一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種可供檢測(cè)個(gè)體中細(xì)菌耐藥性的熒光檢測(cè)方法中所用的廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物，其結(jié)構(gòu)如下所示：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的熒光底物C-2可準(zhǔn)確的定性檢測(cè)出不同樣品中的抗頭孢菌素的細(xì)菌，可用于臨床或其他檢測(cè)領(lǐng)域制備相應(yīng)的診斷試劑或診斷試劑盒，具有廣泛的應(yīng)用空間和實(shí)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種廣譜β_內(nèi)酰胺酶熒光底物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種可用于檢測(cè)廣譜β內(nèi)酰胺抗生素治療的細(xì)菌耐藥性的熒光底物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自從人類在上世紀(jì)20年代首次發(fā)現(xiàn)以青霉素為代表的β_內(nèi)酰胺類抗生素以來(lái)，它們已經(jīng)成為治療細(xì)菌感染的一線藥物，挽救了無(wú)數(shù)人的生命。同其它類別的抗生素相比，β -內(nèi)酰胺類抗生素具有療效高，毒性低的特性。但是，細(xì)菌也在不斷的進(jìn)化各種抗藥機(jī)制。目前，抗藥性細(xì)菌感染已經(jīng)成為全球性的問(wèn)題。特別是在中國(guó)，印度，已經(jīng)其他一些國(guó)家，由于存在著濫用抗生素的現(xiàn)象，出現(xiàn)超級(jí)抗藥性細(xì)菌，從而導(dǎo)致無(wú)藥可治的可能性是不容忽視的。
[0003]細(xì)菌對(duì)抗β -內(nèi)酰胺類抗生素的最主要機(jī)制是通過(guò)β -內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)的。它們可以有效的分解內(nèi)酰胺類抗生素。為抵消這些酶的作用，在臨床上可以采取了兩種方法。第一，共同使用β_內(nèi)酰胺類藥物和β_內(nèi)酰胺酶抑制劑。一些處方藥利用這一策略，包括(氨芐青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉維酸鉀)。第二是開(kāi)發(fā)不被普通β_內(nèi)酰胺酶降解的藥物，比如許多第三和第四代的廣譜頭孢菌素。然而，抗生素的發(fā)展和抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)是一個(gè)矛和盾的關(guān)系。目前，許多在臨床上檢測(cè)到的細(xì)菌已經(jīng)具有了分解第三和第四代的頭孢菌素的能力。這主要是由廣譜內(nèi)酰胺酶所造成的。
[0004]由于細(xì)菌耐藥性的發(fā)展與誤用/濫用抗生素是緊密相關(guān)的，為延長(zhǎng)廣譜抗生素的有效使用期，在臨床上治療細(xì)菌感染應(yīng)該盡可能的做到對(duì)癥下藥，避免使用無(wú)必要的廣譜抗生素。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，快速，靈敏，和準(zhǔn)確診斷細(xì)菌菌株對(duì)各種內(nèi)酰胺類藥物的藥敏程度是必須的步驟。
[0005]在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，抗生素的使用受到嚴(yán)格控制。但在中國(guó)，印度，以及發(fā)展中國(guó)家，抗生素被大大濫用和誤用，其后果是抗藥性細(xì)菌的不斷出現(xiàn)。2009年在印度出現(xiàn)的新德里金屬內(nèi)酰胺酶，NDM-1，是一個(gè)典型的例子。這個(gè)蛋白質(zhì)酶可以水解目前所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。換句話說(shuō)，含有NDM-1的細(xì)菌可以抵御任何β-內(nèi)酰胺類抗生素。同時(shí)，由于全球的交通便利，在一地得到的抗藥性細(xì)菌可以很容易的傳播到世界各地，從而造成大規(guī)模的微生物感染。
[0006]為盡可能的延緩抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和延長(zhǎng)現(xiàn)有抗生素的使用壽命，防止抗生素的濫用和誤用是一個(gè)有力的手段。這要求在臨床治療細(xì)菌感染過(guò)程中，能夠盡快確定細(xì)菌對(duì)不同抗生素的抗藥和敏感程度，以防止過(guò)分使用，或者無(wú)效使用抗生素。另外，在治療敗血癥病人時(shí)，由于及早使用正確的抗生素和病人的生存率直接掛鉤，這也需要盡快確定細(xì)菌對(duì)不同抗生素的抗藥和敏感程度。
[0007]β -內(nèi)酰胺類抗生素被廣泛應(yīng)用在臨床和畜牧業(yè)中用來(lái)治療細(xì)菌感染。特別是第三四代頭孢菌素是一線抗生素藥物。但是，廣譜內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)使得三四代頭孢菌素不再是治療細(xì)菌感染的萬(wàn)能妙藥。在臨床上迫切需要一種快速的能夠確定細(xì)菌是否對(duì)三四代頭孢菌素具有抗藥性的分析方法。利用β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物來(lái)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的存在是一個(gè)普遍的分析方法。事實(shí)上，目前許多現(xiàn)有的熒光β-內(nèi)酰胺酶的底物可以做到高靈敏度和實(shí)時(shí)的對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)。然而，所以這些分子都不具有選擇性，即不可能區(qū)分普通和廣譜β-內(nèi)酰胺酶。
[0008]由于含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對(duì)第三四代廣譜頭孢菌素敏感，而含有廣譜β_內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對(duì)第三四代廣譜頭孢菌素具有抗藥性。我們希望能夠有一種快捷的方法來(lái)區(qū)分這兩類細(xì)菌，從而可以盡快確定臨床細(xì)菌感染是否可以用第三四代廣譜頭孢菌素來(lái)治療。
[0009]目前，國(guó)內(nèi)外用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌抗藥性的方法可以分成3大類。
[0010]第一類是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，又可以分為液體培養(yǎng)基和固態(tài)培養(yǎng)基的方法。液體培養(yǎng)基方法可以準(zhǔn)確測(cè)定一種抗生素的最低抑菌濃度。但是，當(dāng)待測(cè)抗生素品種較多時(shí)，此方法工作量大，所以已經(jīng)逐漸被固態(tài)培養(yǎng)基方法所取代。固態(tài)培養(yǎng)基方法又可以分為若干類，主要有紙片擴(kuò)散法，E-test，等等。比如，在紙片擴(kuò)散中，不同的抗生素藥片被放置在固態(tài)培養(yǎng)基表面。當(dāng)細(xì)菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)時(shí)，如果對(duì)某種抗生素敏感，這在此藥片周圍形成一個(gè)清晰的環(huán)狀無(wú)菌帶。其大小受細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感程度所決定。如果細(xì)菌對(duì)此抗生素有抗藥性，這不會(huì)形成此無(wú)菌帶。這類基于微生物培養(yǎng)技術(shù)的方法目前是細(xì)菌抗藥性檢測(cè)的主流方法。但是，由于細(xì)菌生長(zhǎng)需要時(shí)間，此類方法至少需要48-72小時(shí)。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌，比如結(jié)核分支桿菌，需要的時(shí)間更長(zhǎng)，因此對(duì)于需要盡快知道細(xì)菌抗藥性的情況，例如敗血癥病人的治療， 這類方法無(wú)法及時(shí)提供選擇抗生素的必要信息。
[0011]第二類方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)的基因方法。病人樣品可以用針對(duì)β -內(nèi)酰胺酶基因的特定探針進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后來(lái)檢測(cè)得到抗藥性的基因變異。此類方法快速，靈敏。但是，由于此類方法不是功能性測(cè)定，所以只能用來(lái)檢測(cè)已知的耐藥機(jī)制，而不能確定以往未知的全新抗藥機(jī)理。
[0012]第三類方法是直接測(cè)定β -內(nèi)酰胺酶的降解β -內(nèi)酰胺類抗生素的功能。目前有多種內(nèi)酰胺酶的熒光底物可以選擇。這類底物本身沒(méi)有熒光，但是，當(dāng)它們被內(nèi)酰胺酶分解后，會(huì)有熒光產(chǎn)品出現(xiàn)。通過(guò)觀測(cè)熒光強(qiáng)度變化，可以確定內(nèi)酰胺酶的存在。但是，現(xiàn)有內(nèi)酰胺酶底物無(wú)法區(qū)分普通和廣譜內(nèi)酰胺酶。所以并不能夠起到指導(dǎo)抗生素選擇的作用。
[0013]概括而言，雖然目前的相關(guān)技術(shù)在它們的適用領(lǐng)域中有無(wú)可取代的位置，但在特定的應(yīng)用中，特別是在處理治療敗血癥病人的過(guò)程中，它們也有著種種局限。所以，一種可以快速區(qū)分普通和廣譜β_內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)方法是迫切需要的。在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)同類產(chǎn)品。類似產(chǎn)品有日本Kanto Chemical公司生產(chǎn)的Cica-β-test試劑。Cica-β-test試劑也可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌是否對(duì)三四代頭孢菌素具有抗藥性。但是，由于Cica-β -test試劑檢測(cè)依賴于顏色變化(陽(yáng)性樣品的顏色從黃色變到紅色)，靈敏度至少要比本產(chǎn)品的熒光檢測(cè)法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。另外一個(gè)類似產(chǎn)品是美國(guó)Life Technologies公司生產(chǎn)的GeneBLAze試劑。GeneBLAze試劑也是基于熒光檢測(cè)，但是，此試劑只能用來(lái)無(wú)差別的檢測(cè)所有的β-內(nèi)酰胺酶的存在，而不能特異性的檢測(cè)能夠降解三四代頭孢菌的廣譜內(nèi)酰胺酶。此外，GeneBLAze試劑只是一個(gè)研究用產(chǎn)品，用來(lái)進(jìn)行一些真核細(xì)胞的光學(xué)顯像實(shí)驗(yàn)，而不是在臨床上用于檢測(cè)細(xì)菌抗藥性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]早期的青霉素以及一二代的頭孢菌素能夠被普通β -內(nèi)酰胺酶所分解，所以含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對(duì)它們具有抗藥性。但是，在只有普通內(nèi)酰胺酶存在的情況下，第三和第四代頭孢菌素是穩(wěn)定的。這主要是因?yàn)榈谌偷谒拇^孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)上有一個(gè)特殊的取代基，對(duì)普通β -內(nèi)酰胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β -內(nèi)酰胺酶不能有效的分解三四代頭孢菌素。換句話說(shuō)，只含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對(duì)三四代頭孢菌素敏感。然而，廣譜內(nèi)酰胺酶，包括金屬內(nèi)酰胺酶以及由普通內(nèi)酰胺酶突變而來(lái)的超廣譜β內(nèi)酰胺酶，不受此取代基的影響，因而可以有效的降解三四代頭孢菌素。
[0015]以往的β -內(nèi)酰胺酶的熒光底物不具有在三四代頭孢菌素上的特殊取代基，所以它們可以同時(shí)被普通和廣譜β -內(nèi)酰胺酶所分解。因此它們可以檢測(cè)所有的β -內(nèi)酰胺酶，但是無(wú)法區(qū)分這兩類的內(nèi)酰胺酶。
[0016]解決上述技術(shù)問(wèn)題可通過(guò)設(shè)計(jì)并合成一種全新的內(nèi)酰胺酶的熒光底物，此底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含了在三四代頭孢菌素上的特殊取代基。所以，它對(duì)普通內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，但是可以被廣譜內(nèi)酰胺酶所降解，從而得到可以觀察到的熒光信號(hào)變化。因此，在臨床上使用時(shí)，可以特定檢測(cè)到含有廣譜內(nèi)酰胺酶的抗藥性細(xì)菌。
[0017]根據(jù)此想法和思路，發(fā)明人通過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究與分析和理論探索，已成功得到預(yù)期的研究結(jié)果和應(yīng)用產(chǎn)品細(xì)菌耐藥性熒光檢測(cè)試劑盒。
[0018]本發(fā)明的目的之一是提供一種新的廣譜β -內(nèi)酰胺酶熒光底物，其具體結(jié)構(gòu)式如下所示的化合物或所述化合物的對(duì)映體、消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體:
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物，其特征在于:所述廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的具體結(jié)構(gòu)式如下所示的化合物或所述化合物的對(duì)映體、消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體:
2.一種制備權(quán)利要求1所述廣譜β_內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，包括如下具體步驟A~Ε、Β~E、C~E或D~Ε,具體化學(xué)反應(yīng)式如下所示:
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于:步驟A操作為:以頭孢噻肟鈉為原料在酸性條件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，調(diào)節(jié)pH值到9后，萃取提??；洗滌有機(jī)層，干燥，除去溶劑；經(jīng)硅膠柱分離純化，收集組分除去溶劑后得到化合物I ; 步驟B操作為:將2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-羥基-苯并三唑、二異丙基乙胺、加入化合物I和三苯甲基甘氨酸混合溶解，攪拌，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液提取，洗滌有機(jī)層濃縮后，經(jīng)硅膠柱分離純化，收集組分除去溶劑后得到化合物2 ; 步驟C操作為:三異丙基硅烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，攪拌，除去溶劑后洗滌，然后溶解在乙腈和磷酸鈉緩沖液中，加入從新鮮桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物攪拌，除去乙酰酯酶，濾液濃縮，調(diào)PH值至3.5左右，緩慢加入Ph2CN2和乙腈，攪拌，調(diào)整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取兩次，有機(jī)層加入三苯甲基甘氨酸的羥基琥珀酼亞胺脂，并用高效液相色譜法來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成后，混合物用鹽水洗滌三次后，濃縮除去溶劑后重新溶解于二氯甲烷中，繼續(xù)加入4-硝基苯基氯和吡啶，攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)硅膠柱分離純化，收集組分除去溶劑后得到化合物3 ； 步驟D操作為:化合物4溶解于含有二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0° C下攪拌用膠柱純化分離洗脫，得到化合物5 ； 步驟E操作為:三異丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，攪拌，除去溶劑，用二氯甲烷洗滌3次后重新溶解在二甲基亞砜中，然后加入化合物6和二異丙基乙胺，攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)制備高效液相色譜純化，用島津高效液相色譜法在540nm波長(zhǎng)檢測(cè)，收集組分得到化合物7，即所述的β -內(nèi)酰胺酶熒光底物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，所述步驟A具體反應(yīng)為:以頭孢噻肟鈉為原料加入I毫摩爾的鹽酸和甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在0° C下混合攪拌直到特征的紫色消失；在混合物中加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值到9后，用乙酸乙酯萃取提取；有機(jī)層先后用水和飽和鹽水洗滌，干燥，在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑；富集物用30%正己烷-乙酸乙酯在50克的硅膠柱上進(jìn)行分離純化，收集組分干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，所述步驟B具體反應(yīng)為:在乙腈溶液中添加2-(1!1-苯并三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-羥基-苯并三唑和二異丙基乙胺，然后在-20° C下加入化合物I和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20° C下攪拌，然后自然升溫到0° C，并繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液倒入含冰水和2Μ HCl的混合液中，用100毫升的二氯甲烷提取，有機(jī)層用飽和鹽水洗兩次，干燥，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到淡黃色固體，所述淡黃色固體經(jīng)硅膠柱以15%乙酸乙酯-正己烷洗脫純化，收集組分用干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，所述步驟C具體反應(yīng)為:三異丙基硅烷和三氟乙酸在-20° C分別加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，混合物在0° C下攪拌，除去溶劑后以干燥乙醚洗滌三次，然后溶解在乙腈和磷酸鈉緩沖液(pH值=6.5)中，繼續(xù)加入從新鮮桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物攪拌過(guò)夜，加入丙酮沉淀乙酰酯酶，得到的黃色濾液濃縮，用稀鹽酸(0.8摩爾/升)酸化至pH值3.5左右，緩慢加入Ph2CN2和乙腈，攪拌0.5小時(shí)后，溶液調(diào)整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取兩次，有機(jī)層加入三苯甲基甘氨酸的羥基琥珀酼亞胺脂，并用高效液相色譜法來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成后，混合物用鹽水洗滌三次后，濃縮除去溶劑；黃色油狀產(chǎn)物被重新溶解于二氯甲烷中，繼續(xù)加入4-硝基苯基氯和吡啶，混合物在-20° C下攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物加載到硅膠柱上用25%丙酮一正己烷洗脫純化，收集組分旋干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，所述步驟D具體反應(yīng)為:化合物4溶解在含有二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0° C下攪拌用膠柱純化，并用25%丙酮一正己烷洗脫后收集。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的方法，其特征在于，所述步驟E具體反應(yīng)為:三異丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，攪拌，除去溶劑，用二氯甲烷洗滌3次后重新溶解在二甲基亞砜中，然后加入化合物6和二異丙基乙胺，在0° C下攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)制備高效液相色譜純化，用島津高效液相色譜法在540nm波長(zhǎng)檢測(cè)，收集組分冷凍干燥。
9.一種權(quán)利要求1所述的廣譜β -內(nèi)酰胺酶熒光底物的應(yīng)用，其特征在于:所述是廣譜β_內(nèi)酰胺酶熒光底物用于制備檢測(cè)個(gè)體耐藥性的診斷檢測(cè)試劑或診斷檢測(cè)試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的廣譜β-內(nèi)酰胺酶熒光底物的應(yīng)用，其特征在于:所述的診斷檢測(cè)試劑或診斷檢測(cè)試劑盒`于檢測(cè)β_內(nèi)酰胺類抗生素的個(gè)體耐藥性。
【文檔編號(hào)】C07K5/062GK103509083SQ201210219507
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月28日
【發(fā)明者】王郁生 申請(qǐng)人:王郁生