mmoL/L載體溶液，按照NE與載體摩爾比10-20 :1(優(yōu)選10 :1)的比例，將NE溶液緩慢加入到載體溶液 中，緩慢滴加，邊滴加邊攪拌，混勻后制成混合溶液，然后在攪拌下緩慢滴加與混合溶液等體積的體積濃度為3%甲醛溶液，滴加完以后，用I. 2mol/L NaAc溶液調(diào)節(jié)PH值在6. 0-6. 5之間，4°C持續(xù)攪拌，反應20 — 28小時，得到反應混合液。所述將NE溶液緩慢加入到載體溶液中，滴加速度為1-2毫升/分，邊滴加邊攪拌，攪拌速度為100-150轉/分。所述在攪拌下緩慢滴加與混合溶液等體積的體積濃度為3%甲醛溶液，攪拌速度為100-150轉/分，滴加速度為1-2毫升/分。通過摩爾消光系數(shù)法計算NE完全抗原中NE與蛋白載體的偶聯(lián)摩爾比，首先，采用紫外分光光度掃描得到NE完全抗原在200-500nm之間兩個特征吸收峰為入I和X 2，其中入I為載體的特征吸收峰，X 2為NE完全抗原特有的吸收峰，公式如下[Ane完全抗原入i/ NE入2]/[( Ane完全抗原入「Ane完全抗原入2 X NEA l/ NE入2)/ 載體入J其中，Ane完全_ A2 NE完全抗原在\ 2的吸光度；Ane完全_ A1 NE完全抗原在\ I的吸光度；NEA2 :NE在入2處的摩爾消光系數(shù)；NEA1 :NE在入I處的摩爾消光系數(shù)；載體A2 :載體在入2處的摩爾消光系數(shù)；S#A1 :載體在入I處的摩爾消光系數(shù)。mannich法的原理是含有a -活潑氫的醛、酮與甲醛及胺(伯胺、仲胺或氨)反應，結果一個a -活潑氫被胺甲基取代，此反應又稱為胺甲基化反應，所得產(chǎn)物稱為Mannich堿(見圖I)。發(fā)明人依據(jù)mannich法的原理和NE的結構特征,運用mannich法將NE與載體偶聯(lián)，制備完全抗原(圖2)?；谏鲜鲈?，進一步的，為了達到高效偶聯(lián)，發(fā)明人對NE與載體的偶聯(lián)工藝進行了設計，NE與載體摩爾比控制在10-20:1為好，過高則干擾偶聯(lián)反應的動態(tài)平衡，后期去除也比較困難，過低則影響偶聯(lián)效果和偶聯(lián)的摩爾比；并且NE溶液和載體溶液的混合過程以緩慢滴加并配合攪拌的方式為好，這樣可以避免反應物聚集沉淀問題的發(fā)生，同理，在NE溶液和載體溶液混合后，再在攪拌下緩慢滴加甲醛溶液，是為了防止三者同時混合而出現(xiàn)的局部反應不均勻的，造成反應產(chǎn)物聚集沉淀的問題。所述偶聯(lián)反應應該在低溫下進行，優(yōu)選為4°C，且應該保持攪拌速度在100-150轉/分。通過控制上述偶聯(lián)反應的工藝條件，并且再經(jīng)過超濾、透析或者脫鹽柱法除去反應混合液中未偶聯(lián)上的小分子物質(zhì)(如未偶聯(lián)上的NE、甲醛、NaAc等小分子物質(zhì))，從而達到純化偶聯(lián)物的目的，可以得到高純度、高品質(zhì)完全抗原，從而達到高效激發(fā)動物機體產(chǎn)生抗體的目的。所述超濾、透析或者脫鹽柱法均為現(xiàn)有技術，具體方法可參見所使用具體產(chǎn)品的操作手冊。紫外分光光度計能夠快速準確的判定偶聯(lián)是否成功，但出于希望制備高品質(zhì)的完全抗原考慮，希望NE與載體的偶聯(lián)比盡可能的高，此時就需要一種能夠測定偶聯(lián)物中NE與載體的偶聯(lián)比的方法，發(fā)明人特別采用摩爾消光系數(shù)法計算NE與蛋白載體的偶聯(lián)摩爾比，通過預先獲得X I和X 2，再帶入公式計算，即可得到偶聯(lián)摩爾比。有益效果(I)本發(fā)明方法制備完全抗原步驟簡單、方法易于操作，解決了小分子結構的NE難以制備完全抗原，無法激發(fā)動物機體產(chǎn)生抗體的問題。(2)由本發(fā)明方法制備得到的完全抗原品質(zhì)高(偶聯(lián)物的偶聯(lián)爾摩爾比可達4:1以上),免疫動物后從而激發(fā)動物產(chǎn)生高品質(zhì)的抗體。(3)可以明確鑒定完全抗原合成是否成功，并精確計算小分子與載體的偶聯(lián)比，便于制備高品質(zhì)抗體過程中的質(zhì)量控制。


圖l.Mannich反應原理示意圖；圖2.載體與去甲腎上腺素(NE)偶聯(lián)示意圖；圖3.分光光度計連續(xù)波長掃描載體牛血清白蛋白(以下簡稱BSA)、BSA mannich對照、NE和NE完全抗原I (BSA — NE)在200_500nm之間吸收峰圖；圖4.分光光度計連續(xù)波長掃描載體卵清蛋白(以下簡稱OVA)、OVA mannich對 照、NE和NE完全抗原2 (0VA — NE)在200_500nm之間吸收峰圖。
具體實施例方式實施例I :I NE與載體BSA偶聯(lián)將NE與載體BSA分別溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分別制備34mmoL/L去NE溶液和3. 4mmol/L載體溶液，按照NE與載體摩爾比10-20 I的比例，將NE溶液緩慢加入到載體溶液中，緩慢滴加，邊滴加邊攪拌(滴加速度1-2毫升/分，100-150轉/分)，混勻后制成混合溶液，然后在攪拌下緩慢滴加(滴加速度1-2毫升/分，100-150轉/分)與混合溶液等體積的體積濃度為3%甲醛溶液，滴加完以后，用I. 2mol/L NaAc溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 0-6. 5之間，4°C持續(xù)攪拌，反應20 - 28小時，得到反應混合液。2反應混合液的超濾純化過程將反應混合液置于Amicon Ultra-4超濾管，以7500g離心力離心lOmin，離心完畢后補加0. OlM PBS (pH7. 2)至原體積對截留物進行稀釋洗滌，重復以上步驟7次，最后對所得溶液稀釋分裝，經(jīng)冷凍干燥，即得到偶聯(lián)物I。3 BSA mannich 對照的制備按照步驟I和2的方法，反應體系缺失NE，維持其他各反應條件不變的條件下，制備載體mannich對照，即BSA mannich對照。4偶聯(lián)物I通過分光光度計掃描鑒定將偶聯(lián)物I、NE、BSA mannich對照和載體BSA調(diào)整到相同的濃度(lmg/mL)，通過200-500nm波長掃描，并在同一坐標繪制曲線圖(如圖3)NE在343nm處有最高吸收峰，載體BSA最高吸收峰在278nm。偶聯(lián)后的偶聯(lián)物I在250nm-450nm范圍內(nèi)有兩個紫外特征峰，即入l=279nm, A 2=402nm。其中入l=279nm為蛋白質(zhì)的紫外特征吸收峰，即BSA的特征吸收峰；在偶聯(lián)物I上沒有NE的343nm吸收峰，由于反應過程中NE偶聯(lián)上蛋白質(zhì)后導致其結構的變化使其最大吸收峰偏移至402nm。由以上分析可知，合成后的溶液體系并不是載體BSA和NE的簡單疊加。通過BSA mannich對照和BSA峰形的比較，表明在缺失NE的情況下，BSA mannich對照與BSA吸收峰沒有差別，而偶聯(lián)物I與BSA的峰形差異較大，從而確證了 NE完全抗原I (BSA-NE)制備成功。NE完全抗原I中NE與BSA偶聯(lián)比的計算參見圖3，結果顯示，NE完全抗原I在可見光區(qū)有明顯兩個吸收峰(279nm和402nm)出現(xiàn)，其中279nm為載體BSA的特征吸收峰，與NE的最大吸收峰(343nm)相比，NE 完全抗原I特有的一個最大吸收峰為402nm。根據(jù)可見分光光度法，按以下公式，可以計算出NE完全抗原I中NE與BSA蛋白的偶聯(lián)比。公式[Ane 完全抗原 I 402nm/ NE 402nm]/[( A NE 完全抗原 I 279nm_ A NE 完全抗原 I 402nm X NE 279nm/ NE402nm) / BSA 279nm]A !^完全抗原! 402 NE完全抗原I在402nm的吸光度；Ane完全_! 279nm NE完全抗原I在279nm的吸光度；NE 402nm NE在402nm處的摩爾消光系數(shù)；NE 279nm NE在279nm處的摩爾消光系數(shù)；BSA 402nm :載體BSA在402nm處的摩爾消光系數(shù)；BSA 279nm :載體BSA在279nm處的摩爾消光系數(shù)。經(jīng)過計算，NE完全抗原I中NE與載體BSA的偶聯(lián)比為4. 35:1。實施例2與實施例I不同的是，所述載體采用卵清蛋白(以下簡稱0VA);所述步驟(2)中采用對反應混合液進行透析純化，其方法為將反應混合液裝入截留為14，OOODa的透析袋，封閉袋口，放入0. OlM PBS (pH7. 2)溶液中在磁力攪拌器上4°C攪拌，100轉/分，每隔3小時，更換0. OlM PBS (pH7. 2)溶液一次，更換5次以后取出透析袋中溶液得到偶聯(lián)物2。其余同實施例I。經(jīng)分光光度計掃描鑒定同樣確證了 NE完全抗原2 (OVA-NE)制備成功。NE完全抗原2中NE與OVA偶聯(lián)比的計算參見圖4，結果顯示，NE完全抗原2在可見光區(qū)有明顯的兩個吸收峰(279nm和402nm)出現(xiàn)，其中279nm為載體的特征吸收峰，NE的最大吸收峰(343nm)偶聯(lián)后有偏移現(xiàn)象，偏移至最大吸收峰個(402nm)。根據(jù)可見分光光度法，按以下公式，可以計算出NE完全抗原2中NE與OVA蛋白的偶聯(lián)比。公式[AflE 完全抗原 2 402nm/ NE 402mJ / [ ( Ane 完全抗原 2 279nm_ A NE 完全抗原 2 402nm ^ NE 279nm/ NE402nm) / OVA 279nm]Ane完全抗原2 402nm NE完全抗原2在402nm的吸光度；
Ane完全抗原2 279 : NE完全抗原2在279nm的吸光度；NE 402nm NE在402nm處的摩爾消光系數(shù)；
NE 279nm NE在279nm處的摩爾消光系數(shù)；0VA 402nm :載體OVA在402nm處的摩爾消光系數(shù)；0VA 279nm :載體OVA在279nm處的摩爾消光系數(shù)。經(jīng)過計算，NE完全抗原2中NE與載體QVA的偶聯(lián)比為4. 85:1。
權利要求
1.一種去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，包括下述步驟， (1)將去甲腎上腺素與載體分別溶于NaAc溶液中，分別制備NE溶液及載體溶液，然后將兩者混合后加入甲醛溶液并調(diào)節(jié)PH值為6. O — 6. 5后，4°C持續(xù)攪拌下進行偶聯(lián)反應20 - 28小時，得到反應混合液。
(2)反應混合液通過超濾、透析或者脫鹽柱法除去反應混合液中未偶聯(lián)上的小分子物質(zhì)，緩沖液采用pH為7. 2的0. OlM磷酸鹽緩沖液，得到偶聯(lián)物。
(3)按照步驟I和步驟2的方法，反應體系缺失去甲腎上腺素，維持其他各反應條件不變的條件下，制得載體mannich對照。
(4)采用紫外分光光度計對載體、載體mannich對照、去甲腎上腺素標準品及偶聯(lián)物在200-500nm之間進行掃描，在同坐標上進行圖形比對，在偶聯(lián)物與載體mannich對照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物比載體mannich對照多出特征吸收峰，則判定偶聯(lián)成功，即得到去甲腎上腺素完全抗原。
2.如權利要求I所述的去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所述載體為含有游離氨基的生物大分子，具體為牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血藍蛋白。
3.如權利要求I或2所述的去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，將去甲腎上腺素與載體分別溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分別制備34mmoL/L去甲腎上腺素溶液和3. 4mmol/L載體溶液，按照去甲腎上腺素與載體摩爾比10-20 1的比例，將去甲腎上腺素溶液緩慢加入到載體溶液中，緩慢滴加，邊滴加邊攪拌，混勻后制成混合溶液，然后在攪拌下緩慢滴加與混合溶液等體積的體積濃度為3%甲醛溶液，滴加完以后，用I.2mol/L NaAc溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 0-6. 5之間，4°C持續(xù)攪拌，反應20 — 28小時，得到反應混合液。
4.如權利要求3所述的去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述將NE溶液緩慢加入到載體溶液中，滴加速度為1-2毫升/分，邊滴加邊攪拌，攪拌速度為100-150轉/分。
5.如權利要求3所述的去甲腎上腺素完全抗原的制備方法，其特征在于，所述在攪拌下緩慢滴加與混合溶液等體積的體積濃度為3%甲醛溶液，攪拌速度為100-150轉/分，滴加速度為_1_2暈升/分。
6.一種測定去甲腎上腺素完全抗原中去甲腎上腺素與載體的偶聯(lián)摩爾比的方法，其特征在于，通過摩爾消光系數(shù)法計算去甲腎上腺素完全抗原中去甲腎上腺素與載體的偶聯(lián)摩爾比，首先，采用紫外分光光度掃描得到去甲腎上腺素完全抗原在200-500nm之間兩個特征吸收峰為X I和X 2，其中X I為載體的特征吸收峰，X 2為去甲腎上腺素完全抗原特有的吸收峰，公式如下 [A去甲腎上腺素完全抗原Al/ 去甲腎上腺素A2]/[( A去甲腎上腺素完全抗原Al— A去甲腎上腺素完全抗原A2 X 去甲腎上腺素Al/ 去甲腎上腺素A2)/ 載體A I] 其中， A去甲腎上腺素完全抗原A2 :去甲腎上腺素元全抗原在\ 2的吸光度； A去甲iJtJ1Jia完全抗原a I :去甲腎上腺素元全抗原在X I的吸光度； 去甲腎上腺素A2 :去甲腎上腺素在、2處的摩爾消光系數(shù)；4￥MKA1 :去甲腎上腺素在\ I處的摩爾消光系數(shù)；載體A2 :載體在\ 2處的摩爾消光系數(shù)； S#A1 :載體在、I處的摩爾消光系數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去甲腎上腺素(NE)完全抗原的制備方法及偶聯(lián)摩爾比測定方法，解決了現(xiàn)有去甲腎上腺素是小分子結構，激發(fā)不了動物機體產(chǎn)生抗體的問題，技術方案包括將NE與載體偶聯(lián)、純化、同時制備載體mannich對照，并通過紫外分光光度計對載體、載體mannich對照、NE標準品及偶聯(lián)物在200-500nm之間進行掃描，并進行圖形化比對，判定偶聯(lián)是否成功，并進一步通過摩爾消光系數(shù)法計算NE與載體載體的偶聯(lián)摩爾比。本發(fā)明方法能生產(chǎn)出高品質(zhì)的完全抗原，具有方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，適用于NE的免疫學檢測方法。
文檔編號C07K1/113GK102718860SQ20121015145
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者周琪, 李學斌, 費小戰(zhàn), 魯亮 申請人:武漢伊艾博科技有限公司