專利名稱：用于檢測(cè)t-2和ht-2毒素的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)T-2和HT-2毒素的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。
背景技術(shù)：
T-2毒素和HT-2毒素是A類單端孢霉烯族毒素，由早熟禾鐮刀菌(F. poae)和擬分枝孢鐮刀菌(F. sporotrichioides)在濕冷的生長(zhǎng)環(huán)境和潮濕的儲(chǔ)存條件下產(chǎn)生,廣泛存在于自然界，污染玉米、小麥、燕麥、黑麥等谷物，以玉米污染最為常見(jiàn)。T-2毒素和HT-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，干擾生物體能量代謝，有致癌和致畸性，對(duì)人、畜危害極大，因此建立靈敏的糧食和飼料中的T-2和HT-2毒素檢測(cè)方法十分重要。糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JACFA)規(guī)定的T-2和HT-2毒素的每日最大耐受攝入量(PMTDI)為60ngKg(JECFA，2001)，以色列規(guī)定谷物飼料中T-2毒素不得超過(guò)IOOii g/kg，歐洲國(guó)家規(guī)定T-2和HT-2在谷物中的最高殘留限量(MRL)為20-300 y g/Kg (FA0, 2004)，我國(guó)規(guī)定豬配合飼料和禽配合飼料中T-2毒素的允許量為lmg/kg (GB21693/2008)。目前檢測(cè)T-2和HT-2毒素的方法主要有薄層色譜法、氣相、液相色譜法以及酶聯(lián)免疫方法(ELISA)、試紙條等免疫學(xué)方法。薄層層析法檢測(cè)的精度低(最低檢出量為200ng)，氣相、液相需要精密儀器和專業(yè)操作人員，不利于大面積推廣與快速檢測(cè)。ELISA方法具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合大量樣本的篩檢，近年來(lái)倍受關(guān)注。ELISA基于抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，抗體對(duì)毒素的特異性決定了方法的靈敏性、假陽(yáng)性率、假陰性率，所以制備特異的單克隆抗體是此類方法的關(guān)鍵。現(xiàn)有用于制備T-2毒素抗體的完全抗原有兩類，一類抗原合成方法是用連接臂丁二酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)、0-羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)和T-2毒素C-3位置的羥基反應(yīng)，C-3的羥基生成羧基，羧基和蛋白質(zhì)的氨基連接，合成 T-2-HS(HG、CMO)-BSA (GIgG)。Chu 等(1985)合成抗原 T_2HS_GIgG，得到兩株細(xì)胞12C12和15H6，單克隆抗體可以檢測(cè)T-2毒素和HT-2毒素，12C12和15H6針 對(duì) T-2 毒素的 IC5tl 分別是 133iig/mL 和 152iig/mL。1988 年，日本學(xué)者 Satoshi (1988)等用戊二酸酐代替琥珀酸酐，羊免疫球蛋白做連接蛋白，即合成抗原T-2HG-GIgG，獲得細(xì)胞株7D4，抗體針對(duì)T-2毒素的IC5tl是Ing/mL。我國(guó)T-2毒素的抗體研究較晚，90年代楊傳和(1990)制備抗原T-2HS-GIgG，得到細(xì)胞株1D7，IC5tl是180ng/mL。另一類抗原是用于檢測(cè)T-2毒素的代謝物，Chu等(1987)在T-2的R8側(cè)鏈水解，生成T_2tetraol、T_2tetraol四乙酸鹽，再酶解T-2tetra0l四乙酸鹽生成T_2毒素的中間代謝物3_AcNE0S，最后合成完全抗原3-AcNEOS-HS-BSA，得到細(xì)胞株H159B1D5，所得抗體可識(shí)別T-2毒素及其代謝物(T-2、Ac-T-2、3-0H-T-2、DAS)，這種方法比較復(fù)雜，反應(yīng)的步驟較多，特別是T_2tetraol的產(chǎn)率低于10%，副產(chǎn)物多，需要耗費(fèi)大量T-2毒素，這些缺陷嚴(yán)重制約了這種方法的應(yīng)用。楊傳和(1990)的1D7抗體IC5tl是180ng/mL，和T-2的限量標(biāo)準(zhǔn)比較其靈敏度比較低，樣品檢測(cè)時(shí)需要繁瑣的萃取凈化方法才能達(dá)到檢測(cè)要求，需要較長(zhǎng)的樣品處理時(shí)間，不利于快速篩選?？梢?jiàn)，現(xiàn)有抗體的靈敏度和特異性都較差，不能完全滿足T-2和HT-2毒素的檢測(cè)要求。因此，制備出特異、靈敏的單克隆抗體，簡(jiǎn)化提取凈化方法，更好地檢測(cè)谷物和飼料中的T-2毒素和HT-2毒素具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種能識(shí)別T-2和HT-2毒素的單克隆抗體和檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用以及酶聯(lián)免疫方法和試劑盒在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種能同時(shí)識(shí)別T-2和HT-2毒素的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2所分泌的。所述的雜交瘤細(xì)胞T-2，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO C201189。所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。包含所述的單克隆抗體的試劑盒。所述的試劑盒是檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒。所述的試劑盒在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下(I)將T-2毒素與戊二酸酐(HG)反應(yīng)后的產(chǎn)物(T-2HG)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原(T-2HG-BSA)；(2)將T-2毒素與丁二酸酐(HS)反應(yīng)后的產(chǎn)物(T-2HS)與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原(T-2HS-0VA)；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號(hào)為CCTCC NO C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCC NO C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標(biāo)板)；(6)將待測(cè)樣品用體積百分比為50%的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液提取、濾紙過(guò)濾、樣品稀釋液稀釋得到待測(cè)物；(7)對(duì)步驟(6)的待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)；其中，樣品稀釋液的組分及配比為=NaCl8. 0g, KH2PO4O. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g，KCl0. 2g,加雙蒸水至lOOOmL。所述的酶聯(lián)免疫方法在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明制備的單克隆抗體能夠識(shí)別T-2毒素和HT-2毒素2種單端孢霉烯族毒素，IC50值分別為I. 46 u g/L和26. 26 u g/L,識(shí)別靈敏度高，抗體特異性好；(2)本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒可用于檢測(cè)谷物、飼料中的T-2和HT-2毒素，檢測(cè)靈敏度、精密度高、準(zhǔn)確性好；(3)合成步驟少，樣品處理方法簡(jiǎn)單，利于快速篩選。


圖I為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2為本發(fā)明的單克隆抗體與T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)曲線，X軸為T(mén)-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值,Y軸為T(mén)-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。 實(shí)施例I免疫原和包被原的制備半抗原的合成10mg的T-2毒素溶于0. 4ml吡啶中，加入21Omg的HG(或HS)，蒸汽浴下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后氮?dú)獯蹈扇軇?，將反?yīng)物重新溶解在5ml的氯仿中，并用5ml水洗4遍，然后再將其氮?dú)獯蹈?，產(chǎn)物即T-2HG (或T-2HS)。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到0. 2ml DMF,加入10倍摩爾濃度的碳二亞胺(DCC)與5倍摩爾濃度的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，攪拌Ih，氮?dú)獯蹈?。免疫原的合成將半抗原T-2HG轉(zhuǎn)入0. 2ml的DMF中，將反應(yīng)液逐滴滴加到25mgBSAdOml 0. lmol/L磷酸鹽)溶液中，磁力攪拌24h，將反應(yīng)液裝入透析袋中，于磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析3天，每12h更換一次透析液。離心，取上清，冷凍備用。包被原的合成將半抗原T-2HS轉(zhuǎn)入0. 2ml的DMF中，將反應(yīng)液逐滴滴加到25mgOVAdOml 0. lmol/L磷酸鹽)溶液中，磁力攪拌24h，將反應(yīng)液裝入透析袋中，于PBS緩沖液中透析3天，每12h更換一次透析液。離心，取上清，冷凍備用。實(shí)施例2單克隆抗體的制備2. I小鼠免疫參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版中的方法以實(shí)施例I制備的T-2HG-BSA偶聯(lián)物為免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠。首次免疫時(shí)用弗氏完全佐劑乳化的抗原注射于小鼠的頸背部皮下，以后每隔15d(首免與二免間隔21d)用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫三次以后，第8天尾靜脈采血，37°C凝固0. 5h，4°C靜置過(guò)夜，4000r/min離心5min分離血清。間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)血清對(duì)藥物的特異性。免疫合格的小鼠(效價(jià)高、靈敏度好)停止免疫以備融合。2. 2細(xì)胞融合與篩選在融合前3天(最好與上次免疫相隔3周以上)給免疫合格的小鼠腹腔注射含100 u g免疫原的蛋白溶液(不加佐劑)，強(qiáng)化免疫。融合前I天取未免疫的Balb/c鼠一只制備飼養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，取3 5 X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞混合(比例為1:10 5:10)。1500r/min離心5min，將離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上，控干水滴。輕輕地敲擊管底，使管底細(xì)胞成糊狀，將其放置于37°C水浴中,將吸有0. 8mL預(yù)溫至37°C的50%聚乙二醇(PEG，購(gòu)自Amersco)的ImL刻度吸管插入到管底，60sec內(nèi)緩緩加PEG到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，加完后靜置90sec，將離心管插到離心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL預(yù)溫至37°C的RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沿管壁緩緩加到融合細(xì)胞上，邊加邊輕輕晃動(dòng)離心管，第I分鐘逐滴加入lmL(3sec/滴)，第2分鐘再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min內(nèi)加完)。加完第一個(gè)IOmL后，接著沿管壁補(bǔ)加RPMI-1640培養(yǎng)基至50mL，加完后擰緊蓋，緩慢顛倒幾次，混勻。1500r/min離心5min，棄去上清，用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的72mL HAT完全培養(yǎng)基輕輕將融合細(xì)胞攪拌重懸。將融合細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2滴/孔。一次融合可接種5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當(dāng)天算起為0d，前面3d盡量不要?jiǎng)蛹?xì)胞板，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。第3d每孔補(bǔ)加I滴HAT完全培養(yǎng)基并觀察集落生長(zhǎng)情況；第5d每孔吸出1/2培養(yǎng)上清(100 u L)，再加入I滴HT完全培養(yǎng)基；以后每隔3d同上法吸去1/2培養(yǎng)上清，換入HT完全培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積1/4左右即可取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以實(shí)施例I制備的T-2HS-0VA偶聯(lián)物為包被原，利用ELISA方法篩選出分泌抗T-2毒素的陽(yáng)性細(xì)胞孔。對(duì)篩選出來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞孔利用有限稀釋法連續(xù)3次克隆化，最終建立一株穩(wěn)定分泌抗T-2毒素抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)平均值為99. 5條，高于親本細(xì)胞的染色體數(shù)目(SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體平均數(shù)為58條,脾細(xì)胞染色體為40條)，說(shuō)明融合細(xì)胞的確是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞株命名為 T-2，并于2011年9月8日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :C201189。2. 3腹水單抗制備與鑒定 在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射0. 5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔接種0. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)采集腹水，純化獲得單克隆抗體。以單克隆抗體亞型鑒定試紙條確定單克隆抗體為IgGl亞型，kappa輕鏈。實(shí)施例3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立3. I試劑配制碳酸鹽緩沖液(pH9. 6):準(zhǔn)確稱取Na2CO3L 59g、NaHC032. 93g，少量超純水溶解，定容至 lOOOmL。洗滌液(pH7.4):準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 12H20 2. 90g, KCl0. 20g,少量超純水溶解，加入Tween 200. 50mL,定容至lOOOmL。磷酸鹽緩沖液(pH7.4)準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 12H202. 90g, KC10. 20g，少量超純水溶解，定容至1000mL。封閉液準(zhǔn)確稱取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸鹽緩沖液IOOOmL,攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。底物混合液準(zhǔn)確吸取底物B液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)10mL，加入100 U L底物A液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液準(zhǔn)確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2方陣滴定法采用方陣滴定法初步選擇包被原濃度和抗體稀釋度。使用碳酸鹽緩沖液將T-2HS-0VA包被原倍比稀釋成64、32、16、8ii g/mL，從第一至第4列依次縱向加入96孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；洗滌3次，拍干，加入封閉液250yL，37°C封閉2h ;洗滌3次，拍干，單克隆抗體使用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成 1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:70000，從第一至第八行依次橫向加入96孔酶標(biāo)板，37°C孵育30min ;洗滌3次，拍干，各孔加入用磷酸鹽緩沖液1:5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(簡(jiǎn)稱二抗，以下所指二抗均為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自武漢飛羿生物技術(shù)有限公司)100ii L，37°C孵育30min ;洗滌4次，拍干，各孔加入底物混合液100 yL，避光顯色15min ;加入終止液50 ii L ;用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD值)。方陣滴定結(jié)果見(jiàn)表1，初步選擇幾個(gè)OD值接近2. 0,且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被濃度及對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度組合。結(jié)果表明，可選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(8,20000)、(16，40000)、 (32，70000)表I單克隆抗體方陣滴定

權(quán)利要求
1.一種能同時(shí)識(shí)別T-2和HT-2毒素的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號(hào)為CCTCCNO C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞T-2，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO C201189o
3.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
4.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6.權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。
7.一種檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下 (1)將T-2毒素與戊二酸酐反應(yīng)后的產(chǎn)物與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原； (2)將T-2毒素與丁二酸酐反應(yīng)后的產(chǎn)物與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號(hào)為CCTCCNO C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2 ； (4)用保藏號(hào)為CCTCCNO C201189的雜交瘤細(xì)胞T-2制備單克隆抗體； (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體； (6)將待測(cè)樣品用體積百分比為50%的N，N-二甲基甲酰胺溶液提取、濾紙過(guò)濾、樣品稀釋液稀釋得到待測(cè)物； (7)對(duì)步驟(6)的待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)， 其中， 樣品稀釋液的組分及配比為=NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g，KCl O. 2g，加雙蒸水至1000mL。
8.權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫方法在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能識(shí)別T-2和HT-2毒素的特異性單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞T-2所分泌的，該雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC201189。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)T-2和HT-2毒素的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒及其在T-2和HT-2毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體識(shí)別靈敏度高，抗體特異性好， IC50值分別為1.46μg/L和26.26μg/L，本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒檢測(cè)精密度高、準(zhǔn)確性好，樣品處理方法簡(jiǎn)單，利于快速篩選。
文檔編號(hào)C07K16/14GK102766208SQ201210177240
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉振利, 常芳芳, 彭大鵬, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)