專利名稱：細(xì)胞穿膜肽hPP10的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體講，涉及ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的生物分子比如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統(tǒng)藥物不同的是，這些治療分子在體內(nèi)穩(wěn)定性低、需要在胞內(nèi)發(fā)揮功能的分子難以進(jìn)入細(xì)胞，因而會(huì)限制其作為藥物的推廣應(yīng)用。故開發(fā)能有效攜帶這些治療性生物大分子進(jìn)入靶細(xì)胞、經(jīng)濟(jì)、安全的載體系統(tǒng)是亟需解決的問題。近年來，非病毒藥物運(yùn)輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被寄予厚 望。迄今比較常用的生物大分子細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入方式有如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和有機(jī)高分子納米顆粒等可能存在著安全隱患如對(duì)細(xì)胞的毒性作用、胞內(nèi)釋放困難、難于組裝及操作和用于體內(nèi)等這樣那樣的缺點(diǎn)。因此尋找新型的理想的非病毒藥物輸送系統(tǒng)引起了學(xué)者們的廣泛興趣(圖18)。在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在對(duì)ー些病毒感染特性的研究中相繼發(fā)現(xiàn)了ー類蛋白結(jié)構(gòu)域，如HIV-I Tat (48 60)、VP22 (267 300)，以及果蠅蛋白ANTP (43 58)等具有介導(dǎo)異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿和核內(nèi)的功能，這ー類富含陽(yáng)離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細(xì)胞膜穿透妝(cell-penetrating peptides, CPPs)、穿膜妝或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(prote intransduct ion
domains, PTDs)。1988年Green和Frankel等首次發(fā)現(xiàn)TAT-人免疫缺陷病毒(HIV)
的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以穿透細(xì)胞膜/核膜進(jìn)入細(xì)胞漿/細(xì)胞核，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白第48-60位氨基酸殘基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全發(fā)揮其穿膜功能。以后又相繼發(fā)現(xiàn)了多個(gè)源自病毒或其他生物的CPP,如I型單純皰疫病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)蛋白的VP22、果妮同源觸角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapediatranscription protein, ANTP)、こ型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前 S 抗原等。依據(jù)其來源不同可將已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CPP大致分為兩類ー類為如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原來源于病毒的短肽等；另ー類為根據(jù)天然CPPs的特點(diǎn)人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-l、MAP、transportan和各種基于不同信號(hào)序列合成的肽段等。CPPs能在體外或體內(nèi)作為載藥多肽，介導(dǎo)一系列生物活性分子如DNA、SiRNA、多肽、蛋白質(zhì)甚至納米顆粒等進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。這些CPPs因基本無(wú)毒副作用、不干擾所攜帯生物大分子活性，而被廣泛用于體外或/和體內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送生物活性分子，尤其是在抗腫瘤治療的應(yīng)用研究方面更是引人注目。CPPs研究在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用研究上都具有極大意義，作為ー種有效的胞內(nèi)運(yùn)載工具，有著廣泛的應(yīng)用前景(圖19)。然而來源于病毒或其他種屬生物蛋白結(jié)構(gòu)域的CPP，在臨床應(yīng)用上可能仍然存在一定的安全隱患，比如可能的細(xì)胞毒性和免疫原性問題。人們對(duì)TAT作為CPP進(jìn)行了大量研究，腹腔注射Tat-β -半乳糖苷酶，能進(jìn)入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用于臨床研究。另有報(bào)道稱，應(yīng)用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發(fā)了嚴(yán)重的肺部病理反應(yīng)。可見，針對(duì)不同治療需要，開發(fā)更為安全的、新型穿膜肽一一人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。2002年，Beck-Sickinger AG小組開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)人源性穿膜肽ー來源于人降血鈣素(hCT)的第9-32的殘基。隨后相繼報(bào)道的人源性穿膜肽還有來自于hCLOCK蛋白(ー種與生物節(jié)律調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，2004年)、Hph-I ( ー種人源轉(zhuǎn)錄因子，2006年)、Bag_l蛋白(一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質(zhì)激素受體的蛋白，2006年)、pl4ARF蛋白(ー種人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳鐵蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86_101 (2010年)和TCTP蛋白(來源于人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個(gè)氨基酸殘基，2011年)的CPPs。與其他生物來源的CPPs相比，人源性CPPs引起人體的免疫反應(yīng)的可能性比較小，潛在的不安全因素相對(duì)較少。因此，作為臨床應(yīng)用的藥物分子載體有著更廣闊的應(yīng)用前景。2001年，F(xiàn)utaki S等發(fā)現(xiàn)穿膜肽的穿膜能力與多肽序列中精氨酸殘基的數(shù)量有 很大的相關(guān)性。我們?cè)趶氖录?xì)胞穿膜肽研究中，通過對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中ー級(jí)結(jié)構(gòu)的檢索、分析發(fā)現(xiàn)人源性的賴氨酸特異性去甲基化轉(zhuǎn)移酶4A內(nèi)的一段長(zhǎng)為20個(gè)氨基酸的短肽的ー級(jí)結(jié)構(gòu)富含Arg、Lys類堿性氨基酸，分布著很強(qiáng)的正電荷，這與大多數(shù)已知的CPPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)很相似，繼而分析其ニ級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它可形成經(jīng)典的α-螺旋構(gòu)象。推測(cè)這段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我們繼而合成了這段短肽并命名為hPPIO，觀察了其對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的穿膜效率，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞毒性及穿膜機(jī)制，同時(shí)還觀察、評(píng)估了其遞送綠色熒光蛋白(GFP)和質(zhì)粒DNA的效果，為hPPIO作為ー種新型人源性藥物運(yùn)輸載體的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法。一方面，本發(fā)明提供了ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO的生產(chǎn)方法，可以在實(shí)驗(yàn)室水平或エ業(yè)水平進(jìn)行合成，生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成和基因工程表達(dá)法。I.化學(xué)合成方法此種方法是選擇羧基樹脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin),采用固相Fmoc法合成。具體合成步驟如下(I)用Fmoc基團(tuán)對(duì)α -氨基進(jìn)行保護(hù)的賴氨酸通過ー個(gè)支臂連結(jié)到不溶性載體王氏樹脂(Wang resin)上；(2)用TFA(三氟こ酸)溶液洗滌賴氨酸一支臂ー樹脂，使α-氨基脫保護(hù)；(3)將第二個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α -氨基保護(hù)的異亮氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與賴氨酸形成共酯連接上去；(4)用TFA(ニ氟こ酸)溶液洗漆異売氨酸ー支臂ー樹脂，使α _氨基脫保護(hù)；(5)將第三個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α-氨基保護(hù)的脯氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與異亮氨酸形成共酯連接上去；重復(fù)進(jìn)行上述脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到耦合上最后ー個(gè)氨基酸——精氨酸，脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，合成完成；
(6)將切割試劑加入到肽——樹脂中，把肽鏈從樹脂上切割下來，同時(shí)也將各個(gè)氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)從肽鏈上切割下來，加入こ醚，沉淀多肽，獲得多肽粗品；(7)運(yùn)用HPLC/MS進(jìn)行多肽的鑒定和純化，最終得到所需多肽。2.基因工程表達(dá)法，采用原核表達(dá)方法，包括以下步驟(I)設(shè)計(jì)編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，交由上海生エ公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補(bǔ)的雙鏈DNA片段(hPPIO)；(2)利用Ndel/Xhol兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時(shí)，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b (購(gòu)自 Novagen)線性化；
(3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長(zhǎng)波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時(shí)離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置于16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞；運(yùn)用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10，酶切并測(cè)序驗(yàn)證；(7)將驗(yàn)證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌；經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜；(8)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(9)用15ml無(wú)菌離心管裝3. 8ml Amp (+) LB液體培養(yǎng)基，接種O. 2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液(I: 20) ;37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h ；(10)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM，37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(11)在加入IPTG后6h取樣200 μ I菌懸液；(12)離心收集沉淀,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min ;制備菌體全蛋白裂解液樣品；(13)上樣，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況如圖3。所述SDS-PAGE分析所表達(dá)的融合蛋白，在小于14. 4KD處出現(xiàn)一條強(qiáng)表達(dá)帶。確認(rèn)目的肽hPPIO (含6xHis標(biāo)簽)的表達(dá)及純化。(14)確認(rèn)目的肽hPP10_6XHis表達(dá)正確后，大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌，裂解，鎳柱純化，制備hPP10-6xHis。融合肽的純化是利用6XHis標(biāo)簽，通過Ni-NTA親和層析得到有效純化，融合蛋白的純度大于80%。六聚組氨酸(6xHis)標(biāo)簽用于hPPIO的純化，但是并不需要從成品hPPIO上剪切下來，因?yàn)?xHis將有助于細(xì)胞穿膜肽的穿膜，提高穿膜效率。另ー方面，本發(fā)明提供了ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法，包括兩方面的內(nèi)容。I. hPPIO介導(dǎo)紅色熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pDsRed (購(gòu)自Clontech公司)轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為IOiiM證？10加入含5011 I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取0. 8 ii g的質(zhì)粒加入含50 U I Opti-MEM的另外ー個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；
c.將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min ；(4)將上述hPPIO+質(zhì)粒DNA混合溶液均勻地加入到相應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻，以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照；(5)置細(xì)胞于ニ氧化碳培養(yǎng)箱中37°C繼續(xù)溫育4_6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ；(6)倒置突光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，TAT介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，拍照記錄hPPIO介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效果。ECV-304細(xì)胞經(jīng)hPPIO介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed的效果見圖8。由圖8結(jié)果可見，細(xì)胞中有明顯紅色熒光蛋白表達(dá)。證明hPPIO能介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。再一方面，本發(fā)明提供了一種人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為IOiiM hPPIO加入含50ii I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取0. g的質(zhì)粒加入含50 ii I Opti-MEM的另外ー個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5minc.將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min ；(4)將hPPIO+質(zhì)?；旌衔锞鶆虻募尤氲较鄳?yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻。以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照；(5)在5%C02培養(yǎng)箱中，37°C繼續(xù)溫育4_6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ；(6)取200iU培養(yǎng)液上清(含分泌型熒光素酶)置于I. 5ml離心管中，5000rpm離心3min，依分泌型熒光素酶試劑盒使用說明，運(yùn)用熒光微孔測(cè)定儀，檢測(cè)培養(yǎng)上清熒光素酶活性，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)性對(duì)照，TAT和無(wú)意義肽NCO作為穿膜肽陽(yáng)性和陰性對(duì)照，各處理樣品中熒光素酶活性結(jié)果見圖11。圖11可見，hPPIO成功介導(dǎo)了分泌型熒光素酶質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染，細(xì)胞表達(dá)了較高水平的熒光素酶蛋白，且其活性隨著hPPIO濃度的增高而逐步增強(qiáng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，與其他生物來源的CPPs相比，人源性CPPs — hPPIO引起人體的免疫反應(yīng)的可能性比較小，潛在的不安全因素相對(duì)較少。因此，作為臨床應(yīng)用的藥物分子載體有著更廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明新型人源性穿膜肽hPPIO的ニ級(jí)輪狀結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明新型人源性穿膜肽hPPIO的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)中存在的螺旋及疊折分析示意圖。圖3是hPPIO的基因工程表達(dá)及純化圖。M:蛋白分子量標(biāo)志；I pET15b-hPP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌IPTG誘導(dǎo)前裂解液；2 pET15b-hPP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌IPTG誘導(dǎo)后裂解液；3 :純化后的 hPP10_6xHis。圖4是hPP10-FITC穿膜進(jìn)入不同細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況。圖5表示不同濃度hPP10-FITC的穿膜效率。A :ECV_304胞內(nèi)熒光鏡下觀；B :ECV-304胞內(nèi)熒光定量。圖6表示孵育時(shí)間對(duì)hPP10-FITC入胞的影響。A hPP10-FITC短時(shí)間孵育后的熒光定量；B =TAT-FITC短時(shí)間孵育后的熒光定量；C hPP10-FITC長(zhǎng)時(shí)間孵育后的熒光定量；D =TAT-FITC長(zhǎng)時(shí)間孵育后的熒光定量。圖7表示血清對(duì)hPP10-FITC穿膜效率的影響。圖8表示不同細(xì)胞經(jīng)5%DMS0預(yù)處理對(duì)hPP10_FITC穿膜效率的影響。A =DMSO預(yù)處理各種不同類型細(xì)胞后胞內(nèi)熒光分布情況；B DMS0預(yù)處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后的胞內(nèi)熒光定量。圖9表示hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pDsRed轉(zhuǎn)染的效果。圖10表示pcDNA3. I-Gluc重組質(zhì)粒提取和BamH I/Xbal I的雙酶切鑒定。泳道I :pcDNA3. I-Gluc ;泳道 2 pcDNA3. I-Gluc 的 Nco I/BamH I 的雙酶切。圖11表示hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染的效果。圖12表示pET15b-hPP10_GFP重組質(zhì)粒提取和Nde I/BamH I的雙酶切鑒定。泳道I :pET15b-hPP10-GFP ;泳道 2 :pET15b-hPP10_GFP 的 Nde I/BamH I 的雙酶切。圖 13 表示 SDS-PAGE 分析 pET15b-GFP、pET15b_hPP10_GFP 在 Rosetta 中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。泳道3和4分別為純化的GFP和hPP10-GFP融合蛋白；泳道2和5分別為IPTG誘導(dǎo)后GFP和hPP10_GFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌裂解液；
泳道I和6分別為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)GFP和hPP10_GFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌裂解液。圖14表示hPP10-GFP融合蛋白處理L929細(xì)胞株后的穿膜情況。圖15表示MTT檢測(cè)hPP10_FITC處理后對(duì)細(xì)胞活力的影響。圖16表示不同溫度下DMSO預(yù)處理后熒光短肽在胞內(nèi)的含量。圖17表示不同內(nèi)吞抑制劑對(duì)hPPIO穿膜效率影響。A :肝素處理各種不同類型細(xì)胞后胞內(nèi)熒光強(qiáng)度；
B :氯喹預(yù)處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后胞內(nèi)熒光強(qiáng)度；C :氯丙嗪處理不同培養(yǎng)細(xì)胞后的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。圖18是新型治療分子胞內(nèi)遞送策略示意圖。圖19是細(xì)胞穿膜肽(CPP)及其可攜帯入胞的生物藥物的工作原理示意圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的方案做更詳細(xì)的說明。實(shí)施例I、CPPs —級(jí)結(jié)構(gòu)、ニ級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)、鑒定新型人源性CPPs ニ級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用了 emboss的在線分析程序(其分析程序請(qǐng)參見網(wǎng)頁(yè)http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/pepwheel 在線分析多妝的輪狀結(jié)構(gòu)；http: //emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/ 在線分析ニ級(jí)結(jié)構(gòu)的螺旋、疊折等)。hPPIO的輪狀結(jié)構(gòu)示意圖，螺旋、疊折結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖I和圖2所示。首先，人工合成綠色熒光標(biāo)記的hPPIO :FITC-Lys_Ile_Pro_Leu_Pro_Arg_Phe_Lys_Leu_Lys_Cys_Ile_Phe_Cys_Lys_Lys_Arg_Arg-Lys-Arg (hPP10-FITC)和無(wú)綠色熒光標(biāo)記hPPIO Lys_Ile_Pro_Leu_Pro_Arg_Phe_Lys_Leu_Lys_Cys_Ile_Pne_Cys_Lys_Lys_Arg_Arg-Lys-Arg(hPPIO)純化定量、冷凍保存?zhèn)溆?。hPPIO的生產(chǎn)途徑有兩種1)化學(xué)合成；2)基因工程表達(dá)。hPPIO源于自然蛋白，可以在實(shí)驗(yàn)室水平或エ業(yè)水平進(jìn)行合成的方法。I)化學(xué)合成方法是采用固相合成法，即采用TFA(三氟こ酸)可脫除的Boc為a-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類。合成時(shí)將ー個(gè)Boc —氨基酸衍生物共價(jià)交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc，用三こ胺中和游離的氨基末端，然后通過Dcc活化、耦聯(lián)下一個(gè)氨基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合一洗滌一去保護(hù)一中和及洗滌—下ー輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來。經(jīng)過HPLC純化等處理，即得所要的多肽。此種方法是選擇羧基樹脂(Fmoc-Tyr (tBu) -Wang resin),采用固相Fmoc法合成。具體合成步驟如下(I)用Fmoc基團(tuán)對(duì)a -氨基進(jìn)行保護(hù)的賴氨酸通過ー個(gè)支臂連結(jié)到不溶性載體王氏樹脂(Wang resin)上；
(2)用TFA(三氟こ酸)溶液洗滌賴氨酸一支臂ー樹脂，使a-氨基脫保護(hù)；(3)將第二個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的a -氨基保護(hù)的異亮氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與賴氨酸形成共酯連接上去；(4)用TFA(三氟こ酸)溶液洗滌異亮氨酸ー支臂ー樹脂，使a-氨基脫保護(hù)；(5)將第三個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的a -氨基保護(hù)的脯氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與異亮氨酸形成共酯連接上去；重復(fù)進(jìn)行上述脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到耦合上最后ー個(gè)氨基酸——精氨酸，脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，合成完成；(6)將切割試劑加入到肽——樹脂中，把肽鏈從樹脂上切割下來，同時(shí)也將各個(gè)氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)從肽鏈上切割下來，加入こ醚，沉淀多肽，獲得多肽粗品；
(7)運(yùn)用HPLC/MS進(jìn)行多肽的鑒定和純化，最終得到所需多肽。 2)基因工程表達(dá)法我們采用的是原核表達(dá)方法，即將編碼hPPIO的cDNA插入到PET原核表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，起始編碼ATG下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化制備而成。具體包括以下步驟(I)設(shè)計(jì)編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，交由上海生エ公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補(bǔ)的雙鏈DNA片段(hPPIO)；(2)利用Ndel/Xhol兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時(shí)，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b (購(gòu)自 Novagen)線性化；(3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長(zhǎng)波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時(shí)離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置于16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10，酶切并測(cè)序驗(yàn)證；(7)將驗(yàn)證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌；經(jīng)
0.lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜；(8)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(9)用15ml無(wú)菌離心管裝3. 8ml Amp (+)LB液體培養(yǎng)基，接種0. 2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液(I: 20) ;37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h ；(10)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40 ill 0. IM IPTG至終濃度1.0mM，37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(11)在加入IPTG后6h取樣200 U I菌懸液；(12)離心收集沉淀,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min ;制備的菌體全蛋白上樣樣品；
(13)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況如圖3。SDS-PAGE分析所表達(dá)的融合肽，在小于14. 4KD處出現(xiàn)一條強(qiáng)表達(dá)帶。確認(rèn)目的肽hPPIO (含6xHis標(biāo)簽)的表達(dá)及純化。(14)確認(rèn)目的肽hPP10-6xHis表達(dá)正確后，大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌，裂解，鎳柱純化，制備hPP10-6xHis。融合肽的純化是利用6XHis標(biāo)簽，通過Ni-NTA親和層析得到有效純化，融合蛋白的純度大于80%。六聚組氨酸(6xHis)標(biāo)簽用于hPPIO的純化，但是并不需要從成品hPPIO上剪切下來，因?yàn)?xHis將有助于細(xì)胞穿膜肽的穿膜，提高穿膜效率。I. hPPIO具有很強(qiáng)穿膜效能I. IhPPlO-FITC在胞內(nèi)分布均勻，具有顯著穿膜特征取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四種培養(yǎng)細(xì)胞疋(^-304、抱1^、11印62、？03，依1\105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組；至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(80%密度)吋，換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)I小吋； 加入終濃度10 ii M hPP10-FITC,常規(guī)培養(yǎng)I小時(shí)；棄去孵育液，PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光及其胞內(nèi)定位情況。參見圖4，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)hPP10-FITC處理的各種細(xì)胞內(nèi)不見綠色熒光。在經(jīng)hPP10-FITC處理組胞后，可見到明顯的綠色熒光，且這四種不同來源的細(xì)胞均有熒光，提示hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞沒有明顯嗜向性。I. 2hPP 10-FITC穿膜進(jìn)入細(xì)胞具有濃度依賴性ECV-304細(xì)胞在經(jīng)無(wú)血清的RPMI-1640處理Ih后，加入濃度梯度的hPP10_FITC(2. 5uM,5. 0uM,7. 5uMU0. Ou M)孵育Ih后，PBS清洗3次，觀察培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光情況。對(duì)于測(cè)熒光數(shù)值，我們采用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下在不同濃度hPP10-FITC孵育結(jié)束后，PBS清洗3次，按300 iil/孔加入0. IM NaOH，室溫裂解細(xì)胞lOmin，IOOOrpm離心3min。取細(xì)胞裂解液上清50 U I到96孔板于熒光酶標(biāo)儀，于490nm/520nm下測(cè)定熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。在實(shí)驗(yàn)中，采用公認(rèn)的經(jīng)典穿膜肽TAT-FITC作為陽(yáng)性對(duì)照。圖5A顯示，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨hPP10-FITC濃度升高而增強(qiáng)，并且可見胞內(nèi)hPP10-FITC熒光比TAT-FITC強(qiáng)。圖5B直方圖中可見，當(dāng)短肽濃度為5 y M時(shí)，其熒光強(qiáng)度已經(jīng)較高，隨著hPP10-FITC濃度的進(jìn)ー步升高，其熒光值也隨之增強(qiáng)。提示hPP10-FITC穿膜進(jìn)入細(xì)胞具有濃度依賴性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均選用了 5 ii M的hPP10-FITC作為終濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。I. 3hPP10胞內(nèi)持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于TAT使用不同的培養(yǎng)細(xì)胞，C0S7、ECV-304、PC3、HeLa在經(jīng)無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)處理Ih后，加入終濃度為5 ii M的hPP10-FITC分別孵育0. 5h、I. Oh、2. Oh及4. Oh后，PBS清洗3次，依上述方法用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm/520nm處熒光吸光值。隨后延長(zhǎng)孵育時(shí)間至5h、10h、20h及30h后，檢測(cè)ECV-304、PC3和HeLa這三種細(xì)胞的熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3
次取平均值。由圖6A可見，不同的培養(yǎng)細(xì)胞隨著hPP10-FITC孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，其熒光值均有所增強(qiáng)，至4h其熒光值為最高。而圖6B則顯示，TAT-FITC在Ih時(shí)，其熒光強(qiáng)度為最大，隨著孵育時(shí)間的進(jìn)ー步延長(zhǎng)，其熒光值相應(yīng)減弱。為了進(jìn)一步確定hPP10-FITC熒光強(qiáng)度在胞內(nèi)維持時(shí)間，將孵育時(shí)間延長(zhǎng)至30h。圖6C是hPP10-FITC在ECV-304、PC3和HeLa三種細(xì)胞中，5h、10h、20h及30h的熒光強(qiáng)度；而圖6D是TAT-FITC在ECV-304、PC3和HeLa三種細(xì)胞5h、10h、20h及30h胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。結(jié)果提示，hPPlO-FITC在胞內(nèi)可以維持很高的熒光強(qiáng)度至30小時(shí)無(wú)明顯減弱；而TAT-FITC在胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間推移急劇下降，于10小時(shí)時(shí)胞內(nèi)熒光已經(jīng)非常微弱，20小時(shí)時(shí)則檢測(cè)不到熒光。本研究顯示新型人源性穿膜肽hPPIO在胞內(nèi)維持時(shí)間至少可達(dá)30小時(shí)，而TAT在胞內(nèi)僅能維持短短幾小時(shí)時(shí)間，顯著小于hPPIO。I. 4血清降低hPP10-FITC穿膜效率培養(yǎng)細(xì)胞H印G2、ECV-304及B16分別在經(jīng)有血清和無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)Ih后，加入終濃度為5iiM的hPP10-FITC繼續(xù)孵育Ih后，PBS清洗3次，裂解細(xì)胞，取其上清液用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm/520nm波長(zhǎng)處熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。參見圖7，一般情況下血清的存在會(huì)影響細(xì)胞對(duì)短肽的內(nèi)吞攝取。通過熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血清的存在對(duì)短肽穿膜入胞有很大影響。無(wú)血清組hPPIO穿膜效率明顯高于有血 清組(P < 0. 05)。結(jié)果顯示血清的存在影響hPPIO的穿膜效率。I. 5DMS0預(yù)處理促進(jìn)hPPIO穿膜效率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁細(xì)胞HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞THPl及原代培養(yǎng)纖維細(xì)胞，按照I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每種細(xì)胞均分設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組；至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(80%密度)吋，換為無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，再培養(yǎng)I小時(shí)；每孔加入終濃度為5%的DMS0，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)I小吋。加入終濃度為5iiM的hPP10-FITC/TAT-FITC 后，孵育 I 小時(shí)；棄去以上孵育液，PBS洗滌3次；熒光顯微鏡下觀察HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞THPl及原代培養(yǎng)纖維細(xì)胞胞內(nèi)熒光及其胞內(nèi)定位情況，或按300 u I/孔加0. IM NaOH,室溫分別裂解ECV-304，Caski或B16細(xì)胞10分鐘，IOOOrpm離心3分鐘。取細(xì)胞裂解液上清50 U I到96孔板于熒光酶標(biāo)儀，于490nm/520nm下測(cè)定熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。本發(fā)明人前期工作研究發(fā)現(xiàn)DMSO可以明顯增強(qiáng)TAT穿膜效率，在此，我們也觀察了 DMSO對(duì)新型人源性穿膜肽膜hPPIO的穿膜影響。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DMSO對(duì)hPP10-FITC穿膜具有明顯增強(qiáng)效果。與經(jīng)過DMSO預(yù)處理后TAT-FITC穿膜效率相比，DMSO預(yù)處理細(xì)胞后hPP10-FITC穿膜效率與TAT相當(dāng)或略強(qiáng)于TAT-FITC (圖8A)。經(jīng)DMSO預(yù)處理后，hPP10-FITC在胞內(nèi)顯示很強(qiáng)綠色熒光，胞漿和胞核熒光分布均勻，即使是懸浮細(xì)胞和原代細(xì)胞hPP10-FITC也具有理想的穿膜效果。熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5%DMS0預(yù)處理后，hPP10-FITC和TAT-FITC的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度較未經(jīng)DMSO預(yù)處理細(xì)胞強(qiáng)(圖8B)，hPP10-FITC的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于TAT-FITC。提示5%DMS0預(yù)處理細(xì)胞明顯存進(jìn)了 hPPIO和TAT的穿膜效率，DMSO對(duì)CPPs穿膜效率增強(qiáng)作用無(wú)細(xì)胞特異性(圖8)。實(shí)施例2、hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染I. hPPIO介導(dǎo)紅色熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pDsRed (購(gòu)自Clontech公司)轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔；
(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為IOiiM hPPIO加入含50ii I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取0. g的質(zhì)粒加入含50 ii I Opti-MEM的另外ー個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min ；(4)將上述hPPIO+質(zhì)粒DNA混合溶液均勻地加入到相應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻，以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照；(5)置細(xì)胞于ニ氧化碳培養(yǎng)箱中37°C繼續(xù)溫育4_6h后，置換成含小牛血清正常培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ；(6)倒置突光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，TAT介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，拍照記錄hPPIO介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效果。ECV-304細(xì)胞經(jīng)hPPIO介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed的效果見圖9。由圖9結(jié)果可見，細(xì)胞中有明顯紅色熒光蛋白表達(dá)。證明hPPIO能介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。再一方面，本發(fā)明提供了一種人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品a.取終濃度為IOiiM hPPIO加入含50ii I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；b.取0. g的質(zhì)粒加入含50 ii I Opti-MEM的另外ー個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min c 將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min ；(4)將hPPIO+質(zhì)?；旌衔锞鶆虻募尤氲较鄳?yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻。以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照；(5)在5%C02培養(yǎng)箱中，37°C繼續(xù)溫育4_6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ；(6)取200iil培養(yǎng)液上清(含分泌型熒光素酶)置于I. 5ml離心管中，5000rpm離心3min，依分泌型熒光素酶試劑盒使用說明，運(yùn)用熒光微孔測(cè)定儀，檢測(cè)培養(yǎng)上清熒光素酶活性，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)性對(duì)照，TAT和無(wú)意義肽NCO作為穿膜肽陽(yáng)性和陰性對(duì)照，各處理樣品中熒光素酶活性結(jié)果見圖11。圖11可見，hPPIO成功介導(dǎo)了分泌型熒光素酶質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染，細(xì)胞表達(dá)了較高水平的熒光素酶蛋白，且其活性隨著hPPIO濃度的增高而逐步增強(qiáng)。
本研究成功利用hPPIO介導(dǎo)了質(zhì)粒DNA (pDsRed和pcDNA3. I-Gluc)的轉(zhuǎn)染，但是其轉(zhuǎn)染效率與商用試劑Lipofectamin 2000相比顯得較低，仍需我們繼續(xù)優(yōu)化其轉(zhuǎn)染條件，以期提高h(yuǎn)PPIO的轉(zhuǎn)染效率。hPPIO成功介導(dǎo)DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染將為體外和體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染提供強(qiáng)有力工具，可應(yīng)用到科研和基因治療的臨床應(yīng)用。實(shí)施例3、hPP10-GFP融合蛋白的表達(dá)及純化和其穿膜功效的研究基因工程表達(dá)法，采用原核表達(dá)方法，包括以下步驟(I)設(shè)計(jì)編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，交由上海生エ公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補(bǔ)的雙鏈DNA片段(hPPIO);同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)引物以pEGFP(購(gòu)自Clontech公司)為模板，PCR獲得GFP蛋白基因片段，兩側(cè)分別有XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)，純化PCR產(chǎn)物備用；(2)利用BamHI/Ndel兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時(shí)，將表達(dá)質(zhì) 粒pET15b (購(gòu)自Novagen)線性化；(3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長(zhǎng)波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時(shí)離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)、以及GFP基因片段分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置于16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10-GFP，酶切并測(cè)序驗(yàn)證；(7)將驗(yàn)證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b-hPP10_GFP轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌；經(jīng)
0.lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜；(8)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；(9)用15ml無(wú)菌離心管裝3.8ml Amp (+) LB液體培養(yǎng)基，接種0. 2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液(I: 20) ;37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h ；(10)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40 ill 0. IM IPTG至終濃度1.0mM，37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(11)在加入IPTG后6h取樣200 U I菌懸液；(12)離心收集沉淀,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min ;制備菌體全蛋白裂解樣品；(13)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白hPP10_GFP的表達(dá)情況如圖13。確認(rèn)的表達(dá)及純化。陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10_GFP提取質(zhì)粒后，利用Nde I/BamH I雙酶切得到產(chǎn)物理論值為795bp，切出片段與預(yù)期大小一致；之后重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序無(wú)PCR引起的突變。說明原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b-hPP10-GFP構(gòu)建成功(圖12)。同時(shí)構(gòu)建pET15b_GFP原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)GFP蛋白作為陰性對(duì)照；GFP和hPPlO-GFP相對(duì)分子質(zhì)量分別為27KD和30KD，陽(yáng)性克隆在ImM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)后，經(jīng)SDS-PAGE分析所表達(dá)的融合蛋白，在35KD和27KD附近出現(xiàn)一條強(qiáng)表達(dá)帶，符合預(yù)期分子質(zhì)量大小，融合蛋白的純化是利用6XHis標(biāo)簽，通過Ni-NTA親和層析得到有效純化，融合蛋白的純度大于80%。帶有His標(biāo)簽的融合蛋白有助于突破內(nèi)涵體釋放進(jìn)入細(xì)胞漿。融合蛋白穿膜功效的研究(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞L929，按照I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)。每種細(xì)胞均分設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組；(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合吋，換為無(wú)血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)每孔加入終濃度為5%DMS0，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)I小時(shí)；(4)實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5 ii M的融合蛋白hPP10-GFP，對(duì)照組則加入相同濃度的蛋白GFP，37 °C培養(yǎng)箱孵育I小吋； (5)棄去以上清培養(yǎng)液，PBS洗滌三次；(6)置于熒光顯微鏡下觀察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞內(nèi)定位情況。L929細(xì)胞株經(jīng)5%DMS0預(yù)處理Ih后，培養(yǎng)基中加入hPP10_GFP融合蛋白，繼續(xù)孵育Ih后，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出清晰明亮的綠色熒光，胞內(nèi)熒光分布均勻，其熒光強(qiáng)度略微強(qiáng)于TAT-GFP ;單獨(dú)GFP則不能進(jìn)入細(xì)胞；未經(jīng)DMSO預(yù)處理只有融合蛋白hPP10-GFP孵育的對(duì)照組中，胞內(nèi)熒光較弱(圖14)。顯示5%DMS0預(yù)處理細(xì)胞后，hPPIO自身并攜帶大分子(綠色熒光蛋白)高效穿膜進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)均勻分布。提示hPPIO不僅自身可以穿膜進(jìn)入細(xì)胞，也可通過融合蛋白形式攜帯大分子蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞，為將來開發(fā)由hPPIO作為載體向細(xì)胞內(nèi)遞送大分子蛋白藥物提供了基礎(chǔ)。實(shí)施例4、hPPIO對(duì)細(xì)胞活力影響甚微(I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304和H印G2，以IX IO4個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)，每孔100 u 1，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C培養(yǎng)；(2)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)；(3)分別換成 hPPIO 濃度梯度為 1011] 、2011]\1、3011]\1、4011]\1及5011]\1無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；(4)孵育時(shí)間結(jié)束后按每孔100 U I加入PBS洗漆，2minX3次；(5)每孔加入80iU含血清的正常培養(yǎng)液及20iU MTT (母液濃度5mg/ml，即
0.5%MTT)溶液，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)后吸去培養(yǎng)液。以200 U I/孔加入ニ甲基亞砜，振蕩IOmin至結(jié)晶物充分溶解后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm的吸光值A(chǔ)，每組取3個(gè)復(fù)孔的平均值。測(cè)定0D490。重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。(6)細(xì)胞生存率的計(jì)算如下細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值ー對(duì)照孔OD值一空白孔OD值)/ (對(duì)照孔OD值一空白孔OD值)X 100%o為明確hPPIO處理細(xì)胞是否會(huì)影響其活力，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定不同濃度hPPIO處理24h后對(duì)細(xì)胞活力的影響情況。ECV-304和IfepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度hPP10_FITC處理后MTT分析數(shù)據(jù)顯示，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于有效濃度(5 iim)的hPP10-FITC (達(dá)20 y m)長(zhǎng)時(shí)間處理細(xì)胞后細(xì)胞依然保持在75%以上，對(duì)細(xì)胞的活力影響甚微(圖15)。提示我們使用范圍內(nèi)hPP10-FITC并不影響細(xì)胞活力。
實(shí)施例5、hPPIO穿膜機(jī)制5. I低溫輕度抑制hPP10-FITC穿膜使用不同的培養(yǎng)細(xì)胞，如ECV_304、Caski及HeLa在經(jīng)無(wú)血清的RPMI-1640處理Ih后，加入終濃度為5 ii M的hPP10-FITC分別在4°C和37°C兩個(gè)條件下孵育Ih后，PBS清洗3次，依前述方法裂解細(xì)胞取其上清檢測(cè)490nm/520nm波長(zhǎng)處的熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。一般認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)吞途徑是能量依賴的，低溫時(shí)細(xì)胞的能量代謝幾乎停滯，也即低溫能夠阻斷細(xì)胞內(nèi)吞途徑。若hPPIO穿膜方式是通過內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)，那么溫度的變化必然會(huì)影響胞內(nèi)熒光含量。本實(shí)驗(yàn)選用在4°C和37°C兩個(gè)條件探索溫度是否影響其穿膜方式。直方圖表明，低溫對(duì)hPPIO穿膜影響甚微，沒有顯著意義(圖16)。與迄今大多數(shù)報(bào)道結(jié)果ー
致。 5. 2內(nèi)吞抑制劑顯著降低hPPIO穿膜作用觀察三種內(nèi)吞抑制劑對(duì)hPP10-FITC的穿膜影響，肝素鈉(PBS溶解，終濃度
10PM)、氯喹(PBS溶解，終濃度10 PM)、氯丙嗪(PBS溶解，終濃度30iiM)配成母液，
0.22 um濾膜過濾滅菌。四種不同的培養(yǎng)細(xì)胞C0S7、ECV-304、PC3和HeLa在用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)Ih后，相應(yīng)加入終濃度的三種內(nèi)吞抑制劑，與細(xì)胞孵育30min，加入終濃度為5 ii M的hPP10-FITC孵育lh，吸出含有抑制劑和短肽的培養(yǎng)基，PBS清洗3次，依上述方法置于熒光酶標(biāo)儀中，檢測(cè)490nm/520nm的熒光吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)細(xì)胞與不同的內(nèi)吞抑制劑孵育，考察內(nèi)吞抑制劑對(duì)hPPIO入胞情況的影響。其中肝素為細(xì)胞膜表面硫酸蛋白聚糖的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑；氯喹為抑制內(nèi)含體酸化的內(nèi)吞調(diào)節(jié)劑；氣丙嚷為籠型蛋白依賴的內(nèi)吞抑制劑。從圖17A中看出，在加入肝素后,細(xì)胞對(duì)hPPIO的攝取大幅度降低。提示肝素能顯著抑制hPPIO被攝取進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞膜表面的硫酸蛋白聚糖對(duì)hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。圖17B和17C顯示，氯喹和氯丙嗪對(duì)hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞的影響均不明顯。提示hPPIO穿膜進(jìn)入細(xì)胞的過程中可能不依賴內(nèi)含體酸化和籠型蛋白依賴的內(nèi)吞機(jī)制。結(jié)論我們?cè)趯?duì)現(xiàn)有CPPs結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，通過對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，預(yù)測(cè)和ニ級(jí)結(jié)構(gòu)分析等方法，發(fā)現(xiàn)ー全新的人源性細(xì)胞膜穿透肽(hCPP)，命名為hPPIO。人工合成hPPIO以及原核表達(dá)其與綠色熒光蛋白的融合蛋白(hPP10-GFP)進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)研究。發(fā)現(xiàn)hPPIO具有很強(qiáng)的穿膜能力，并可攜帯大分子GFP，質(zhì)粒DNA跨膜進(jìn)入包括腫瘤細(xì)胞，原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞等多種培養(yǎng)細(xì)胞，而不影響所攜帯生物活性分子的功能，對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒副作用。顯示hPPIO將能作為ー種新的人源性細(xì)胞穿膜肽，用于體外和體內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送生物活性分子(如蛋白質(zhì)、多肽，基因等藥物)。hPPIO的開發(fā)將為科研(體外培養(yǎng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染)和臨床治療(向細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白或基因藥物)提供又一新型胞內(nèi)運(yùn)輸工具。
權(quán)利要求
1.ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO的化學(xué)合成方法，包括以下步驟 (1)用Fmoc基團(tuán)對(duì)α-氨基進(jìn)行保護(hù)的賴氨酸通過ー個(gè)支臂連結(jié)到不溶性載體樹脂上； (2)用TFA(三氟こ酸)溶液洗滌賴氨酸一支臂ー樹脂,使α-氨基脫保護(hù)； (3)將第二個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α-氨基保護(hù)的異亮氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與賴氨酸形成共酯連接上去； (4)用TFA溶液洗漆異売氨酸ー支臂ー樹脂,使α-氨基脫保護(hù)； (5)將第三個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α-氨基保護(hù)的脯氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)與 異亮氨酸形成共酯連接上去；重復(fù)進(jìn)行上述脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到耦合上最后ー個(gè)氨基酸精氨酸，脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，合成完成； (6)將切割試劑加入到肽-樹脂中，把肽鏈從樹脂上切割下來，同時(shí)也將各個(gè)氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)從肽鏈上切割下來，加入こ醚，沉淀多肽，獲得多肽粗品； (7)運(yùn)用HPLC/MS進(jìn)行多肽的鑒定和純化，最終得到所需多肽。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述樹脂是羧基樹脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin),合成方法為Fmoc固相合成法。
3.ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO的基因工程表達(dá)法，采用原核表達(dá)方法，包括以下步驟 (1)設(shè)計(jì)編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補(bǔ)的雙鏈DNA片段(hPPIO)； (2)利用Ndel/Xhol兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37°C溫育兩小時(shí)，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b線性化； (3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長(zhǎng)波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時(shí)離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說明完成切膠回收； (4)將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，將混合連接體系置于16°C水浴箱中溫育過夜連接； (5)CaCl2法制備DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，運(yùn)用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b_hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)O. lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜； (6)離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10，酶切并測(cè)序驗(yàn)證； (7)將驗(yàn)證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b-hPP10轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌；經(jīng)0.lg/L氨芐青霉素瓊脂平板37°C過夜； (8)挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜； (9)用15ml無(wú)菌離心管裝3.8ml Amp (+) LB液體培養(yǎng)基，接種O. 2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液(l:20)，37°C，250rpm 繼續(xù)培養(yǎng) 3h ； (10)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM, 37°C, 250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；(11)于加入IPTG后6h取樣200μ I菌懸液； (12)離心收菌體集沉淀,用等體積IXSampleBuffer重懸,沸水浴5min,制備全蛋白裂解液； (13)上樣，SDS-PAGE檢測(cè)、鑒定目的肽hPPIO表達(dá)情況。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述SDS-PAGE分析所表達(dá)和純化的融合肽(hPPIO帶有6x組氨酸標(biāo)簽)，表明可以通過基因工程細(xì)菌表達(dá)和通過鎳柱純化得到純的hPP10-6xHis 融合肽。
5.ー種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO介導(dǎo)紅色熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pDsRed轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔； (2)置37°C5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)； (3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品； (4)將上述hPPIO+質(zhì)粒DNA混合溶液均勻地加入到相應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻，以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照； (5)置細(xì)胞于ニ氧化碳培養(yǎng)箱中37°C繼續(xù)溫育4-6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h ； (6)倒置突光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，以脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，TAT介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，拍照記錄hPPIO介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效果。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品包括以下步驟 a.取終濃度為10μΜhPPIO加入含50μ1 Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ； b.取0.8 μ g的質(zhì)粒pDsRed加入含50 μ I Opti-MEM的另外一個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ； c.將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min。
7.一種人源性細(xì)胞穿膜肽hPPIO介導(dǎo)質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc轉(zhuǎn)染的方法，包括以下步驟 (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞ECV-304，以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種于12孔板常規(guī)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性孔； (2)置37°C5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2(T24h，至細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)； (3)與此同時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品； (4)將hPPIO+質(zhì)?；旌衔锞鶆虻募尤氲较鄳?yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞孔中，輕搖混勻。以市售脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照； (5)在5%C02培養(yǎng)箱中，37°C繼續(xù)溫育4-6h后，置換成含小牛血清正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24-48h。
(6)取200μ I培養(yǎng)液上清(含分泌型熒光素酶)置于I. 5ml離心管中，5000rpm離心3min，依分泌型熒光素酶試劑盒使用說明，運(yùn)用熒光微孔測(cè)定儀，檢測(cè)培養(yǎng)上清熒光素酶活性，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)性對(duì)照，TAT和無(wú)意義肽NCO作為穿膜肽陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于其特征在于所述準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染樣品包括以下步驟 a.取終濃度為ΙΟμΜhPPIO加入含50μ1 Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ； b.取O.8 μ g的質(zhì)粒pcDNA3. I-Gluc加入含50 μ I Opti-MEM的另外一個(gè)離心管中，輕輕混勻后在室溫下孵育5min c.將b緩慢地加入到a中，混勻后室溫靜置30min。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體講，涉及一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPP10的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法。hPP10是源于人類細(xì)胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有穿透細(xì)胞膜功能，并可攜帶蛋白，核酸(DNA質(zhì)粒)跨膜進(jìn)入多種細(xì)胞，是一種極具開發(fā)前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運(yùn)輸載體。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102863516SQ20121026700
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者柳長(zhǎng)柏, 馬節(jié)蘭, 蔡三金, 吳江鋒, 張潔, 賀曉敏, 楊英桂 申請(qǐng)人:三峽大學(xué)