專利名稱：一種改進(jìn)細(xì)胞色素p450酶家族體外表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞色素P450酶，特別涉及一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450 (CYP450)酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶，是I相反應(yīng)中活性最強的代謝酶，可參與許多前致癌物和前毒素的代謝活化，生成親電性很強
的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，引發(fā)一系列的毒性效應(yīng)?，F(xiàn)有研究CYP450酶代謝活化外源化合物的途徑主要分體內(nèi)和體外代謝兩種。體內(nèi)代謝研究以動物模型為代表，但不同種屬的動物與人之間存在較大的差異，尤其是在代謝方面，參與化合物代謝的酶種類、酶的貢獻(xiàn)程度、反應(yīng)類型以及代謝產(chǎn)物等均可能不相同，把動物實驗結(jié)果外推到人體誤差高且準(zhǔn)確性低。此夕卜，CYP酶的代謝底物非常廣泛，每個CYP酶都有其特異的代謝譜，開展單種代謝酶對毒物的代謝特征研究就需要得到單一組分的CYP酶，動物體內(nèi)代謝中參與化合物代謝的酶種類繁多，難以達(dá)到目的。隨著對CYP酶的深入認(rèn)識，人們開始通過各種方法得到單一的純酶，構(gòu)建各種體外代謝系統(tǒng)，對外源化合物的體外代謝進(jìn)行研究。最初，人們通過純化哺乳動物肝或腎中的CYPs得到單一的純酶再進(jìn)行研究，但CYPs家族中的各種代謝酶的性質(zhì)非常接近，很難得到純酶，或者產(chǎn)量很低。到了 20世紀(jì)90年代，隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)的飛速發(fā)展，通過在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到純CYPs酶已成為得到單一純酶并進(jìn)而開展化學(xué)物體外代謝的主要方法手段。到目前為止，幾個常用的表達(dá)體系，如細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等系統(tǒng)都已被用于CYP450S的表達(dá)。其中桿狀病毒昆蟲細(xì)胞(Baculovirus/Sf9)表達(dá)系統(tǒng)可高效表達(dá)外源基因，且昆蟲細(xì)胞的蛋白加工和修飾方式與哺乳動物細(xì)胞相似，可實現(xiàn)較為正確的蛋白糖基化、分泌和組織定位表達(dá)，且蛋白表達(dá)量高，可以高水平表達(dá)多種原始的CYP450蛋白。但CYP450蛋白的異源表達(dá)除了需要有完整的細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、正確的蛋白糖基化、分泌和組織定位表達(dá)外，還需要有血紅素等輔助因子的參與，同時CYP450酶活性的發(fā)揮還需要細(xì)胞色素P450氧化還原酶(P0R)、NADPH等輔酶為其提供電子，所以如何在各種異源表達(dá)系統(tǒng)中得到高量、有酶活性的CYP450蛋白成為了化合物體外代謝的關(guān)鍵點和難點。如前所述，CYP450S酶類需要在血紅素鐵上加入兩個電子(即被還原后)才能行使其活性，這種電子一般由與CYP450短暫結(jié)合的蛋白作為電子供體，從輔基中傳遞而提供。哺乳動物CYP450S作為膜結(jié)合蛋白質(zhì)，有些位于線粒體內(nèi)膜，有些位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，共有兩條不同的電子傳遞鏈，CYP450S的位置不同電子傳遞鏈也不同，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中為CYP450提供電子的蛋白是POR蛋白。人的POR蛋白是一種膜結(jié)合的黃素蛋白，它由相同比例的FMN和FAD黃素蛋白組成，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，是一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的加氧酶蛋白的電子供體蛋白，它可以從NADPH為CYP450s提供電子。為系統(tǒng)研究CYP450對化合物的代謝活化作用，提高體外代謝反應(yīng)效率，因此研究CYP450和POR非常有必要。但采用經(jīng)典方法制備CYP450和POR的時，發(fā)現(xiàn)其得率很低，難以滿足研究需求。本發(fā)明提供一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法，使得CYP450和POR能高效表達(dá)且活性較高。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于本發(fā)明提供一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法，使得CYP450和POR能高效表達(dá)且活性較高。技術(shù)方案
一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法，其特征在于在步驟4所述的有關(guān)輔助因子的 4 種條件之一① O. 5-6 μ g/ml Hemin ；(2) O. 05-0. 6mM 5-ALA ； O. 01-0. 4mM Fe3+ ；@0. 05-0. 6mM -ALA 和 0.01_0.4mM Fe3+混合物。最優(yōu)化的條件為 0. 2 mM 5-ALA 與 0.02mMFe3+混合物。具體制備方法如下(以CYP2A13和POR為例)
I、重組轉(zhuǎn)移載體PFastBac 1-CYPs/POR質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
pFastBacl-CYP2A13為本實驗室保存。雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. I (+) /POR和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBac I，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。用T4 DNA連接酶連接回收的POR基因與載體pFastBac I片段，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacl-POR。經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 DNA。使用雙酶切消化驗證 pFastBacl-CYP2A13 和 pFastBac 1-P0R。2、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA的構(gòu)建與鑒定
將已構(gòu)建好的pFastBacΙ-CYPs/POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各CYPs/POR的基因片段插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍(lán)白斑篩選，得到重組 Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用 PCR 反應(yīng)進(jìn)行驗證。3、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR的獲得
在6孔板接種9X IO5個細(xì)胞/孔，27°C貼壁lh。現(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素100IU/ml ;鏈霉素100 μ g/ml),27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目的基因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細(xì)胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)溆没蚋腥維f9細(xì)胞以得到更高效價的病毒液。4、重組CYP450s/P0R蛋白的表達(dá)
使用重組病毒液感染Sf9細(xì)胞，加入不同條件的輔助因子，以表達(dá)有活性的CYP450蛋白。感染后72小時收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，然后差速離心分離出細(xì)胞中的微粒體蛋白，分裝后-80°C保存?zhèn)溆?。以空載體病毒感染細(xì)胞表達(dá)的蛋白做陰性對照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以免疫印跡法檢測CYP2A13和POR蛋白的表達(dá)，使用掃描儀掃描Immunoblotting條帶，用Image J I. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。
5、CO-差示光譜法檢測CYP450蛋白活性
采用CO差示光譜法檢測CYP450蛋白酶活性微粒體懸液用微粒體蛋白稀釋緩沖液稀釋至lmg/ml，取Iml加入到Icm光徑的比色皿中，然后加入適量的保險粉，用封口膜封口混勻后測定blank，緩慢通入CO 2分鐘，混勻使CO與微粒體充分接觸，然后在紫外分光光度計的wavelength scan模式下掃描400nm至550nm處的吸收光譜,再依據(jù)相關(guān)公式計算微粒體蛋白中CYP450蛋白的含量。6、細(xì)胞色素C分析法檢測POR蛋白活力
在Icm光徑的比色皿中加入O. 84ml的還原酶分析緩沖液，然后加入O. Iml O. 8 mM細(xì)胞色素C,再加入20μ1稀釋適當(dāng)倍數(shù)的微粒體懸液,混勻后測定blank,然后加入50μ1 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度計的kinetic/time模式檢測3分鐘內(nèi)550nm處的吸光值變化，再依據(jù)公式計算還原酶活力。
有益效果
1，首次對CYP蛋白、POR蛋白及其共表達(dá)的條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時給予
O.02mM Fe3+和0.2mM 5-ALA處理細(xì)胞，上述蛋白表達(dá)水平及其活性最高。CYP的MOI為5pfu/細(xì)胞、POR的MOI為2 pfu/細(xì)胞時，兩者的共表達(dá)效率最高。2，該條件的優(yōu)化和建立，為體外高效表達(dá)外源代謝酶并開展藥物和毒物的體外代謝研究提供了重要的平臺。該條件具有一定的普適性，可適用于多種體外活性蛋白的表達(dá)。一經(jīng)推廣，將產(chǎn)生良好的社會效益和可觀的經(jīng)濟(jì)效益。


圖I.不同條件輔助因子對CYP2A13表達(dá)的影響,其中A為Immunoblotting檢測加入不同濃度的Hemin后CYP2A13蛋白表達(dá)差異，B為A圖經(jīng)過Image J I. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析后的結(jié)果；C為Immunoblotting檢測加入不同濃度的5-ALA后CYP2A13蛋白表達(dá)差異，D為C圖經(jīng)過Image J I. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析后的結(jié)果；E為Immunoblotting檢測加入不同濃度的Fe3+后CYP2A13蛋白表達(dá)差異，F(xiàn)為E圖經(jīng)過ImageJ I. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析后的結(jié)果-’G為Immunoblotting檢測加入不同條件的輔助因子后CYP2A13蛋白表達(dá)差異，H為G圖經(jīng)過Image J I. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析后的結(jié)果。圖2.不同條件輔助因子對CYP2A13活性的影響，其中A為加入不同條件的輔助因子后所表達(dá)的CYP2A13的特征吸收峰圖；B為使用Sata 7. O軟件對CYP2A13蛋白活性進(jìn)行的統(tǒng)計分析圖。圖3.不同條件輔助因子對POR活性的影響，其中A為加入不同濃度5-ALA后POR蛋白的活性為加入不同濃度的Fe3+后POR蛋白的活性；C為加入不同濃度的Hemin后POR蛋白的活性；D為加入不同種類的輔助因子后POR蛋白的活性差異。圖4.不同病毒效價比例對CYP2A13與POR共表達(dá)的影響，其中A為加入不同Ac-Bacmid-CYP2A13病毒效價(MOI，pfu/cell)后CYP2A13蛋白的表達(dá)；B為加入不同Ac-Bacmid-POR病毒效價(Μ0Ι，pfu/cell)后POR蛋白的表達(dá)；C為加入不同效價比例的Ac-Bacmid-CYP2A13和Ac-Bacmid-POR病毒后CYP2A13蛋白的表達(dá)；D為加入不同效價比例的Ac-Bacmid-CYP2A13和Ac-Bacmid-POR病毒后POR蛋白的活性變化。
具體實施例方式實施例I
I、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-CYP2A13質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
pFastBacl-CYP2A13為本實驗室保存。經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA。使用雙酶切消化驗證pFastBac1-CYP2A13 ο2、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYP2A13 DNA的構(gòu)建與鑒定
將已構(gòu)建好的pFastBacl-CYP 2A13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在 DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各CYP2A13的基因片段插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍(lán)白斑篩選，得到重組 Ac-Bacmid-CYP2A13 DNA，用 PCR 反應(yīng)進(jìn)行驗證。3、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13的獲得
在6孔板接種9 X IO5個細(xì)胞/孔，27°C貼壁lh?，F(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素IOOu/ml ;鏈霉素100 μ g/ml), 27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目的基因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細(xì)胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)溆没蚋腥維f9細(xì)胞以得到更高效價的病毒液。4、重組CYP 2A13蛋白的表達(dá)
使用重組病毒液感染Sf9細(xì)胞，加入不同條件的輔助因子，以表達(dá)有活性的CYP2A13蛋白。感染后72小時收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，然后差速離心分離出細(xì)胞中的微粒體蛋白，分裝后-80°C保存?zhèn)溆?。以空載體病毒感染細(xì)胞表達(dá)的蛋白做陰性對照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以免疫印跡法檢測CYP2A13蛋白的表達(dá),使用掃描儀掃描Immunoblotting條帶,用Image JI. 43軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。其中步驟4中輔助因子為O. 5-6 μ g/ml Hemin。實施例2
與實施例I相比除了步驟4中輔助因子為O. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。實施例3
與實施例I相比除了步驟4中輔助因子為O. 01-0. 4mM Fe3+不同外，其他皆相同。實施例4
與實施例I相比除了步驟4中輔助因子為O. 05-0. 6mM -ALA和O. 01-0. 4mM Fe3+混合物不同外，其他皆相同。實施例5
將實施例1-4所生成的重組CYP 2A13蛋白，利用CO-差示光譜法檢測CYP2A13蛋白活
性
采用CO差示光譜法檢測CYP2A13蛋白酶活性微粒體懸液用微粒體蛋白稀釋緩沖液稀釋至lmg/ml，取Iml加入到Icm光徑的比色皿中，然后加入適量的保險粉，用封口膜封口混勻后測定blank，緩慢通入CO 2分鐘，混勻使CO與微粒體充分接觸，然后在紫外分光光度計的wavelength scan模式下掃描400nm至550nm處的吸收光譜,再依據(jù)相關(guān)公式計算微粒體蛋白中CYP450蛋白的含量。結(jié)果CYP2A13體外表達(dá)及活性的條件優(yōu)化
為了增強昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)CYP450S的實用性，我們在進(jìn)行CYP2A13蛋白的表達(dá)時加入了 Hemin、5-ALA和/或Fe3+，觀察不同條件輔助因子對蛋白表達(dá)水平和活性的影響。圖I所示，CYP2A13蛋白在45kD左右有條帶，說明蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中成功表達(dá)(A，C，E，G)。經(jīng)灰度值掃描分析，在加入 I μ g/ml Hemin, O. 2mM 5-ALA 或 O. 02 mM Fe3+時，CYP2A13蛋白表達(dá)量比其他濃度各輔助因子高(B，D，F(xiàn))。對于單獨加入O. 2mM 5-ALA或O. 02 mM Fe3+，同時加入 O. 2mM 5-ALA 和 O. 02mM Fe3+ 時，CYP2A13 蛋白的表達(dá)最高(圖 H)。此外，研究了不同輔助因子對CYP2A13活性的影響。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，同時加入O. 2mM 5-ALA和O. 02mM Fe3+時，CYP2A13蛋白的活性也明顯高于其他單獨給予的輔助因子(圖 2)。實施例6
I、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac I- POR質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. I (+)/POR和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBac I，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。用T4 DNA連接酶連接回收的POR基因與載體pFastBac I片段，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacl-POR。經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA。使用雙酶切消化驗證pFastBac 1-P0R。2、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid- POR DNA的構(gòu)建與鑒定
將已構(gòu)建好的pFastBacl- POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各POR的基因片段插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍(lán)白斑篩選，得到重組Ac-Bacmid- POR DNA，用PCR反應(yīng)進(jìn)行驗證。3、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid- POR的獲得
在6孔板接種9 X IO5個細(xì)胞/孔，27°C貼壁lh?，F(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液(含青霉素IOOu/ml ;鏈霉素100 μ g/ml), 27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止。收取含有目的基因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細(xì)胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)溆没蚋腥維f9細(xì)胞以得到更高效價的病毒液。4、重組POR蛋白的表達(dá)
使用重組病毒液感染Sf9細(xì)胞，加入不同條件的輔助因子，以表達(dá)有活性的POR蛋白。感染后72小時收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，然后差速離心分離出細(xì)胞中的微粒體蛋白，分裝后-80°C保存?zhèn)溆?。其中步驟4中輔助因子為O. 5-6 μ g/ml Hemin。實施例7
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為O. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。實施例8
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為0.01-0. 4mM Fe3+不同外，其他皆相同。
實施例9
與實施例6相比除了步驟4中輔助因子為O. 05-0. 6mM -ALA和O. 01-0. 4mM Fe3+混合物不同外，其他皆相同。實施例10
將實施例6-9所生成的重組POR蛋白，利用細(xì)胞色素C分析法檢測POR蛋白活力在Icm光徑的比色皿中加入O. 84ml的還原酶分析緩沖液，然后加入O. Iml O. 8 mM細(xì)胞色素C,再加入20μ1稀釋適當(dāng)倍數(shù)的微粒體懸液,混勻后測定blank,然后加入50μ1 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度計的kinetic/time模式檢測3分鐘內(nèi)550nm處的吸光值變化，再依據(jù)公式計算還原酶活力。結(jié)果POR蛋白表達(dá)及活性的條件優(yōu)化 比較了不同濃度的Hemin、5-ALA、Fe3+對POR表達(dá)活性的影響，如圖3所示，在加入O. 5 μ g/ml Hemin, O. 2mM 5-ALA或O. 02 mM Fe3+時，POR蛋白表達(dá)活性比其他濃度各輔助因子高(圖3. A，B，C)。相對單獨加入O. 2mM 5-ALA或O. 02 mM Fe3+，同時加入O. 2mM 5-ALA和O. 02mM Fe3+時，POR蛋白的表達(dá)活性最高(圖3. D)。實施例11
將實施例I步驟1-3獲得的重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13，在輔助因子為O. 05-0. 6mM -ALA和O. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，通過加入MOI為1-5 pfu/細(xì)胞，按實施例I步驟4的方法表達(dá)CYP2A13蛋白，并運用免疫印跡法進(jìn)行鑒定。實施例12
將實施例6步驟1-3獲得的重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-POR，在輔助因子為
O.05-0. 6mM -ALA和O. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，通過加入MOI為1-6 pfu/細(xì)胞，按實施例6步驟4的方法表達(dá)POR蛋白，并運用免疫印跡法進(jìn)行鑒定。實施例13
在輔助因子為O. 05-0. 6mM -ALA和O. 01-0. 4mM Fe3+混合物時，將實施例I步驟1_3獲得的重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13和實施例6步驟1_3獲得的重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-POR，按照CYP2A13-M0I和POR-MOI的比例為5/0-5/6進(jìn)行配比，按實施例I步驟4的方法聯(lián)合表達(dá)CYP2A13蛋白和POR蛋白。運用免疫印跡法進(jìn)行鑒定CYP2A13蛋白，運用實施例10的方法測定POR蛋白活力。結(jié)果CYP2A13和POR蛋白共表達(dá)的條件優(yōu)化
在直徑為15cm的平皿中接種3X107/皿的Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同MOI的CYP2A13和POR病毒，加入O. 02mM Fe3+和O. 2mM 5-ALA，27 °C培養(yǎng)，以表達(dá)有活性的CYP450蛋白和POR蛋白。圖4A和B所示，經(jīng)免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)在分子量72 kD和45 kD位置顯示有目的蛋白表達(dá)，當(dāng)CYP2A13 MOI為5pfu/細(xì)胞、POR MOI為2 pfu/細(xì)胞時，CYP2A13和POR蛋白表達(dá)最高。選擇CYP2A13 MOI為5pfu/細(xì)胞，用不同MOI的POR病毒在Sf9細(xì)胞中共表達(dá)CYP2A13和POR蛋白。結(jié)果顯示不同MOI的POR病毒對CYP2A13蛋白表達(dá)未有影響(圖4.C)。雖然POR活性在相同條件下較單獨表達(dá)的要低，但隨著共表達(dá)中POR的MOI的升高出現(xiàn)遞增趨勢，在MOI為6pfu/細(xì)胞時，已基本達(dá)到了較高水平，完全可滿足體外代謝活性分析的要求(圖4. D)。
權(quán)利要求
1.ー種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法，其特征在于具體制備方法如下 A、重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-POR質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定雙酶消化重組質(zhì)粒pcDNA3. I (+) /POR和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBac I，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段；用T4 DNA連接酶連接回收的POR基因與載體pFastBacI片段，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PFastBacl-POR ;經(jīng)氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取菌液DNA，獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA ;使用雙酶切消化驗證pFastBac1-P0R ； B、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-POR DNA的構(gòu)建與鑒定 將已構(gòu)建好的pFastBac I- POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在DHlOBac大腸桿菌的助手質(zhì)粒Helper輔助下經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，將各POR的基因片段插入穿梭載體Bacmid中，經(jīng)卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素三抗篩選和藍(lán)白斑篩選，得到重組Ac-Bacmid- POR DNA，用PCR反應(yīng)進(jìn)行驗證； C、重組真核表達(dá)病毒Ac-Bacmid-POR的獲得 在6孔板接種9 X IO5個細(xì)胞/孔，27 °C貼壁Ih ;現(xiàn)配桿粒DNA與Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培養(yǎng)液，其中所述的Sf-900 II SFM培養(yǎng)液含青霉素100u/ml、鏈霉素100 μ g/ml ;27°C孵育72h或直到看到病毒感染的跡象為止；收取含有目的基因的第一代重組病毒液，再用此病毒液感染Sf9細(xì)胞，收取第二代重組病毒液，可以保存?zhèn)溆没蚋腥維f9細(xì)胞以得到更高效價的病毒液； D、重組POR蛋白的表達(dá) 使用重組病毒液感染Sf9細(xì)胞，加入輔助因子，以表達(dá)有活性的POR蛋白；感染后72小時收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，然后差速離心分離出細(xì)胞中的微粒體蛋白，分裝后_80°C保存?zhèn)溆? 其中步驟D所述的輔助因子為O. 2 mM 5-ALA與O. 02mM Fe3+混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞色素P450酶，特別涉及一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法。一種改進(jìn)細(xì)胞色素P450酶家族體外表達(dá)的方法，其特征在于在步驟D所述的輔助因子為如下任意一種①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次對CYP蛋白、POR蛋白及其共表達(dá)的條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時給予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA處理細(xì)胞，上述蛋白表達(dá)水平及其活性最高。CYP的MOI為5pfu/細(xì)胞、POR的MOI為2pfu/細(xì)胞時，兩者的共表達(dá)效率最高。
文檔編號C07K14/47GK102851316SQ20121024609
公開日2013年1月2日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者王守林, 陸慧媛 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)