一種利用lrk1基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用LRK1基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法；該方法利用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRK1基因轉(zhuǎn)化秈稻愈傷組織，經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)獲得表達(dá)LRK1基因的水稻植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所述的LRK1基因能成功轉(zhuǎn)化水稻與粳稻品種日本晴、秋光等分別雜交，其F1代結(jié)實(shí)率分別大幅度高于對(duì)照，達(dá)到經(jīng)常品種的結(jié)實(shí)率水平。本發(fā)明的水稻LRK1基因及其同源基因轉(zhuǎn)化水稻，使其具有廣親和性，能克服秈粳雜交不育特性。本發(fā)明為水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供了一種低成本、高效益的新方法。
【專利說明】—種利用LRK1基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及提高水稻秈粳雜種育性的方法，尤其是一種利用LRKl基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近來年，水稻亞種間雜種不育性的原因已有眾多報(bào)道，對(duì)其不育性的遺傳機(jī)理也有所探討；研究表明，亞種間雜種不育的原因是多方面的，其中，有的組合中雜種不育是由花粉敗育引起的，另有一些組合中又表現(xiàn)為帶某一特定等位基因的雌配子部分?jǐn)∮?，而更多的組合中是既有雌配 子敗育又有雄配子體敗育。現(xiàn)有技術(shù)中有大量實(shí)驗(yàn)證明，秈、粳雜種的不育性不僅僅由單個(gè)基因控制，而是由多個(gè)不育基因所控制。
[0003]Ikehashi等系統(tǒng)研究了 74種不同生態(tài)型水稻品種種間雜種F1的育性情況，結(jié)果顯示，一些品種無論與秈型品種或是與粳型品種雜交，其F1均能產(chǎn)生很高的育性，從而提出了廣親和(wide-compatibility)品種的概念，隨后鑒定了一些廣親和基因,最典型廣親和基因是克服不育位點(diǎn)S-5相應(yīng)的S5n。研究還顯示，在發(fā)現(xiàn)雌配子敗育位點(diǎn)時(shí)，相應(yīng)位置上都找到了中性的復(fù)等位基因，即廣親和基因；上述廣親和性基因僅僅對(duì)等位的不育位點(diǎn)起作用，對(duì)非等位的不育位點(diǎn)不起作用，或作用但起不到可以替代的作用。有的研究者把雌性不育基因稱為“廣親和基因”，其主要觀點(diǎn)為雜種不育性主要表現(xiàn)為雌配子不育，秈稻和粳稻品種在某個(gè)座位上等位基因分化為相對(duì)的Si和Sj，廣親和品種在該座位為Sn，等位基因在純合時(shí)產(chǎn)生可育性，當(dāng)?shù)任换蚴荢iSj雜合時(shí)產(chǎn)生不育性，而等位基因是SnSi或SnSj時(shí)均可育，因此，廣親和基因概念是相對(duì)于雌配子敗育位點(diǎn)的。
[0004]張桂權(quán)等把雄性不育基因座位稱為“特異親和基因”，其主要觀點(diǎn)為雜種不育性主要表現(xiàn)為花粉不育；在單個(gè)座位上等位基因分化為相對(duì)的Si和Sj，不同材料的Si和Sj具有不同的分化度；雜種的育性取決于雜合座位的數(shù)目和等位基因的分化距離；等位基因在雜合時(shí)可產(chǎn)生不育性而在純合時(shí)又可產(chǎn)生可育性。
[0005]上述“特異親和基因”和“廣親和基因”在解釋雜種不育性遺傳的理論依據(jù)雖不同，但本質(zhì)上最終都屬于多基因座位控制的，都符合單座位孢子體一配子體互作遺傳模式。從細(xì)胞水平上說，導(dǎo)致秈粳雜種不育的原因除了雄配子敗育及雌配子敗育以外，還有花粉在柱頭上萌發(fā)障礙、配子發(fā)育受阻、胚乳發(fā)育受阻或不正常、花藥不開裂、胚胎發(fā)育不良和雌雄異熟等；此外，環(huán)境條件對(duì)其也有很大的影響，上述因素均涉及復(fù)雜的分子遺傳機(jī)理。
[0006]因?yàn)槎i粳雜種不育機(jī)理的復(fù)雜性，目前只成功分離克隆了廣親和性狀基因S5n ;但S5n基因只能解決由不育位點(diǎn)S-5引起的不育性，并不能克服由其他不育位點(diǎn)引起的不育性，因此，還需繼續(xù)挖掘克隆其他的廣親和基因和特異親和基因，只有將多個(gè)雌配子親和基因與雄配子親和基因聚合于同一親本，選育聚合多個(gè)親和基因座位的多個(gè)廣譜親和性親本品種，使上述親本與各種粳稻或秈稻品種雜交均具有親和性，既可消除雄配子體敗育現(xiàn)象，又可消除雌配子敗育現(xiàn)象，進(jìn)一步提高結(jié)實(shí)率及對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性，有助于解決秈粳亞種間雜種不育性問題，真正實(shí)現(xiàn)直接利用秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)。[0007]有報(bào)道披露，以栽培水稻與江西東鄉(xiāng)野生稻雜交與回交構(gòu)建的基因系為材料，通過染色體定位與基因組序列分析分離克隆了來自東鄉(xiāng)野生稻基因組的一組編碼跨膜受體蛋白LRK的基因，共有8個(gè)首尾相連簇集排列的家族成員，分別命名為L(zhǎng)RKl，LRK2，LRK3，LRK4, LRK5, LRK6, LRK7和LRK8。在有些秈稻品種中只含有7個(gè)LRK基因，缺少LRKl基因；粳稻中，LRK2，LRK3和LRK5基因不表達(dá)；秈稻中，缺少LRKl基因，LRK3和LRK5基因不表達(dá)。
[0008]上述基因簇位于水稻2號(hào)染色體的端部，其DNA序列已經(jīng)登錄在國際基因組數(shù)據(jù)庫NCBI，克隆編號(hào)為AY756174和DQ195081。經(jīng)水稻苗期分子檢測(cè)證實(shí)，在粳稻日本晴的8個(gè)LRK基因中，有5個(gè)基因表達(dá)，分別為L(zhǎng)RK1，LRK4，LRK6，LRK7和LRK8。在秈稻9311 (超級(jí)雜交稻親本之一)中，也有5個(gè)LRK基因表達(dá)，分別為L(zhǎng)RK2，LRK4，LRK6，LRK7和LRK8。
[0009]訖今為止，尚未見有利用該組LRK基因提高水稻秈粳雜種育性方面的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種提高水稻秈粳雜種育性的方法，具體涉及一種利用LRKl基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法；所述方法利用LRKl基因及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化水稻品種，用以克服水稻秈粳雜交不育性。本發(fā)明的實(shí)施例中，將LRKl基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化秈稻品種9311，使秈稻9311與粳稻日本晴、秋光等雜交種的育性大幅度提高。
[0011]本發(fā)明所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0012]本發(fā)明中，所述水稻LRKl基因?yàn)榘被嵝蛄腥鏢EQ ID N02的蛋白，還包括具有與水稻LRKl蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式；上述變異形式包括(但并不限于):若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更·佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸；例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；其還包括水稻LRKl蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0013]本發(fā)明中，所述的水稻LRKl基因的核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0014]本發(fā)明中，所述水稻LRKl基因的核苷酸序列包括編碼具有水稻LRKl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列；該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ IDN0.1序列的編碼框32-3181位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列；由于密碼子的簡(jiǎn)并性，因此與SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID N0.2所述的序列；其還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID N0.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或包括與SEQ ID N0.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。
[0015]本發(fā)明提供了利用LRKl基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法，其特征在于，其包括步驟:
[0016](I)將LRKl基因編碼序列插入植物表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體；
[0017](2)誘導(dǎo)處理水稻愈傷組織；
[0018](3)用步驟(1)所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；[0019](4)恢復(fù)培養(yǎng)步驟(3)所得的水稻愈傷組織。
[0020]本發(fā)明方法中，步驟(1)中植物表達(dá)載體可為常規(guī)的水稻表達(dá)載體；構(gòu)建重組序列的方法參考《分子克隆》的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，將LRKl基因編碼序列克隆到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)；
[0021]所述的植物表達(dá)載體可為已經(jīng)市售或者文獻(xiàn)報(bào)道過的植物表達(dá)載體，例如PCAMBIA1304 等。 [0022]本發(fā)明方法中，步驟(3)中采用基因槍微彈轟擊法實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，除此以外，還可參用其他常規(guī)的基因轉(zhuǎn)化方法；
[0023]本發(fā)明方法中，步驟(4)中恢復(fù)培養(yǎng)水稻愈傷組織是先在不含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后再在含有篩選劑的培養(yǎng)基上篩選，并將篩選后的愈傷組織光照培養(yǎng)；所述的篩選劑是潮霉素。
[0024]本發(fā)明方法中，所述步驟(4)中在進(jìn)行篩選時(shí)，可采用篩選劑濃度逐步提高的方法，也可配合光照條件進(jìn)行(例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用下述含有30mg/和50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基、同時(shí)配合暗培養(yǎng)約兩周進(jìn)行篩選)；篩選完成后，所得含有LRKl基因的愈傷組織，可將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，待分化出小植株后，再轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，長(zhǎng)大后移入溫室。
[0025]本發(fā)明的用LRKl基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜交育性的方法，采用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRKl基因轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)獲得表達(dá)LRKl基因的水稻植株；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成功轉(zhuǎn)化的水稻與粳稻品種日本晴、秋光等分別雜交，其F1代結(jié)實(shí)率分別大幅度高于對(duì)照，達(dá)到經(jīng)常品種的結(jié)實(shí)率水平。
[0026]另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)水稻LRKl基因在提高水稻秈粳雜種育性方面的新的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明中，用序列如SEQ ID N02所示的水稻LRKl基因及其同源基因轉(zhuǎn)化水稻，使其具有廣親和性，能克服秈粳雜交不育特性。本發(fā)明為水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供了一種低成本、高效益的新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為含LRKl基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖，其中，LRKl基因插入表達(dá)載體的位置有箭頭標(biāo)示。
[0029]圖2為轉(zhuǎn)LRKl基因9311、對(duì)照9311株型的比較。
[0030]圖3為轉(zhuǎn)LRKl基因9311、對(duì)照9311分別與日本晴雜種F1的育性比較。
[0031]圖4為轉(zhuǎn)LRKl基因9311、對(duì)照9311分別與日本晴雜種F1的結(jié)實(shí)率比較。
[0032]圖5為轉(zhuǎn)LRKl基因9311、對(duì)照9311分別與秋光雜種F1的育性比較。
[0033]圖6為轉(zhuǎn)LRKl基因9311、對(duì)照9311分別與秋光雜種F1的結(jié)實(shí)率比較。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1LRKl基因的功能驗(yàn)證
[0035](I)構(gòu)建LRKl基因表達(dá)載體
[0036]采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將東鄉(xiāng)野生稻LRKl基因插入到pCAMBIA1304載體35S組型啟動(dòng)子下游；含LRKl基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)如圖1所示；
[0037](2) LRKl基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)與結(jié)果
[0038]采用目前國內(nèi)超級(jí)雜交稻的主要親本之一 9311為轉(zhuǎn)基因受體；將9311成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘導(dǎo)愈傷組織；在愈傷組織誘導(dǎo)2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含LRKl基因的純化的pCAMBIA1304質(zhì)粒DNA導(dǎo)入9311愈傷組織細(xì)胞；在添加30ppm潮霉素的MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3-4周篩選抗性細(xì)胞系，然后將篩選的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)長(zhǎng)芽和生根；
[0039](3)轉(zhuǎn)化處理試管苗移載及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測(cè)
[0040]將LRKl基因轉(zhuǎn)化處理的9311試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采用PCR擴(kuò)放技術(shù)進(jìn)行分子檢測(cè)，于2005年秋獲得陽性Ttl代；2005年冬，在海南島加代繁殖，獲得轉(zhuǎn)基因T1代，共計(jì)7個(gè)株系；
[0041](4) LRKl轉(zhuǎn)基因T4代株系與粳稻雜交F1的育性調(diào)查與統(tǒng)計(jì)
[0042]將LRKl轉(zhuǎn)基因T4代株系、對(duì)照9311、日本晴及秋光于2009年種于上海，抽穗期間利用轉(zhuǎn)LRK19311、對(duì)照9311分別與日本晴及秋光雜交，雜交種于2010年夏季分別種于上海和濟(jì)寧，成熟期考查每個(gè)雜交組合的結(jié)實(shí)率；每個(gè)組合調(diào)查10株主莖穗的結(jié)實(shí)率(考種結(jié)果如表1所示):
[0043]表1
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種利用LRKl基因轉(zhuǎn)化提高水稻秈粳雜種育性的方法，其特征在于，利用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRKl基因轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)獲得表達(dá)LRKl基因的水稻植株；其包括步驟: (1)將LRKl基因編碼序列插入植物表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體； (2)誘導(dǎo)處理水稻愈傷組織； (3)用步驟(1)所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織； (4)恢復(fù)培養(yǎng)步驟(3)所得的水稻愈傷組織。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQID N02所示。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所述水稻LRKl基因還包括具有與水稻LRKl蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式；所述變異形式包括1_50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或20個(gè)以內(nèi)的氨基酸；以及水稻LRKl蛋白的活性片段和活性衍生物。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的核苷酸序列如SEQIDNOl所示。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的核苷酸序列還包括編碼具有水稻LRKl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用基因槍微彈轟擊法進(jìn)行重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中恢復(fù)培養(yǎng)水稻愈傷組織的步驟包括:先在不含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后再在含有篩選劑的培養(yǎng)基上篩選，并將篩選后的愈傷組織光照培養(yǎng)。
8.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的篩選劑為潮霉素。
9.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在含有篩選劑的培養(yǎng)基上篩選時(shí)，所述篩選劑濃度逐步提高并配合光照條件，將存活的水稻愈傷組織于分化培養(yǎng)基光照培養(yǎng)，分化出小植株后，轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，直至移入溫室。
10.轉(zhuǎn)水稻LRKl基因在提高水稻秈粳雜種育性中的應(yīng)用，其中，所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103571869SQ201210255823
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月21日
【發(fā)明者】羅小金, 楊金水, 孫凡 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)