專利名稱：心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白b細(xì)胞表位肽及其抗體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，特別涉及心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽，還涉及由該表位肽的制備的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重要疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號殺手。全球每年有1750萬人死于心臟病和其他心血管疾病，約占全球死亡人數(shù)的1/3，預(yù)計到2020年這個數(shù)字將突破2500萬，屆時心血管疾病將成為人類死亡和致殘的首要原因。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是心血管疾病的主要類型,發(fā)病突然，急性期死亡率約為30%。在我國，急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，正成為我國心血管領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問題。因此，AMI的早期診斷和治療監(jiān)測非常重要。尋找AMI的高特異性、高靈敏度的早期診斷標(biāo)志物是臨床亟待解決的熱點(diǎn)問題。對AMI早期正確診斷，以便進(jìn)行及時有效的治療，是改善預(yù)后、降低AMI急性期病死率提高患者生存率的關(guān)鍵。臨床上雖然可以通過患者的臨床表現(xiàn)、心電圖對典型AMI病例進(jìn)行有效診斷及預(yù)后判斷，但是對一些非典型病例仍然需要通過心肌損傷標(biāo)志物的檢測進(jìn)行早期診斷。目前，用于診斷AMI的指標(biāo)主要有肌酸激酶同工酶MB (creatine kinase isoenzymeMB, CK-MB)、心肌肌I丐蛋白 T ( cardiac troponin T, cTnT)、心肌肌I丐蛋白 I ( cardiactroponin I, cTn I)和肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)等,但它們對于早期診斷AMI均不夠理想，主要原因是CK-MB、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T缺乏足夠的敏感性(胸痛后41小時后濃度才上升)。而肌紅蛋白早期敏感性雖高(胸痛后2 3小時濃度上升)，但特異性較差，不能區(qū)分骨骼肌損傷和心肌損傷，也不是一個理想的早期診斷指標(biāo)。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(hearttype fatty acid-binding protein, H-FABP)是存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的小分子可溶性蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為15KD，其作用是與細(xì)胞內(nèi)長鏈脂肪酸結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，進(jìn)入線粒體后參加P氧化，并最終生成ATP，后者是心肌收縮的主要能量來源。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)H-FABP對于AMI的早期診斷更具有特異性和敏感性，有望成為理想的早期診斷AMI的生化指標(biāo)。新近發(fā)現(xiàn)，H-FABP可彌補(bǔ)CK -MB、cTnl和Mb檢測的不足，對于AMI的早期診斷更具有特異性和敏感性，有望成為理想的AMI的早期診斷生化指標(biāo)。主要是由于H-FABP具備以下特點(diǎn)①心肌特異性高大量地存在于心肌組織中，在心肌中比骨骼肌高10倍，在腎臟、肝臟、小腸中水平很低；②敏感性高由于H-FABP的相對分子質(zhì)量小，當(dāng)心肌細(xì)胞缺血時，H-FABP可快速從心肌細(xì)胞釋放，并迅速進(jìn)入到血液中，在心肌損傷發(fā)生20分鐘內(nèi)可被檢測到，3 4小時內(nèi)可檢測到其峰值，20-24小時后回到正常值。而且，H-FABP在AMI發(fā)生3小時內(nèi)的敏感度顯著高于肌紅蛋白(72. 3 % Vs 57. 4 %)。上述特點(diǎn)表明，H-FABP對早期診斷和排除AM I是一個有用的生化標(biāo)志物，是早期檢測心肌損傷的理想指標(biāo)。目前，對于H-FABP的B細(xì)胞表位肽未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽，與載體蛋白交聯(lián)后能夠刺激免疫體統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，制備成雜交瘤細(xì)胞株后能產(chǎn)生單克隆抗體。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽，所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本發(fā)明的目的之二在于提供心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物，技術(shù)方案為
含有權(quán)利要求I所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物，所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物為N端引入半胱氨酸的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽與載體蛋白的交聯(lián)體。優(yōu)選的，所述載體蛋白為血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白或雞卵白蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供由心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物制備的雜交瘤細(xì)胞株，技術(shù)方案為
所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物制備的雜交瘤細(xì)胞株。優(yōu)選的，所述雜交瘤細(xì)胞株的生物保藏號為CCTCC N0:C201269。本發(fā)明的目的之四在于提供雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體，技術(shù)方案為
所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。本發(fā)明的目的之五在于提供單克隆抗體的應(yīng)用，技術(shù)方案為
所述的單克隆抗體在制備檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽，該表位肽的抗原性好，能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，免疫后血清效價達(dá)到1:3200，因此該表位肽可用于制備雜交瘤細(xì)胞株并分泌相應(yīng)的單克隆抗體，單克隆抗體的純度大于96%，純化后的抗體用間接ELISA法檢測效價達(dá)I :256000用間接ELISA法檢測效價達(dá)I :256000，且特異性好，可大批量制備，通過本發(fā)明制備的單克隆抗體和多克隆抗體可用于病人血液心臟型脂肪結(jié)合蛋白的檢測，能夠用于急性心肌梗死的早期診斷，為臨床治療急性心肌梗死提供指導(dǎo)。培養(yǎng)物保藏
本發(fā)明中雜交瘤細(xì)胞株3-Fabp送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNO: C201269，地址位于中國武漢武漢大學(xué)，保存日期為2012年6月6日，保藏的培養(yǎng)物名稱為雜交瘤細(xì)胞株3-Fabp。


圖I為純化后的H-FABP重組蛋白SDS-PAGE電泳分析圖。圖2為H-FABP單克隆抗體的純化色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非、限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆實驗手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)(沈關(guān)心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進(jìn)行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。實施例I、H-FABP重組蛋白的制備
通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增H-FABP基因編碼區(qū)核苷酸序列，克隆入原核表達(dá)載體pET28a，經(jīng)測序鑒定后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)性質(zhì)鑒定后，純化制備的H-FABP重組蛋白，該重組蛋白可用于制備多克隆抗體的免疫原及篩選原，同時可以作為后續(xù)建立H-FABP檢測時的校準(zhǔn)品，具體的 根據(jù)報道的可參考心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart type fatty acid-bindingprotein, H-FABP)的基因序列(Genbank :NM_004102)，其編碼區(qū)的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。翻譯為氨基酸后相應(yīng)的多肽序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼133個氨基酸，具體為
MVDAFLGTffK LVDSKNFDDY MKSLGVGFAT RQVASMTKPT TIIEKNGDIL TLKTHSTFKNTEISFKLGVE FDETTADDRK VKSIVTLDGG KLVHLQKffDG QETTLVRELI DGKLILTLTHGTAVCTRTYE KEA上述氨基酸的中英文對照如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T ;纈氨酸val V ;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸t(yī)yr Y ;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸IysK ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R ;天冬氨酸Asp D
用Trizol Reagent法提取心臟總RNA，然后用ToYoBo FSK-100試劑盒逆轉(zhuǎn)錄制備心臟cDNA。H-FABP基因的核苷酸序列設(shè)計擴(kuò)增編碼區(qū)的上、下游引物，上游引物為 5’ -catgccatggtggacgctttcctgg-3J (SEQ ID NO. 3),下劃線處為 NcoI酶切位點(diǎn)，下游引物為 5’ -ccgctcgagttatcatgcctctttctcataagtgc-3’ (SEQ ID NO. 4),下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列由Invitrogen公司合成。以制備的cDNA為模板,SEQID NO: 3和SEQ ID NO. 4的序列為引物，擴(kuò)增H-FABP基因編碼區(qū)序列，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(普通離心柱型)回收PCR產(chǎn)物。測序結(jié)果與報道的H-FABP基因編碼區(qū)序列一致。對H-FABP基因的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列上無糖基化位點(diǎn)。因此，結(jié)合原核體系大腸桿菌特點(diǎn)，選擇大腸桿菌表達(dá)體系，使用菌株Escherich coli BL21,具有成本低、遺傳背景清楚、周期短等優(yōu)點(diǎn)。選用的基因表達(dá)載體PET28a具有基因表達(dá)載體應(yīng)有的優(yōu)點(diǎn)，且攜帶Kan+基因，易于篩選。利用Nco I和Xho I雙酶切pET28a載體后與經(jīng)同樣酶切的H-FABP基因連接，得pET28a-H-FABP載體，連接反應(yīng)為4°C過夜，然后將pET28a_H_FABP載體轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，并將其涂于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日挑取單個白色菌落擴(kuò)大化培養(yǎng)，將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體用于提取質(zhì)粒，取10 UL質(zhì)粒用Nco I和Xho I雙酶切后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示pET28a-H-FABP重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切切下了約400bp大小的片段，證實pET28a-H-FABP重組載體構(gòu)建成功。將pET28a-H_FABP重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落37°C擴(kuò)大化培養(yǎng)。取100 ii L菌液接種于5mL含50 y g/L卡那霉素LB培養(yǎng)液，37°C搖菌至0D600達(dá)到0. 6 0. 8時，加入IPTG(至終濃度lmmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)6小時。分析表達(dá)情況培養(yǎng)后每克濕菌以10倍體積的PBS緩沖液(pH7. 3)重懸，混勻后超聲破菌，破菌完全后于4°C IOOOOrpm離心15分鐘，上清以0. 45 y m微孔濾膜過濾。分別取少量上清與沉淀SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白可溶性。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲破菌后收集沉淀，沉淀用20mmol/L Tris HCl (pH8. 0)充分重懸，懸液緩慢滴加入約IOOmL包涵體溶解液中，磁力攪拌溶解數(shù)小時(視溶解情況而定)，6000rpm離心20分鐘，取上清，0. 45 u m濾膜過濾。將溶解的包涵體與復(fù)性液按I :1比例混合后，于4°C放置2h后，裝入透析袋，用0.02mol/L Tris HCI溶液pH8. 0，4°C透析過夜，期間需更換液3 4次。采用高效的QSepharose F. F.陰離子層析柱等方法純化重組蛋白，采用BCA法(按碧云天BCA蛋白測定試劑盒說明書操作)測定H-FABP重組蛋白濃度。采用HPLC測定純化后H-FABP重組蛋白的純度。結(jié)果誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖I所示，發(fā)現(xiàn)預(yù)期分子量(14 15kD)附近出現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá)的目的條帶。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)篩選出的高表達(dá)菌株進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)及大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鑒定表達(dá)物破菌后幾乎都存在沉淀中，為包涵體表達(dá)。凝膠自動掃描分析顯示，目的蛋白的表達(dá)量超過了菌體蛋白的30%。將包涵體溶解并復(fù)性處理，復(fù)性后的蛋白溶液用0.45iim濾膜過濾，然后使用Q Sepharose F. F.陰離子層析柱(Amersham XK 16/20)純化重組H-FABP多肽。純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳分析可見在約15kD處出現(xiàn)清晰可見的粗大條帶。純化后用BCA法測得H-FABP重組蛋白濃度為0. 48mg/mL，檢測其純度為95%。Lowry法測定H-FABP重組蛋白含量(Lowry法測定的試劑盒購于上海美季生物技術(shù)有限公司)
試劑A 1) 10克Na2CO3, 2克NaOH和0. 25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6 4H20)。溶解于500毫升蒸餾水中；2) 0. 5克硫酸銅(CuSO4 *5H20)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(A)與I份(B)混合，即為試劑甲。試劑B :在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4 2H20)，25克鑰酸鈉(Na2MoO4 *2H20)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫酸鋰(Li2SO4), 50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至I升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水I倍，使最終的酸濃度為IN左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。詳見表I :
表I、Lowry法測定H-FABP重組蛋白含量權(quán)利要求
1.心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽，其特征在于所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2.含有權(quán)利要求I所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物，其特征在于所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物為N端引入半胱氨酸的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽與載體蛋白的交聯(lián)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物，其特征在于所述載體蛋白為血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白或雞卵白蛋白。
4.權(quán)利要求2所述心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽的衍生物制備的雜交瘤細(xì)胞株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株的生物保藏號為 CCTCC NO C201269o
6.權(quán)利要求5所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。
7.權(quán)利要求6所述的單克隆抗體在制備檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)中的免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白B細(xì)胞表位肽及其單克隆抗體的應(yīng)用，所述表位肽段如SEQIDNO.5所示，其可用于制備雜交瘤細(xì)胞株并分泌相應(yīng)的單克隆抗體；該單克隆抗體可用于制備檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的診斷試劑；本單克隆抗體純度高大于96%，純化的抗體用間接ELISA法檢測效價達(dá)1256000，且特異性好、可大批量制備等優(yōu)點(diǎn)；通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于病人血液心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的檢測，為急性心肌梗死的早期診斷奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K19/00GK102746382SQ201210263140
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者姚靜, 張憲, 石延賓, 胡偉, 魏勇, 黃洪濤 申請人:重慶業(yè)為基生物科技有限公司