一種重組人促卵泡激素的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程藥物，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，即將含有重組人促卵泡激素的細(xì)胞上清依次經(jīng)過(guò)染料親和層析、疏水作用層析、脫鹽層析和羥基磷灰石層析得到高質(zhì)量的重組人促卵泡激素目的蛋白。本發(fā)明具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、目的產(chǎn)物純度高以及中間過(guò)程便于控制和易于規(guī)模化放大生產(chǎn)等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種重組人促卵泡激素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程藥物，具體涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)也稱為促卵泡激素,是一種屬于促性腺激素類的可注射的蛋白質(zhì)。天然狀態(tài)下由垂體嗜堿性細(xì)胞合成和分泌的，作為藥用，F(xiàn)SH可以重組產(chǎn)生，或者可以從絕經(jīng)后的婦女尿液中分離得到。FSH可用于女性和男性病人的不孕和生殖紊亂的治療，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)上市的有從尿液中提取的注射用尿促卵泡激素，商品名麗申寶；采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品也已進(jìn)口上市，其純度更高、避免了尿蛋白雜質(zhì)及其他雜質(zhì)的污染，商品名果納芬(重組人α促卵泡激素)和普麗康(重組人β促卵泡激素)。
[0003]FSH是一種糖蛋白，糖蛋白激素的不均一性引起理化性質(zhì)的差別較大，對(duì)色譜分離方法的選擇性提出了挑戰(zhàn) ——既要保證制品的質(zhì)量，又要有較高的回收率，這是蛋白質(zhì)純化中一個(gè)重要的問(wèn)題。
[0004]CN101087805中公開(kāi)了一種重組FSH純化方法，該發(fā)明采用超濾、陰離子交換層析、染料親和層析、疏水層析、反相層析以及陰離子交換層析的方法純化重組FSH。CN1890265中公開(kāi)了一種重組FSH純化的方法，該發(fā)明采用超濾、陰離子層析、金屬螯合親和層析、陰離子層析、疏水層析以及反相層析的方法純化FSH，制備的FSH比活性為8876IU/mg。這兩篇專利所涉及的純化工藝步驟較多，純化較為復(fù)雜，工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中控制點(diǎn)多，對(duì)純化工藝可控性帶來(lái)一定的困難；另外，反相層析過(guò)程相對(duì)較慢，需要用到有機(jī)溶劑，最終導(dǎo)致產(chǎn)物要檢測(cè)有機(jī)物殘留，而且以后用于醫(yī)藥生產(chǎn)時(shí)還要考慮有機(jī)溶劑的存放問(wèn)題，給醫(yī)藥生產(chǎn)帶來(lái)一定的不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種適宜于規(guī)模擴(kuò)大化生產(chǎn)的、快速、高效、簡(jiǎn)便的重組人促卵泡激素目的蛋白的純化方法，具有工藝簡(jiǎn)單、成本低，目的產(chǎn)物純度高以及中間過(guò)程便于控制和易于規(guī)?；糯笊a(chǎn)等特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明將含有重組人促卵泡激素的液體依次經(jīng)過(guò)染料親和層析、疏水作用層析、脫鹽層析和羥基磷灰石層析得到高質(zhì)量的重組人促卵泡激素目的蛋白。
[0007]本發(fā)明的具體步驟為:
[0008]染料親和層析
[0009](I)用平衡緩沖液對(duì)染料親和層析柱進(jìn)行平衡，將含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0010](2)用含有NaCl的平衡緩沖液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；[0011]疏水作用層析
[0012](3)用含鹽的平衡緩沖液對(duì)疏水層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液；
[0013]脫鹽層析
[0014](4)將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液；
[0015]羥基磷灰石層析
[0016](5)用平衡緩沖液對(duì)羥基磷灰石層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，即獲得目的蛋白原液。
[0017]本發(fā)明所采用的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液在純化之前先進(jìn)行澄清過(guò)濾,除去細(xì)胞培養(yǎng)液中的菌體等成分。
[0018]染料親和層析過(guò)程中，介質(zhì)選用Blue Sepharose CL-6B、Blue Sepharose 6FastFlow或者Blue Sepharose High Performance,該過(guò)程主要用于捕獲細(xì)胞培養(yǎng)液中的重組人促卵泡激素目的蛋白，同時(shí)除去少量雜質(zhì)蛋白，而且染料親和層析洗脫液不用經(jīng)過(guò)樣品處理就可以直接進(jìn)行后續(xù)的疏水層析，簡(jiǎn)化了操作步驟。當(dāng)重組人促卵泡刺激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上后采用添加了 NaCl的平衡緩沖液對(duì)其進(jìn)行洗脫，其中NaCl的濃度為 I.0mol/L-2.5mol/L。
[0019]本發(fā)明各個(gè)步驟所用的平·衡緩沖液為本領(lǐng)域常用的緩沖體系，例如Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液或H印es緩沖液，緩沖液濃度為lOmmol/L-lOOmmol/L，pH值為
6.5-10.00
[0020]為了去除色素與雜質(zhì)蛋白，染料親和層析后獲得的蛋白液進(jìn)一步進(jìn)行疏水作用層析。疏水作用層析所采用的層析介質(zhì)苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)或丁基瓊脂糖凝膠4或者辛基-瓊脂糖凝膠4FF。該步驟中的平衡緩沖液通過(guò)添加鹽來(lái)增加其離子強(qiáng)度，所述的鹽可選擇為 NaCl、(NH4) 2S04 或者 Na2SO4,濃度為 0.5mol/L-2.0mol/L，其中優(yōu)選 NaCl。
[0021]為了除去疏水層析后蛋白液中的鹽，以進(jìn)行后續(xù)的羥基磷灰石層析，疏水作用層析以后先進(jìn)行脫鹽層析，所用的層析介質(zhì)為Sephadex G-25 Fine、Sephadex G-25 Medium、或者Sephadex G-25 Coarse。另外,該脫鹽層析過(guò)程在一定程度上也能除去蛋白液中的一些色素和低分子量雜質(zhì)蛋白。
[0022]雖然經(jīng)過(guò)上述多次層析以后，蛋白液中的色素和雜質(zhì)蛋白部分得到了去除，但是為了保證最終產(chǎn)品的品質(zhì)，本發(fā)明最后采用了羥基磷灰石層析，去除蛋白液中大量的色素、內(nèi)毒素以及雜質(zhì)蛋白，層析介質(zhì)為Bio-gel羥基磷灰石或者CHT羥基磷灰石，例如Bio-GelHTP Gel> Bio-Gel HTP, DNA Grade、Bio-Gel HT Gel 或者 CHT Ceramic Hydroxyapatite?
[0023]將經(jīng)過(guò)上述層析純化后的穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，即可獲得高純度目的蛋白液。
[0024]綜上所述，本發(fā)明首先采用染料親和層析捕獲重組人促卵泡激素目的蛋白，同時(shí)除去少量雜質(zhì)蛋白，然后利用疏水層析、脫鹽層析去除少量色素、少量的雜質(zhì)蛋白以及低分子量雜質(zhì)，最終采用羥基磷灰石層析去除大量的色素與雜質(zhì)蛋白，三種層析方法依次作用，相互補(bǔ)充，最終制得高質(zhì)量產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明制備出的重組人促卵泡激素目的蛋白活性為13000IU/mg，整個(gè)純化過(guò)程中未采用任何有機(jī)溶劑，最終獲得的產(chǎn)品中無(wú)有機(jī)溶劑殘留，而且本發(fā)明所述的制備工藝簡(jiǎn)便、快速、規(guī)模放大容易，適合大規(guī)模生產(chǎn)?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為SDS-PAGE電泳分析實(shí)施例1純化后的重組人促卵泡激素目的蛋白純度圖譜，I為Marker ；2為重組人促卵泡激素目的蛋白原液,純度:99.68%。
[0026]圖2為Sec-HPLC液相分析實(shí)施例1純化后的重組人促卵泡激素目的蛋白純度圖譜，純度為99.98% 。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下通過(guò)實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)作為本發(fā)明的限制。
[0028]本發(fā)明的方法包括順序使用含有重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液澄清過(guò)濾，染料親和層析，疏水層析，脫鹽，羥基磷灰石層析來(lái)純化重組人促卵泡刺激素目的蛋白。本發(fā)明中所述的層析介質(zhì)均為市購(gòu)。
[0029]實(shí)施例1
[0030]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0031]染料親和層析
[0032](I)用 2OOml 濃度為 10Ommol /T,, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 BlueSepharoseCL-6B層析柱(1.6 X 10cm)，將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0033](2)用含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L、pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0034]疏水作用層析
[0035](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有2.0mol/L NaCl的濃度為100mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液平衡，平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0036]脫鹽層析
[0037](4)用 300ml 濃度為 100mmol/L，pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 S印hadex G-25Fine (1.6X70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0038]羥基磷灰石層析
[0039](5)用 100ml 濃度為 IOOmmoI/L, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 Bio-GelHTPGel (1.6X5cm)層析柱，平衡結(jié)束后，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為100mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0040]將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到99.98%。
[0041]實(shí)施例2
[0042]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:[0043]染料親和層析
[0044](I)用 200ml 濃度為 50mmol/L，pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 Blue SepharoseHigh Performance層析柱(1.6X 10cm),將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0045](2)用含有 1.0mol/L NaCl 的濃度為 50mmol/L、pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0046]疏水作用層析
[0047](3)用 20ml 含有 1.0mol/L NaCl 的濃度為 50mmol/L、pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有0.5mol/L NaCl的濃度為50mmol/L、pH為7.0的Tris-HCl緩沖液平衡，平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0048]脫鹽層析
[0049](4)用 300ml 濃度為 50mmol /L，pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 S印hadex G-25Fine (1.6X70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0050]羥基磷灰石層析
[0051](5)用 100ml 濃度為 50mmol/L, pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 Bio-GelHTPGel (1.6X5cm)層析柱，平衡結(jié)束后，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為50mmol/L、pH為7.0的Tris-HCl緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0052]將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到98.95%。
[0053]實(shí)施例3
[0054]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0055]染料親和層析
[0056](I)用200ml濃度為20mmol/L, pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡Blue Sepharose
6Fast Flow層析柱(1.6X10cm)，將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0057](2)用含有2.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0058]疏水作用層析
[0059](3)用20ml含有0.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡丁基瓊脂糖凝膠4，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有0.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡，平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0060]脫鹽層析
[0061](4)用300ml濃度為20mmol/L, pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡Sephadex G-25Medium (1.6X70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0062]羥基磷灰石層析[0063](5)用100ml濃度為20mmol/L，pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡Bio-GelHT Gel(1.6X5cm)層析柱，平衡結(jié)束后，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0064]將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到99.95%。
[0065]實(shí)施例4
[0066]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0067]染料親和層析
[0068](I)用200ml濃度為60mmol/L, pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡Blue SepharoseHigh Performance層析柱(1.6X 10cm),將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0069](2)用含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0070]疏水作用層析
[0071](3)用20ml含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡丁基瓊脂糖凝膠4，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡，平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0072]脫鹽層析
[0073](4)用300ml濃度為60mmol/L, pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡Sephadex G-25Medium (1.6X70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0074]羥基磷灰石層析
[0075](5)用100ml濃度為60mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡Bio-Gel HT Gel(1.6X5cm)層析柱，平衡結(jié)束后，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為50mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0076]將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到99.97%。
[0077]實(shí)施例5
[0078]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0079]染料親和層析
[0080](I)用 200ml 濃度為 10mmol/T,, pH 為 6.5 的 Hepes 緩沖液平衡 Blue SepharoseCL-6B層析柱(1.6X 10cm)，將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0081](2)用含有1.0mol/L NaCl的濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0082] 疏水作用層析
[0083](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 10mmol/L、pH 為 6.5 的 Hepes 緩沖液平衡辛基-瓊脂糖凝膠4FF，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有2.0mol/L NaCl的濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩沖液平衡,平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0084]脫鹽層析
[0085](4)用 300ml 濃度為 10mmol/T,, pH 為 6.5 的 Hepes 緩沖液平衡 Sephadex G-25Coarse (1.6 X 70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0086]羥基磷灰石層析
[0087](5)用 100ml 濃度為 10mmol/L, pH 為 6.5 的 Hepes 緩沖液平衡 Bio-Gel HTP, DNAGrade (1.6 X 5cm)層析柱，平衡結(jié)束后，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0088]將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到99.96%。
[0089]實(shí)施例6
[0090]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0091]染料親和層析
[0092](I)用 200ml 濃度為 100mmol/L, pH 為 9.0 的 Hepes 緩沖液平衡 Blue Sepharose
6Fast Flow層析柱(1.6X10cm)，將澄清過(guò)濾后的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上；
[0093](2)用含有2.0mol/L NaCl的濃度為IOOmmoI/L, pH為9.0的Hepes緩沖液作為洗脫液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0094]疏水作用層析
[0095](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L、pH 為 9.0 的 Hepes 緩沖液平衡辛基-瓊脂糖凝膠4FF，將步驟(2 )中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結(jié)束繼續(xù)用含有2.0mol/L NaCl的濃度為IOOmmoI/L, pH為9.0的Ifepes緩沖液平衡,平衡至UV280小于IOOmAU ；
[0096]脫鹽層析
[0097](4)用 300ml 濃度為 100mmol/L, pH 為 9.0 的 Hepes 緩沖液平衡 Sephadex G-25Coarse (1.6 X 70cm)層析柱，平衡結(jié)束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結(jié)束；
[0098]羥基磷灰石層析[0099](5)用 100ml 濃度為 100mmol/L，pH 為 9.0 的!fepes 緩沖液平衡 CHT CeramicHydroxyapatite (1.6 X 5cm)層析柱,平衡結(jié)束后,將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上樣結(jié)束繼續(xù)用濃度為IOOmmol/L、pH為9.0的Ifepes緩沖液平衡，平衡至UV280小于lOOrnAU。
[0100] 將穿出液進(jìn)行納米過(guò)濾，所獲得的目的蛋白液采用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測(cè)重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達(dá)到99.90%。
【權(quán)利要求】
1.一種重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:其具體步驟為: 染料親和層析 (1)用平衡緩沖液對(duì)染料親和層析柱進(jìn)行平衡，將含重組人促卵泡激素目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上樣，重組人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料親和層析介質(zhì)上； (2)用含有NaCl的平衡緩沖液對(duì)步驟(1)處理的層析柱進(jìn)行洗脫，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液； 疏水作用層析 (3)用含鹽的平衡緩沖液對(duì)疏水層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進(jìn)行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液； 脫鹽層析 (4)將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩沖液平衡好的脫鹽柱上進(jìn)行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液； 羥基磷灰石層析 (5)用平衡緩沖液對(duì)羥基磷灰石層析柱進(jìn)行平衡，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，即獲得目的蛋白原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:染料親和層析的介質(zhì)選用 Blue Sepharose CL-6B 或 Blue Sepharose 6 Fast Flow 或 Blue SepharoseHigh Performance。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(1)- (5)中所用的平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液或Ifepes緩沖液，緩沖液濃度為IOmmoI/L-1OOmmoI/L, pH 值為 6.5-10.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(2)中的平衡緩沖液中NaCl的濃度為1.0mol/L-2.5mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(3)中所述的疏水層析采用的層析介質(zhì)為苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)或丁基瓊脂糖凝膠4或者辛基-瓊脂糖凝膠4FF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(3)中的鹽為 NaCl 或(NH4) 2S04 或者 Na2SO4,濃度為 0.5mol/L_2.0moI/L0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(3)中的鹽為 NaCl。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(4)中的脫鹽層析介質(zhì)為 Sephadex G-25 Fine 或 Sephadex G-25 Medium 或 Sephadex G-25 Coarse。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特征在于:步驟(5)中羥基磷灰石層析介質(zhì)為Bio-gel羥基磷灰石或者CHT羥基磷灰石。
【文檔編號(hào)】C07K1/20GK103570820SQ201210276894
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月6日
【發(fā)明者】陳俊良, 孫麗霞, 王晶翼, 孫波, 邢婷婷, 孫旭, 張宗輝 申請(qǐng)人:齊魯制藥有限公司