專利名稱：腦膜炎球菌nmb1870的嵌合型、雜交和串聯(lián)多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫接種,特別是免疫接種抵御奈瑟球菌(Neisseria)屬，例如腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)(腦膜炎球菌)病原菌所致疾病的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是莢膜革蘭氏陰性細菌,其寄居在約10%人群的上呼吸道中。雖然已有抗血清群A、C、W135和Y的多糖和偶聯(lián)物疫苗，但該方法 不能應(yīng)用于血清群B，因為其莢膜多糖是聚唾液酸的聚合物，是一種人體自身抗原。現(xiàn)已利用外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白來開發(fā)抗血清群B的疫苗。這些疫苗能引發(fā)血清殺細菌抗體應(yīng)答并提供保護以抵御疾病，但它們不能誘導(dǎo)交叉菌株保護作用[I]。因此，一些研究人員將注意力集中在疫苗所用的特定腦膜炎球菌抗原上[2]。一種這樣的抗原是“NMB1870”。該蛋白質(zhì)最初披露為菌株MC58的蛋白質(zhì)“741”[參考文獻3中的SEQ ID 2535和2536 ;本文SEQ ID I]，也稱為“GNA1870”[參考文獻4_6，根據(jù)參考文獻2]和“0RF2086”[7-9]。該脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清群中表達，也見于多種腦膜炎球菌菌株中。NMB1870序列分成三個家族(在本文中稱為家族1、11和III)，發(fā)現(xiàn)針對某給定家族的抗血清在同一家族中具有殺菌活性，但對于表達其它兩家族之一的菌株無此活性，即具有家族內(nèi)交叉保護作用，但不具有家族間保護作用。因此，為利用NMB1870實現(xiàn)交叉菌株保護作用，利用了多個家族的此蛋白。有人提出可將不同家族蛋白表達成雜交蛋白[10-12]，包括將兩種或三種所述家族中的此蛋白表達在一條多肽鏈中，從而無需分別表達和純化蛋白質(zhì)。檢驗了幾種雜交體，得到令人鼓舞的抗腦膜炎球菌效力。
本發(fā)明的目的之一是提供其它改進方法來克服NMB1870所致保護作用的家族特異性，并利用這些方法來提供抵御腦膜炎球菌疾病和/或感染，特別是血清群B的免疫力。

發(fā)明內(nèi)容
作為補充參考文獻13所述的工作，本發(fā)明人用一個家族的NMB1870序列取代入另一家族的相應(yīng)位置，其目的是產(chǎn)生不具有野生型多肽的家族特異性的嵌合型NMB1870。除了工程改造一種NMB1870使之具有所有三個家族的特征，本發(fā)明人還制備了包含多個家族的NMB1870序列的新雜交多肽和串聯(lián)多肽，從而補充了參考文獻10和12所述的工作。雖然各家族的NMB1870多肽能引發(fā)僅對同一 NMB1870家族內(nèi)的菌株有效的抗體(例如，在小鼠中)，但本發(fā)明的嵌合型雜交和串聯(lián)多肽能引發(fā)識別多個家族的NMB1870多肽的抗體。
本發(fā)明還鑒定了 NMB1870的各種新的多態(tài)性形式，包括與以前報道的三種家族不同的序列(家族IV)。
NMB1870 家族取代參考文獻13披露了將一個NMB1870家族的序列取代入另一 NMB1870框架中，從而產(chǎn)生了嵌合型NMB1870多肽。本發(fā)明人對雜交體實施了進一步研究，鑒定到在家族INMB1870序列中進行取代的許多關(guān)鍵殘基。這些殘基的取代可以提聞此多妝引發(fā)能與家族II多肽交叉反應(yīng)的抗體的能力。因此，本發(fā)明提供包含與SEQ ID N0:57有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽，其中一個或多個以下殘基被另一氨基酸取代或刪除F14 ；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T56 ；A67 ；G68 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；N83 ；K85 ；D97 ；D102 ；P105 ；G107 ；R109 ；S114 ；S116 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；K135 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。優(yōu)選以下殘基中至少一個倍被取代F14；T16 ；Q18 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；T56 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；K85 ；D97 ；D102 ；S114 ；S116 ；L118 ;K135。參考文獻 13 未選擇這些殘基中的任一個進行取代。優(yōu)選進行取代或刪除的氨基酸是F14；T16 ；Q1 8 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。優(yōu)選取代這些殘基，而優(yōu)選刪除E51。優(yōu)選用家族II或III的NMB1870中相應(yīng)氨基酸來取代所述殘基。因此，優(yōu)選的取代是F14L ；T16I ；Q18K ；Q20N ；D21N ；S22P ；E23D ；H24K ；S25I ；S25T ；G26D ；K27S ；K31Q ；Q33S ；R35L ；I36V ；G37S ；I39L ；K48Q ；G52D ；R54K ；T56E ；A67P ；G68N ；K70R ；T72H ；A78T ；A79K ；N83H ；N83Y；K85R ；D97E ；D102E ；P105A ；G107E ；R109S ；S114L ；S116D ；L118R ；N120G ；Q121S ；A122E ；K135R ；T147I ；V148G ；N149E ；G150K ；I151V ；R152H ;H153E。該清單中只有殘基25和83具有一個以上的優(yōu)選取代殘基，因為所有其它殘基在家族I、II和III的兩個家族中具有相同的氨基酸。所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 57有至少70%相同性，例如彡75%、彡80%、彡85%、彡90%、彡95%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%或更高。該序列可以是更大序列的一部分。給予宿主動物后，該多肽能誘導(dǎo)殺細菌的抗-腦膜炎球菌抗體，在優(yōu)選的實施方式中，該多肽能誘導(dǎo)抵御三個NMB1870家族I-III中各家族菌株的殺細菌抗體。下文給出了殺細菌應(yīng)答的其它信息。一種優(yōu)選的氨基酸序列是SEQ ID N0:58，與SEQ ID NO:57相比，其以下殘基被取代F14 ；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；N83 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。殘基 E51 被刪除。另一取代的序列是SEQ ID N0:59o另一取代的序列是SEQ ID N0:60。用于取代的表面環(huán)已鑒定的SEQ ID NO: I表面環(huán)為⑴氨基酸164-168 ；⑵氨基酸179-182 ； (3)氨基酸 188-196 ； (4)氨基酸 203-208 ； (5)氨基酸 216-224 ； (6)氨基酸 233-237 ； (7)氨基酸 247-251 ;和(8)氨基酸 262-263。MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ通過比對SEQ ID NO: I與任何其它NMB1870序列，技術(shù)人員能鑒定出該序列中環(huán)(1)-(8)的位置。然而，為便于引用，本文將環(huán)的坐標定義為NMB1870序列中一個或多個氨基酸的串，在采用兩兩比對算法與SEQ ID NO: I比對時，所述氨基酸串始于和以上SEQ IDNO: I中所鑒定環(huán)的第一個氨基酸殘基比對的氨基酸，終于以上SEQ ID N0:1中所鑒定環(huán)的 最后一個氨基酸。用一個家族的環(huán)序列取代入另一家族該環(huán)位置能產(chǎn)生具有多家族抗原性的嵌合型 NMB1870。因此，本發(fā)明提供含有NMB1870第一家族的氨基酸序列修飾的多肽，其中所述修飾的序列包含NMB1870第二家族的至少I個(例如，1、2、3、4、5、6或7個)表面環(huán)序列替代
了第一家族的表面環(huán)序列。本發(fā)明還提供包含分成九部分的骨架序列的多肽，骨架序列中具有插入的八個環(huán)(骨架序列的各連續(xù)部分之間有一個)，其中至少一個所述環(huán)序列取自不同于該骨架序列的NMB1870家族的NMB1870序列。優(yōu)選利用一個以上不同NMB1870序列的表面環(huán)，可將這些環(huán)插入一條骨架序列中，因此，本發(fā)明提供含有以下氨基酸序列的多肽-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-其中(a) 所述B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和B9各自是⑴SEQ ID Ν0:Μ 的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少111%序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少d個連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；(b)所述L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8各自是⑴SEQ ID NO: USEQID N0:2 和/ 或SEQ ID NO: 3的片段；或(ii)與⑴所述片段有至少11%序列相同性和/或包含⑴所述片段的至少e個連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列，前提是，所述L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8中至少一個不是SEQ IDN0:M的片段。本發(fā)明還提供所述多肽的片段，只要所述片段包含ι^α2α3α4α5α6α7和/或L8中的至少一個，和B2, B3> B4, B5, B6, B7, B8和B9中兩個或多個的至少一個氨基酸。因此，在一些實施方式中，最小的片段包含一個環(huán)，與該環(huán)N末端相連的一個氨基酸和與該環(huán)C末端相連的一個氨基酸。M 值選自 I、2 或 3，B1' B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8 和 B9 以及 L1' L2、L3、L4、L5、L6、L7 和 L8的定義取決于M值而不同?！?(i) SEQ ID NO:M的片段”的意義如下所示
權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽含有的氨基酸序列與SEQ ID N0:57有至少70%相同，其中一個或多個以下殘基被另一氨基酸取代或刪除F14 ；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T56 ；A67 ；G68 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；N83 ；K85 ；D97 ；D102 ；P105 ；G107 ；R109 ；S114 ；S116 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；K135 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ;H153。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，至少一個以下殘基被取代或刪除F14；T16 ；Q18 ；Q20 ；D21 ；S22 ；E23 ；H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150:I151 ；R152 ；H153o
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，E51被刪除。
4.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，至少一個以下殘基被取代F14；T16 ；Q18 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；T56 ；K70 ；T72 ；A78 ；A79 ；K85 ；D97 ；D102 ；S1 14 ；S116 ；L118 ；K135。
5.如權(quán)利要求2或4所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自以下的取代F14L；T16I ；Q18K；Q20N ；D21N ；S22P ；E23D ；H24K ；S25I ；S25T；G26D；K27S ；K31Q ；Q33S ；R35L ；I36V；G37S；I39L ；K48Q ；G52D ；R54K ；T56E ；A67P ；G68N ；K70R ；T72H ；A78T ；A79K ；N83H ；N83Y ；K85R ；D97E ；D102E ；P105A ；G107E ；R109S ；S114L ；S116D ；L118R ；N120G ；Q121S ；A122E ；K135R ；T147I ；V148G ；N149E ；G150K ；I151V ；R152H ;H153E。
6.如以上權(quán)利要求中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO: 57有至少80%相同。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO: 57有至少90%相同。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59 或 SEQ ID NO:60。
9.一種多肽，其包含修飾的NMB1870第一家族的氨基酸序列，其中所述修飾的氨基酸序列包含NMB1870第二家族的至少一個(例如，1、2、3、4、5、6或7個)表面環(huán)序列而取代了第一家族的表面環(huán)序列。
10.一種多肽，其包含以下氨基酸序列-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9- 此序列中 (a)所述Bl、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和B9各自是(i)SEQ IDNO:M 的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少75%序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少10個毗連氨基酸的片段的氨基酸序列；和 (b)所述LI、L2、L3、L4、L5、L6、L7 和 L8 各自是(i)SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2 和 /或SEQ ID N0:3的片段；或(ii)與⑴所述片段有至少75%序列相同性和/或包含⑴所述片段的至少10個毗連氨基酸的片段的氨基酸序列， 前提是所述LI、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8中至少一個不是SEQID Ν0:Μ的片段， 其中 M 是 1、2 或 3，而 B 1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8根據(jù)M選自以下
11.權(quán)利要求10所述多肽的片段，前提是該片段包含LI、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或L8中的至少一個和B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和/或B9中兩個或多個的至少一個氨基酸。
12.—種多肽，所述多肽包含權(quán)利要求10或11所述的以下嵌合氨基酸序列 -B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-, 所述多肽還包含與所述嵌合序列的N-末端或C-末端相連的NMB1870序列，其中所述NMB1870 序列與 SEQ ID Ν0:Μ 為同一 NMB1870 家族。
13.—種如下式所示的雜交多肽-A-[X-L-Jn-B- 式中X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N末端氨基酸序列，B是任選的C末端氨基酸序列，η是2或更高，其中至少一個-X-部分是ΝΜΒ1870 序列。
14.如權(quán)利要求13所述的雜交多肽，其特征在于，所述雜交多肽包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID Ν0:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40。
15.如權(quán)利要求13所述的雜交多肽，其特征在于，所述至少一個-X-部分與SEQIDNO: 95有至少90%序列相同性。
16.一種多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID N0:46、47、48、49、50、51、·52、53、54、55、56、86、87、88、89、90、91、92、93 和 94。
全文摘要
NMB1870是腦膜炎奈瑟球菌的一種蛋白質(zhì)。已知NMB1870有三個家族。為增強NMB1870蛋白質(zhì)引發(fā)在家族之間有交叉反應(yīng)性的抗體的能力，工程改造了NMB1870?？捎靡粋€NMB1870家族的序列取代另一家族的相應(yīng)位置。不同家族的NMB1870蛋白質(zhì)序列可彼此相連。
文檔編號C07K14/22GK102816217SQ201210223578
公開日2012年12月12日 申請日期2006年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者V·馬西格納尼, M·斯卡塞利, R·拉普奧里, M·皮扎, M·朱利亞尼 申請人:諾華疫苗和診斷有限公司