專利名稱：應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然植物的分離制備，具體涉及應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法。
背景技術：
大葉白麻(Poacynum hendersonii),夾竹桃科(Apocynaceae)白麻屬(PoacynumL)的ー種直立半灌木，常與羅布麻屬的羅布紅麻(Pocynum venetum)、白麻屬的白麻(Pocynum pictum ) 一起被人們統稱為羅布麻。羅布麻，作為茶飲和藥用具有悠久歷史，多部典籍對此進行了記載。據《中華本草》記載，其藥用部位為葉，味甘，微苦，性涼，有清熱平肝，利水消腫之功效，主治高血壓，眩暈，頭痛，心悸，失眠，水腫尿少等癥?！吨袊幍洹芬矊α_布麻有記載“清熱利水，平肝安神，用于高血壓、頭暈、心悸、失眠等”?，F代研究表明，羅布麻具有降壓降脂、保肝、抗抑郁、鎮(zhèn)靜、延緩衰老及增強免疫力等功效。另外，目前羅布麻 葉已被開發(fā)成保健茶飲，有止渴、清熱解毒、降低血壓等強身健體之功效。目前三種“羅布麻”中應用較多的為羅布紅麻，大葉白麻多作為其替代品應用。為了推進大葉白麻的開發(fā)利用，有關其化學成分的研究已經展開雷振環(huán)、臺寶山、田瑞華等從大葉白麻中分離得到兩個木質素成分(-)-丁香脂素和( + )-松脂素-4-0-β葡萄糖苷。堵年生、張云峰、馬成等從大葉白麻中分離得到11種化學成分，井根據各種化合物的含量指定羅布麻甲素和丁香樹脂醇-雙-O-β -D-葡萄糖苷作為大葉白麻的標識化合物及相關產品的功能指標成分(中國專利，申請?zhí)?00410079914. 8)。魏錦屏、李青山也對大葉白麻進行了研究，并從中分離得到15個化學成分。在上述研究中，研究者都采用常規(guī)柱色譜、重結晶等傳統分離方法來分離大葉白麻中的単體化合物，不僅耗時耗力、污染嚴重，而且實驗過程中存在不可逆吸附及實驗者分離水平的高低不同的現象，大大制約了操作的重復性和単體化合物的制備。因此，單純由研究者采用傳統方法分離得到的単體化合物很難滿足大葉白麻進ー步研究和產品開發(fā)的需求。高速逆流色譜是近年來發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需固定相的高效、快速的液液分配色譜技術，具有分離量大、樣品無損失、回收率高、分離溶劑選擇靈活等優(yōu)點，目前已廣泛應用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保、化工等領域內化學成分的分離制備和純化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，以能快速、高效制備槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯三種黃酮苷單體，優(yōu)化所需要的溶劑體系和高速逆流色譜的相關參數，從而使得從大葉白麻中經ー步純化即可得到純度在95%以上三種單體得以實現。應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷單體的方法，采取的技術方案是一種應用高速逆流色譜儀從大葉白麻葉中快速分離制備三種黃酮苷的方法是以大葉白麻葉為原料，經過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96%。
(3)利用液相色譜技術對樣品純度進行檢驗
所述步驟(I)大葉白麻粗提物浸膏的制備a將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘渣和提取液。b再于殘渣內加入40%_90%的酒精5-20倍，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液。c合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。所述步驟(2)高速逆流色譜純化a將溶劑系統正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上樣溶液使用；b使高速逆流色譜儀以5. 0-20 mL/min的素的充滿上相溶液，然后轉動主機，同時將流動相泵入，待達到平衡后，由進樣閥進樣，于254 nm波長下檢測，根據檢測器譜圖收集目標成分。
所述步驟(3)利用液相色譜技術檢驗樣品樣品純度，色譜條件為C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動相A-甲醇，B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測波長為 254 nm。所述的步驟(2)中高速逆流色譜主機的轉速為500-900轉/分鐘，流動相流速
O.8-3. O mL/min ο步驟(2)中大葉白麻浸膏量為50-300 mg，即可以取50 — 300mg數值區(qū)間的任一
重量大葉白麻浸膏。上述方法在制取三種單體物質的過程中，時間控制方式分別是異槲皮苷的保留時間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時間為150-220 min，異槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰時間為230-300 min。該方法以大葉白麻為原料，經過粗提物浸膏的制備、高速逆流色譜純化、HPLC純度檢驗等步驟處理，所得三種單體含量均高于95%，符合ー類植物新藥和標準對照品要求。該方法具有處理簡單，樣品損失少，制備量大，制備單品純度高及重復性好等優(yōu)點，適用于從各種含有槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的天然產物中獲取其高純度單體。


圖I是實施例I中大葉白麻浸膏的高效液相色譜圖。圖2是實施例I按照為本發(fā)明步驟，利用高速逆流色譜分離得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯等三種黃酮苷的色譜圖。圖3為實施例I中分離得到的三種黃酮苷槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酯的化學結構示意圖。圖4為實施例I分離純化得到的異槲皮苷的色譜圖。圖5為實施例I分離純化得到的槲皮素-3-0-槐糖苷的色譜圖。圖6為實施例I分離純化得到的異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的色譜圖。
具體實施例方式以下是
具體實施例方式將大葉白麻葉于40-90%的こ醇溶液中回流提取，真空懸干得浸膏，然后采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液(5:3:5)構成的混合溶液作為溶劑體系，經制備型高速逆流色譜儀進行分離純化，即得槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酷。優(yōu)化得出的高速逆流色譜分離純化大葉白麻中三種黃酮的具體步驟
I、大葉白麻粗提物浸膏的制備①將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘渣和提取液。②再于殘渣內加入40%_90%的酒精5-20倍，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液。③合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。
2、高速逆流色譜純化①將溶劑系統正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動相，在50-300 mg數值區(qū)間取任一重量的浸膏，溶于5ml上相和5ml下相的混合物中，得上樣溶液；②以5-24 mL/min的速度將固定相快速注入高速逆流色譜儀，使之充滿固定相溶液，然后以650-900 rpm/min轉速，轉動高速逆流色譜主機。同時將流動相以O. 8-3. O mL/min速度泵入，待達到平衡后，由進樣閥進樣，于254 nm波長下檢測，根據檢測器譜圖收集目標成分。3.利用高效液相色譜對制的樣品的純度檢驗色譜條件為C18柱(250mmX4. 6 mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動相A-甲醇；B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測波長為 254 nm。上述方法在制取三種單體物質的過程中，時間控制是異槲皮苷的保留時間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時間為150-220 min，異槲皮苷_6”-0_丙ニ酸酯的出峰時間為230-300 min。即25-50 min時間段內制得的是異槲皮苷，150-220 min時間段內制得的是懈皮素-3-0-槐糖苷,230-300 min時間段內制得的是懈皮素-3_0_槐糖苷。實施例I:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 g，加入IL 60%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘渣和提取液；將殘渣內再加入60 %的酒精1L，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動相。根據色譜圖收集相應的組分，回收溶液即得化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為96. 8%，98. 2%，99. 5%。實施例2:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入0.8 L 70%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘渣和提取液；將殘渣內再加入70 %的酒精O. 8 L，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動相。根據色譜圖收集相應的組分，回收溶液即得化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為97. 2%，98. 5%，98. 0%。實施例3:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入1.2 L 80%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘渣和提取液；將殘渣內再加入80 %的酒精I. 2 L，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動相。根據色譜圖收集相應的組分，回收溶液即得化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的純度分別為98. 1%，96. 5%, 99. 3%。實施例4:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入1.5 L 85%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘渣和提取液；將殘渣內再加入85 %的酒精I. 5 L，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動相。根據色譜圖收集相應的組分，回收溶液即得化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6” -O-丙ニ酸酯的純度分別為96. 8 %，97. 9%，98. 6%。實施例5:
將已粉碎好的大葉白麻粉末100 8，加入0.6 L 50%的こ醇溶液，回流提取100 min，分離殘渣和提取液；將殘渣內再加入50 %的酒精O. 6 L，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏。高速逆流色譜純化采用正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水(5:3:5，v/v/v)溶液所組成的溶劑體系分離純化大葉白麻浸膏，上相為固定相，下相為流動相。根據色譜圖收集相應的組分，回收溶液即得化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定，所得化合物為槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-0-丙ニ酸酷。采用面積歸ー化計算，槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯的純度分別為95. 8 %，96. 9%, 97. 7%。
權利要求
1.一種應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征是以大葉白麻葉為原料，經過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-0-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷_6”-O-丙ニ酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96% ；(3)利用液相色譜技術對樣品純度進行檢驗； 所述步驟(I)大葉白麻粗提物浸膏的制備a將已粉碎好的大葉白麻，加入5-30倍的.40%-90%的こ醇溶液，回流提取30-240 min,分離殘渣和提取液；b再于殘渣內加入40%_90%的酒精5-20倍，重復回流提取2-3次，分離殘渣和提取液；c合并上述回流所得提取液，減壓回收合并液，得大葉白麻提取物浸膏； 所述步驟(2)高速逆流色譜純化a將溶劑系統正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液按照體積比5:3:5配制于分液漏斗中，充分搖動后靜置分層，以上相為固定相，下相為流動相，取50-300 mg浸膏，溶于5mL上相和5mL下相的混合溶液中，作上樣溶液使用；b使高速逆流色譜儀以5. 0-20 mL/min的素的充滿上相溶液，然后轉動主機，同時將流動相泵入，待達到平衡后，由進樣閥進樣，于254 nm波長下檢測，根據檢測器譜圖收集目標成分； 所述步驟(3)利用液相色譜技術檢驗樣品樣品純度，色譜條件為C18柱(250mm X 4. 6mm),填料直徑i. d.，5 μ m,流動相A-甲醇，B-水；梯度洗脫程序0-20 min,A: B= (20-70) to A:B (80-30)，流速I. O mL/min,檢測波長為 254 nm。
2.根據權利要求I所述的步驟(2)，其特征在于高速逆流色譜所采用的溶劑系統為正丁醇-石油醚-O. 5%醋酸水溶液，體積比為5:3: 5。
3.根據權利要求I所述的步驟(2)，其特征在于高速逆流色譜主機的轉速為650-900轉/分鐘，流動相流速O. 8-3. O mL/min。
4.根據權利要求I所述步驟(2)中大葉白麻浸膏量為50— 300mg，是指數值區(qū)間的任一重量大葉白麻浸膏。
5.根據權利要求I所述的應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征在于異槲皮苷的保留時間為25-50 min，槲皮素-3-0-槐糖苷的保留時間為150-220min，異槲皮苷-6”-O-丙ニ酸酯的出峰時間為230-300 min。
全文摘要
一種應用高速逆流色譜法從大葉白麻中純化三種黃酮苷的方法，其特征是以大葉白麻葉為原料，經過下列步驟處理(1)粗提物浸膏的制備；(2)高速逆流色譜純化，得到槲皮素-3-O-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-O-丙二酸酯三種黃酮苷，其純度均高于96%；(3)利用液相色譜技術對樣品純度進行檢驗。所得三種單體含量均高于95%，符合一類植物新藥和標準對照品要求。該方法具有處理簡單，樣品損失少，制備量大，制備單品純度高及重復性好等優(yōu)點，適用于從各種含有槲皮素-3-O-槐糖苷、異槲皮苷和異槲皮苷-6”-O-丙二酸酯的天然產物中獲取其高純度單體。
文檔編號C07H17/07GK102702289SQ20121018247
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權日2012年6月5日
發(fā)明者史俊友, 景年華, 江帆 申請人:曲靖師范學院