專利名稱：間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是ー種間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，所得單克隆抗體可應(yīng)用于酶聯(lián)免疫法檢測間日瘧原蟲，也可作為間日瘧原蟲快速診斷試劑盒的一部分。
背景技術(shù)：
瘧疾廣泛流行于熱帶和亞熱帶發(fā)展中國家，是ー種由蚊媒傳播的嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病。間日瘧原蟲對人類的危害僅次于惡性瘧原蟲,據(jù)估計全球收到間日瘧原蟲感染的人口高達(dá)26億，毎年約有O. 8^3億的人口因受到間日瘧原蟲感染而急性發(fā)作，在我國，2000年后瘧疾疫情呈上升趨勢，每年估計有70萬左右瘧疾患者，其主要是間日瘧患者，盡管2007年后疫情得到遏制，但是其流行程度仍然處于上升趨勢。 采用傳統(tǒng)的厚血膜鏡檢費時費力，檢測效率低下，近年來，核酸檢測方法在瘧疾診斷中得以應(yīng)用，雖然該方法具有高度的特異性和敏感性，但是技術(shù)要求較高，需要技能熟練的操作員，阻礙了該方法的進ー步普及。因此，尋求靈敏特異，簡便快速的瘧疾診斷方法在當(dāng)前瘧疾防治工作中顯得尤為重要。開發(fā)具有高靈敏度、高特異性的間日瘧抗體是建立間日瘧體外診斷技術(shù)的首要任務(wù)。間日瘧原蟲的宿主只有兩個，人和按蚊。通過中間宿主按蚊傳播疾病,被感染的人患瘧疾。其生活史分為三個時期紅細(xì)胞外期、紅細(xì)胞內(nèi)期和紅細(xì)胞期，只有紅細(xì)胞內(nèi)期發(fā)生在紅細(xì)胞內(nèi)，其余兩個發(fā)生在肝細(xì)胞中。瘧疾特異性檢測(RDTs)是ー種可以檢測瘧疾寄生蟲特異性抗原的橫向?qū)游龇椒?。RDTs方法提高了瘧疾診斷和實例診斷的準(zhǔn)確性，尤其是當(dāng)鏡檢不可用或者不可靠的情況下。市場上已經(jīng)有很多種RDT產(chǎn)品可以購買，其中一些是只可以檢測惡性瘧原蟲，而其他的ー些可以檢測惡性瘧原蟲同時檢測出ー種甚至三種以上的人源瘧疾。RDTs檢測中主要是以HRP II和瘧原蟲乳酸脫氫酶為靶抗原來檢測惡性瘧原蟲，然而瘧原蟲pan-specific乳酸脫氫酶和醛縮酶通常被當(dāng)作檢測另外三種瘧原蟲的靶抗原。醛縮酶是瘧原蟲糖酵解過程中的關(guān)鍵酶。與高等脊椎動物擁有三種醛縮酶(同エ酶)不同的是，間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲擁有同一種醛縮酶，與錐體蟲和賈第蟲類似。間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲的醛縮酶都含有390個氨基酸，他們的核苷酸和氨基酸序列的相對保守。因此，本申請選用醛縮酶作為靶抗原，分析其序列，選擇其優(yōu)勢抗原表位，篩選反應(yīng)靈敏度高，特異性強的單克隆抗體，以降低以HRP II和瘧原蟲乳酸脫氫酶為靶抗原可能出現(xiàn)的漏檢風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種間日瘧原蟲醛縮酶(aldolase)蛋白單克隆抗體的制備方法。由該方法所得的間日瘧單克隆抗體反應(yīng)靈敏度高，特異性強，成本低，可大規(guī)模制備作為商品化檢測試劑盒的原料。間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC將間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A、B、C相連接，得到重組子D ;其中，
抗原表位 A 的核酸序列為GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT ；
抗原表位 B 的核酸序列為ATTGGITTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC ；抗原表位 C 的核酸序列為AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ；
重組子 D 的核酸序列為GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAA GGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ；
(2)將重組子D和載體PET-28a( + )用BamHI和XhoI進行雙酶切，將重組子D連接到載體PET-28a ( + )上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選得到重組蛋白D表達(dá)菌株；
(3)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白D;重組蛋白D的氨基酸序列為GluGlyllelleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLySGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgpheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIIeGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu ；
(4)將獲得的重組蛋白D超聲破碎并低溫離心，溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱，洗脫得到純化重組蛋白D ；
(5)用純化后重組蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾靜脈采血測定血清效價后,取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株；
(6)將雜交瘤細(xì)胞株注射到液體石蠟預(yù)處理的Fl小鼠腹腔，隔周取腹水，50%飽和硫酸銨沉淀法和Protein G親和純化單抗,得到單克隆抗體。進ー步地，間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列為GluGlyIleIleProGlylleLysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位B的氨基酸序列為JleGlyPheLeuThrVal ArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThr。間日痕原蟲醒縮酶蛋白的抗原表位C的氨基酸序列為AsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGly AlaAspAlaGlyAlaSerLeu。本發(fā)明選擇比較溫和的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件，步驟3中的表達(dá)誘導(dǎo)溫度優(yōu)選為25。?！T導(dǎo)轉(zhuǎn)速為250rpm，誘導(dǎo)的IPTG濃度為O. ImM。本發(fā)明通過選擇間日瘧原蟲醛縮酶(aldolase)蛋白A、B、C三個優(yōu)勢抗原表位，利用基因工程技木，用柔性片段將三個抗原表位相連接，得到重組子D核苷酸序列。再通過BamHI和XhoI雙酶切連接到表達(dá)載體PET_28a ( + )中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組蛋白D表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白D。采用aldolase重組蛋白D作為抗原免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞sp2/0進行融合,篩選出10株能夠分泌針對重組蛋白D有特異性反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從注射雜交瘤細(xì)胞株后的動物腹水中獲取單克隆抗體。本發(fā)明的間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體可用于各種免疫測定法，例如免疫測定法為ELISA免疫測定法。在ー個具體實施例中，建立了雙抗體夾心ELISA檢測系統(tǒng)。純化單抗分別通過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記,ELISA正交配對實驗確定最佳組合單抗。本發(fā)明確定的最佳單抗組合由McAb623和McAb627的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。所獲得的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體的抗體亞型均為IgGl。本發(fā)明通過50%飽和硫酸銨沉淀和Protein G親和層析方法從動物腹水中獲得高純度抗體，并且實現(xiàn)了抗體的大量制備。

本發(fā)明的間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體還可用于快速診斷試劑盒或制備相應(yīng)快速診斷試劑條。
具體實施例方式實施例I間日瘧原蟲抗原的制備
I.I間日瘧原蟲優(yōu)勢抗原表位的選擇
以間日痕原蟲aldolase蛋白為祀抗原,分析其氨基酸序列親水性及抗原性,選擇A、B、C三個優(yōu)勢抗原表位?？乖砦籄 的核酸序列為GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT ;其氨基酸序列為GluGlyIleIleProGlyIleLysValAsp
LysGlyLeuValThrIIeProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla?？乖砦籅 的核酸序列為ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC ;其氨基酸序列為IIeGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThr。抗原表位C 的核酸序列為AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAG GGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ;其氨基酸序列為AsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu0I. 2優(yōu)化并合成編碼重組蛋白的核苷酸序列 間日瘧原蟲aldolase優(yōu)勢抗原表位的串聯(lián)。間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的三個優(yōu)勢抗原表位A、B、C分別重復(fù)后通過柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC連接，得到重組蛋白D氨基酸序列。柔性片段氨基酸序列為AlySerGlySerGly。重組蛋白D 氨基酸序列為GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIIeGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIIeAsnAlaLeuGlyProHiSProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu。I. 3合成編碼重組蛋白D的核苷酸序列
委托南京金思特公司化學(xué)合成編碼重組蛋白D的核苷酸序列，并在其上下游分別添加酶切位點BamHI (GGATCC)和XhoI (CTCGAG)對應(yīng)的核苷酸序列。 I. 4構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體
用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶(本發(fā)明所采用的各種分子生物學(xué)用酶均購自NEB公司)進行雙酶切重組蛋白D核苷酸序列和PET-28a ( + )載體12小時之后，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(公司)回收重組蛋白D核苷酸片段和PET-28a ( + )載體。用T4連接酶于4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，涂布于含IOOug/ml硫酸卡那霉素(上海生エ生物工程服務(wù)有限公司，貨號KB0286)的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，用含有100ug/mL的硫酸卡那霉素的300mL LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至0D600nm達(dá)O. 6左右，用終濃度為O. ImM的IPTG(生エ，貨號IB0168)進行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為25°C，轉(zhuǎn)速250rpm，5小時。誘導(dǎo)之后，將培養(yǎng)液4°C 5000rpm離心20分鐘收集菌體。I. 5重組蛋白的純化
將菌體用50mL抽提液(50mM Tris,8M Urea,O. 5M NaCl, PH8. 5)重懸，然后超聲破碎，條件為功率600W，超聲3s，間隔6s，共180次，12000rpm，4°C離心保留上清，上清用鎳瓊脂糖親和層析純化，用抽提液平衡柱子，然后用洗脫緩沖液(50mM Tris,8M Urea, O. 5MNacl，300mM咪唑pH8. 5)洗脫目的蛋白。將洗脫后的重組蛋白用透析緩沖液(50mM Tris,O. 85% NaCl, ImM EDTA, pH8. 5)透析，每隔12小時換一次透析液，換液3次后，取出透析后的蛋白液，經(jīng)聚こニ醇PEG-20000進行濃縮，于_20°C保存?zhèn)溆谩嵤├?篩選針對間日瘧原蟲重組蛋白的雜交瘤細(xì)胞株 2. I用間日瘧重組蛋白免疫小鼠
取6 8周雌性BALB/C小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)，首次免疫皮下多點注射福氏完全佐劑乳化的重組蛋白，IOOug/只，后續(xù)免疫每兩周對小鼠進行腹腔注射不完全福氏佐劑充分乳化的重組蛋白，IOOug/只，第五次免疫后尾靜脈采血，測定血清效價。擇血清效價較好的小鼠加強免疫，脾臟內(nèi)注射重組蛋白，50ug/只。2. 2細(xì)胞融合
2.2. I飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
小鼠摘眼球處死，浸泡于75%酒精中消毒5min，撕開小鼠腹外皮膚，暴露其腹膜，用無菌注射器注入5 10mL 37°C預(yù)熱的MDM無血清培養(yǎng)基(該過程切記不能刺破腸管，否則細(xì)胞可能被腸管中滴蟲等污染)，輕揉小鼠腹腔，懸浮腹腔細(xì)胞，吸出腹腔液。1500rpm離心3min，用15%胎牛血清MDM的培養(yǎng)液重懸。2. 2. 2脾細(xì)胞的制備
摘眼球處死經(jīng)加強免疫的小鼠，無菌分離出脾臟，75%酒精洗滌，再用無血清MDM培養(yǎng)液淋洗，置于篩網(wǎng)上研碎，將脾臟細(xì)胞沖洗入無菌離心管，1500rpm離心3min，用無血清IMDM培養(yǎng)液重懸，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 108。2. 2. 3細(xì)胞融合
將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按I :4比例混合，在無菌的50mL離心管中用無血清MDM培養(yǎng)基洗一次，1500rpm離心3min，棄上清，盡量不要有殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀松動。置于37°C水浴，在90s內(nèi)緩緩加入37°C預(yù)溫的ImL PEG1500，邊加邊輕微搖動。加入一定量37°C預(yù)溫的無血清MDM培養(yǎng)基終止PEG作用。離心，1500rpm離心3min，棄上清。 2. 3陽性克隆的篩選
2.3. I細(xì)胞培養(yǎng)
用15%胎牛血清HAT選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，加入飼養(yǎng)細(xì)胞。將該細(xì)胞加到96孔板內(nèi)，每孔200uL，將培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在15%胎牛血清HAT選擇培養(yǎng)基 中維持3天左右，鏡檢，觀察到瘤細(xì)胞基本死亡，雜交瘤細(xì)胞形成小集落，此時換用15%胎牛血清HT培養(yǎng)基，每孔IOOuL。2. 3. 2陽性克隆的篩選和亞克隆
采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測各孔抗體效價。抗原包被與封閉重組蛋白D抗原
用包被液(O. 05M碳酸緩沖液pH9. 6)稀釋成lug/mL，50uL/孔，37°C 3小時；配制BSA( 1%M/
V)封閉液，甩去孔中包被液，拍干后，加入封閉液，300uL/孔，4°C過夜封閉，此后甩去封閉
液，包被完成。對于檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞株，再使用有限稀釋法進行亞克隆，經(jīng)過三次克
隆后，共篩選得到10株雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞上清效價ELISA結(jié)果如下
細(xì)胞株]F184-8B3. 9. I[F183-2B12. 4. 2IF183-3G9. 10. 3IF183-9F9. 4. ITF183-11F7. 2. I. 3
保藏號 McAb612McAb619McAb620McAb621McAb622
細(xì)胞株 F184-1B1. 4. 5F207-1A9. 2. 9F207-1A12. 12. IF207-4G3. 4. 11. 3F207-9G4. 5. 7. 2.
保藏號 lMcAb623[McAb626IMcAb627IMcAb628jMcAb630
row1612 619 16201621 62216231626 627 1:6281630
A,lug/mL0. 4432.318 I. 1970. 983I. 4120. 947I. 0160.818 I. 3491.346
B,I 30.519I. 916 0.819I. 240I. 2560. 9670.3360. 720 I. 359 1.043
C,I :90. 394I. 931 0. 4480. 9040. 8380. 7430. 4240. 642 0. 794 0. 451
D,I 270. 223I. 067 0. 2950. 4690. 4490. 4220. 2490. 488 0. 284 0. 150E，I :810.1050. 575 0.0940.3630.1520.1230. 1270.206 0.1460.112F，I :2430. 0590. 213 0. 0820. 1480.0960.0660. 0520. 096 0.080 0.104
G,I 729 0. 057 0. 085 0. 093 0. 073 0. 058 0. 055 0. 049 0. 074 0. 092 0. 082
H,PBS ]0. 042 Jo. 045 10. 074 10. 044 Jo. 047 10. 043 10. 047 Jo. 054 10. 072 10. 109
實施例3單克隆抗體的大量制備及純化
3.I單克隆抗體的大量制備
選擇健康8 10周的Fl小鼠，在接種雜交瘤細(xì)胞前約一星期向每只小鼠體內(nèi)注入O. 5mL液體石蠟。每個細(xì)胞株注射5只小鼠，每只小鼠腹腔注射約I X IO6雜交瘤細(xì)胞，接種后7 10天小鼠開始產(chǎn)腹水，在此期間嚴(yán)密觀察小鼠健康狀態(tài)和腹水征象，用注射器將小鼠腹水引入試管中，如此反復(fù)幾次，在小鼠頻臨死亡之前，取盡腹水，處死小鼠。
3. 2單克隆抗體的純化
3.2. I 50%硫酸銨沉淀
用4倍腹水體積的PB溶液稀釋，往燒杯中貼壁緩緩加入5倍腹水體積的飽和硫酸銨(pH7. 0)，控制硫酸銨滴加速度為3 4mL/min，邊加邊攪拌，加完后讓溶液靜置2小時，然后將懸濁液于12000rpm離心30min。棄上清，用O. 7倍原腹水體積的PB透析液溶解沉淀。3. 2. 2透析離心
將溶解后的抗體溶液裝入透析袋中，用PB緩沖液(pH7. 4)透析，其間換液三次，兩次換液時間間隔不得少于5小吋，然后將透析完的溶液于12000rpm離心lOmin。棄沉淀，將上清用O. 22um的濾器過濾，所得溶液即為所需單克隆抗體溶液。

3. 2. 3 Protein G 親和純化
將透析后的單克隆抗體用Protein G親和純化，洗脫后收集洗脫峰，即得到純化后單抗。實施例4單克隆抗體的鑒定 4.I抗體亞類的鑒定
通過單克隆抗體亞類試劑盒(購自Pierce公司，貨號37503)，具體操作為將TMB溶液和板條恢復(fù)至室溫，8孔條姆孔加入50ul稀釋好的抗體(lug/mL), 8孔條姆孔加入50ul HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG+IgM+IgA,輕輕敲擊板子使其混勻,板子遮蓋好室溫放置I小時,板子拍干，用IXWash Buffer加滿各孔,再拍干,可用紙巾吸干剩余液體，同上步驟,洗漆三次。姆孔加75ulTMB顯色底物，5分鐘后加入終止液，吸光度450nm讀數(shù)，吸光度>0. 2就可以視為是陽性。經(jīng)鑒定，本實驗所得10株雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗均為IgGl型。4. 2單克隆抗體抗原表位的鑒定
將篩選得到的McAb612、McAb620等10個單克隆抗體分別稀釋至lug/mL，50uL/孔包被
酶標(biāo)板，4°C過夜。用PBST洗板三次，用1%BSA封閉，4°C過夜，用PBST洗板三次，待用。將
篩選得到的McAb612、McAb620等10個單克隆抗體稀釋至5ug/mL,稀釋重組蛋白D抗原稀
釋至lug/mL ,取各稀釋好單抗500 uL ,稀釋抗原50 uL ,加入EP管中，混合至于37°C I
小時，混合液50uL/孔加入酶標(biāo)板中，同時設(shè)PBS對照，37°C反應(yīng)30min，洗滌三次，稀釋羊抗
醒縮酶aldolase-PcAb至lug/mL,加入酶標(biāo)板中，50uL/孔,37°C反應(yīng)30min,洗板三次,加入
1:5000稀釋的兔抗羊抗體，50uL/孔，37°C反應(yīng)30min，洗板三次，K-Blue TMB 50uL/孔顯色
5min，加入2MH2SO4 50uL/孔，于酶標(biāo)儀檢測各孔0D450值，檢測結(jié)果如下
row1612161916201621[622[6231626[627[628[630
Ag-McAb6120. 0400. 5890. 5750. 4360. 3530. 6340. 5130. 427 0. 3880. 342 :
Ag-McAb6190.5130.1120.680I. 7350. 5750.2970.4240.2610. 5770.297:
Ag-McAb6200. 4360. 7180. 0270. 6950. 5330. 2610. 2160. 2910. 6020. 446 :
Ag-McAb6210.5332.0110.7150.0610.6620.3320.3350.2860.3850.502:
Ag-McAb6220. 3870.6040.6430. 7080.039.0.4230.5210.2750.2290.477:
Ag-McAb6230. 4270. 6800. 6640. 5330. 4150. 0960. 294I. 303I. 4460. 356 :
Ag-McAb6260. 3420. 6010. 6430. 5750. 3820. 2950. 0750. 3020. 4960. 391 :
Ag-McAb6270.2910. 7110.6950.5130.4451.1160.4340.054 0.5230.375:
Ag-McAb6280. 4240. 5770. 7470. 4360. 303I. 5610. 4360. 289 0. 0260. 424 :
Ag-McAb6300. 3880. 2970. 3130. 3280. 3110. 3450. 2610. 3840. 2750.058:
PBS11. 15511. 01711. 303〔1.116[l. 250[l. 07411. 352[l. 228[l. 068[l. 226由上表可知，McAb619和McAb621抗原表位不同，McAb623與McAb627、McAb628抗原表位不同。4. 3 HPR標(biāo)記單抗的制備
取4mg的HRP溶于O. 5ml的雙餾水中，加入新配O. 06 mo I/L的過碘酸鈉溶液O. 5 mL(10mL+128mg過碘酸鈉)，混勻置4°C冰箱30min，取出后加入O. 16 mol/L(10 mL水+0. I mL乙ニ醇)こニ醇水溶液O. 5mL,于室溫放置30min。分別加入7. 50mg/ml的McAb619、McAb621、McAb623、McAb627、McAb628抗體溶液Iml混勻，裝入透析袋中，對O. 05mol/L PH9. 5碳酸鹽緩沖液透析6h (或者過夜)，使之結(jié)合。加5 mg/mL NaBH4溶液O. 2mL，混勻置冰箱2h。將上述溶液放于O. 01 mo I/L pH7.4的PBS緩沖液中，置4°C冰箱4h。在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，，混勻，4°C 30min,離心，去上清，沉淀以少許O. 01 mo I/L pH7. 4的PBS緩沖液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4°C透析除鹽過夜。次日取出離心，取沉淀，用O. 01 mo I/L pH7. 4的PBS緩沖液溶解，即得酶-抗體結(jié)合物。4.4單克隆抗體配對
將用雜交瘤單抗 McAb619、McAb621、McAb623、McAb627、McAb628 稀釋至 lug/mL，50uL/
孔包被酶標(biāo)板，4 V過夜。用PBST洗板三次，用1%BSA封閉，4 V過夜。用PBST洗板三次，取間
日瘧陽性臨床血清標(biāo)本以及間日瘧臨床陰性標(biāo)本，50uL/孔，37°C反應(yīng)lh，同上洗滌三次，
加入5株單抗的HRP標(biāo)記物，37°C反應(yīng)30min，洗板三次，K-Blue TMB 50uL/孔顯色5min，
加入2M H2SO4 50uL/孔，于酶標(biāo)儀檢測各孔0D450和0D630值，根據(jù)酶標(biāo)結(jié)果求P/N值(陽
性標(biāo)本檢測均值與陰性標(biāo)本檢測均值比值)，結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.間日瘧原蟲醛縮酶蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC將間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A、B、C相連接，得到重組子D ;其中， 抗原表位 A 的核酸序列為GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT ； 抗原表位 B 的核酸序列為ATTGGITTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC ； 抗原表位 C 的核酸序列為AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； 重組子 D 的核酸序列為GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； (2)將重組子D和載體PET-28a( + )用BamHI和XhoI進行雙酶切，將重組子D連接到載體PET-28a ( + )上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選得到重組蛋白D表達(dá)菌株； (3)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白D:重組蛋白D的氨基酸序列為GluGlyllelleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIIeGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu ； (4)將獲得的重組蛋白D超聲破碎并低溫離心，溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱，洗脫得到純化重組蛋白D ； (5)用純化后重組蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾靜脈采血測定血清效價后,取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株； (6)將雜交瘤細(xì)胞株注射到液體石蠟預(yù)處理的Fl小鼠腹腔，隔周取腹水，50%飽和硫酸銨沉淀法和Protein G親和純化單抗,得到單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干，間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列為GluGlyIIeIIeProGlyIleLysValAspLysGlyLeuValThrIIePro CysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干，間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位B的氨基酸序列為！IleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSer LeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIIeAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAiaLeuThr。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干，間日瘧原蟲醛縮酶蛋白的抗原表位 C 的氨基酸序列為AsnSerLeuAlaThrTyrGlyLy sTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu0
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3中的表達(dá)誘導(dǎo)溫度為25°C，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為250rpm，誘導(dǎo)的IPTG濃度為O. ImM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種間日瘧醛縮酶(aldolase)蛋白單克隆抗體的制備方法，該抗體是針對以aldolase蛋白為靶抗原，選擇A、B、C三個優(yōu)勢抗原表位，通過柔性片段連接A、B、C三個優(yōu)勢抗原表位，形成重組子D，并在其上下游分別添加BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點，雙酶切后插入載體PET-28a(+)載體中，構(gòu)建重組蛋白D表達(dá)載體，利用大腸桿菌BL21表達(dá)重組蛋白D，免疫Balb/c小鼠，取其脾臟細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到10株穩(wěn)定分泌aldolase蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明所得單克隆抗體能特異性識別間日瘧原蟲aldolase蛋白，可用于間日瘧感染的特異性檢測，特異性高，反應(yīng)靈敏，實驗成本低，適合高通量快速檢測。
文檔編號C07K16/40GK102690351SQ20121016577
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者龐醒華, 張海燕, 陳東 申請人:杭州傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司