一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原，相應(yīng)的人工抗原和單克隆抗體，同時(shí)本發(fā)明也公開了所述三甲氧芐氨嘧啶半抗原，相應(yīng)的人工抗原和單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCC?NO.6065的細(xì)胞株D-3-2分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明提供的三甲氧芐氨嘧啶半抗原與載體蛋白連接可以得到三甲氧芐氨嘧啶抗原。本發(fā)明的三甲氧芐氨嘧啶人工抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物可產(chǎn)生針對(duì)三甲氧芐氨嘧啶的特異性抗體，可用于制備檢測(cè)食品中三甲氧芐氨嘧啶殘留的膠體金試紙條，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原、抗原、單克隆抗體制備方法，并應(yīng)用于對(duì)牛奶中三甲氧芐氨嘧啶的快速測(cè)定。
【背景技術(shù)】
[0002]三甲氧芐氨嘧啶:別名磺胺增效劑，抗菌增效劑，甲氧芐胺嘧啶，三甲氧芐二氨嘧唳，英文名Trimethoprim(Synaprim, TMP)。化學(xué)名稱為5_[ (3,4, 5-三甲氧基苯基)-甲基]-2,4- U密P定二胺[5-(3, 4, 5-trimetoxybenzene)methy-2, 4-pyrimidine diamine]，屬于二氨嘧啶類(亦即芐氨嘧啶類)化合物。
[0003]本品由Hitclings *G.Η等于1959年合成，國(guó)內(nèi)于1972年開始生產(chǎn)，主要由關(guān)鍵中間體3，4，5-三甲氧基苯甲醛(TMB)經(jīng)縮合、環(huán)合反應(yīng)而得，目前國(guó)內(nèi)已有許多藥廠生產(chǎn)?；前吩鲂榘咨蝾惏咨Y(jié)晶性粉末，無(wú)臭、味苦。在氯仿中略溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中幾乎不溶，在冰醋酸中易溶。本品的熔點(diǎn)為199~203°C。磺胺增效劑屬抑菌劑，親脂性弱堿，臨床上其注射劑為微黃色或者無(wú)色。
[0004]它是一種抗菌增效劑，磺胺類藥物單獨(dú)使用，會(huì)使細(xì)菌很易產(chǎn)生耐藥性，與磺胺類藥物組成復(fù)方制劑，可使細(xì)菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，使抗菌譜擴(kuò)大、抗菌活性增強(qiáng)，從抑菌作用變?yōu)闅⒕饔?，?duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌有效，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛。用于治療尿路感染、呼吸道感染、菌莉和腸炎等一般用作磺胺類藥物的增效劑，廣泛用于各類磺胺制劑中，最近的研究表明，磺胺增效劑對(duì)青霉素類、氨基糖苷類等其它抗生素和合成抗生素均有一定的增效作用 ，故又稱為廣譜抗菌增效劑。因其水溶性差，現(xiàn)一般僅與磺胺類藥聯(lián)用作為口服制劑應(yīng)用于臨床，也因而大大限制了其在臨床的應(yīng)用范圍和其它給藥途徑。
[0005]磺胺增效劑可發(fā)生瘙癢、皮疹，臨床也有發(fā)現(xiàn)服用頭孢羥氨芐/TMP致過(guò)敏性休克的報(bào)道，也有發(fā)生惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)?；前吩鲂?duì)小白鼠的半數(shù)致死量(LD5tl)為2500毫克/千克體重。大劑量使用時(shí),可影響葉酸代謝和作用,可致白細(xì)胞減少和血小板減少，故長(zhǎng)期使用時(shí)必須注意。
[0006]為了保護(hù)人類健康，各國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中甲氧芐氨嘧啶殘留量的檢測(cè)很重視，均制定了嚴(yán)格的限量要求。例如:歐盟、香港政府規(guī)定牛、豬和家禽組織中殘留限量為0.05mg/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》(NY 5070-2002)中規(guī)定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4種藥物按總量計(jì)最大殘留限量為100 μ g/kg，甲氧芐啶最大殘留限量為50 μ g/kg。
[0007]目前磺胺類及其增效劑殘留的測(cè)定方法有高效液相色譜法配合紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器，但大多采用國(guó)外產(chǎn)的凈化小柱處理樣品，增加了測(cè)定成本。目前尚無(wú)關(guān)于磺胺類藥物增效劑的系統(tǒng)檢測(cè)方法，該方法的建立為監(jiān)控動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留提供了技術(shù)支持。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原、抗原制備方法及其應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供的三甲氧芐氨嘧啶半抗原，是式(I)所示化合物:
【權(quán)利要求】
1.一種三甲氧芐氨嘧啶半抗原，為式(I)所示化合物:
2.式(I)所示化合物的制備方法，包括如下步驟: 取0.58 g三甲氧芐氨嘧啶、0.40 g馬來(lái)酸酐和I mL吡啶溶解于10 mL DMSO中，在40°C下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，蒸除溶劑，柱層析后在乙醇-水體系中重結(jié)晶得到三甲氧芐氨嘧啶單馬來(lái)酸酰胺，即為式(I)所示化合物。
3.—種三甲氧芐氨嘧啶抗原，是將式(I)所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
4.權(quán)利要求3所述三甲氧芐氨嘧啶抗原的制備方法，包括如下步驟: (1)取8.5mg三甲氧芐氨嘧啶半抗原，溶解于ImL DMF中； (2)取15mgEDC用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ； (3)稱取載體蛋白3(T40mg，使之充分溶解在2.8mL pH為7.2的PBS中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h ； (4)用0.01mol/L的PBS在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)； (5)分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.權(quán)利要求3所述三甲氧芐氨嘧啶抗原在制備三甲氧芐氨嘧啶特異性抗體中的應(yīng)用。
6.應(yīng)用權(quán)利要求3所述三甲氧芐氨嘧啶抗原制備得到的特異性抗體。
7.權(quán)利要求1所述化合物、權(quán)利要求3所述三甲氧芐氨嘧啶抗原、權(quán)利要求6所述抗體在檢測(cè)三甲氧芐氨嘧啶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07D239/49GK103524427SQ201210229356
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】馮才偉, 萬(wàn)宇平, 何方洋, 付軍權(quán), 崔海峰, 白莉, 馮靜, 吳小勝 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司