專利名稱：小鼠抗人β-Tubulin單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以原核表達的β-Tubulin蛋白免疫小鼠獲得的分泌β-Tubulin單克隆抗體的雜交瘤細胞株3G7，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Tubulin即微管蛋白，是細胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種微管蛋白，其中ct微管蛋白(a-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種微管蛋白。β -Tubulin是由455個氨基酸組成,分子量為55kDa。a-Tubulin和β-Tubulin這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密地結(jié)合成二聚體，作為微管組裝的亞基。

微管壁由13個原纖維排列組成，微管可裝配成單管，二聯(lián)管(纖毛和鞭毛中)，三聯(lián)管(中心粒和基體中)。細胞內(nèi)微管以胞質(zhì)微管和紡錘體微管兩種形式存在，主要參與細胞運動、細胞器的定位、胞內(nèi)物質(zhì)的運輸及真核細胞的有絲分裂過程。細胞進入分裂期，其胞質(zhì)微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。在分裂后期，紡錘體微管牽引著姐妹染色單體從赤道面移向紡錘體的兩極。在有絲分裂結(jié)束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質(zhì)微管。因此，這種微管蛋白/微管之間的動態(tài)循環(huán)(聚合和解聚)，為細胞正常有絲分裂所必需。若破壞此循環(huán)將致使進入有絲分裂期的細胞停止分裂，進而延長細胞周期或誘導細胞凋亡。腫瘤細胞具有快速增殖能力，若抑制其紡錘體的形成，必將導致有絲分裂過程的阻斷，使得腫瘤細胞生長停滯于G2 / M期。β_微管蛋白可專一性地與某些抗有絲分裂藥物，如秋水仙堿(colchicine)、長春花堿和鬼白素等相結(jié)合。一旦與藥物相結(jié)合后就阻止其他蛋白單體的繼續(xù)添加而抑制微管的聚合，同時還通過誘導微管的解聚抑制紡錘體的形成，使細胞的有絲分裂停止于M期，從而阻止細胞分裂繁殖；紫杉醇類等藥物在β -微管蛋白上的結(jié)合腔靠近異二聚體和原絲間的重要作用區(qū)域，因而在藥物與微管蛋白結(jié)合的同時也加強了異二聚體和原絲間的結(jié)合，結(jié)果促進了微管蛋白的聚合又能穩(wěn)定已形成的微管(抗低溫及抗Ca2+的解聚)，使細胞分裂停止于G2 / M期。與正常細胞相比較，腫瘤細胞對細胞凋亡的誘導更加敏感，作用于微管的抗癌藥物更容易殺死腫瘤細胞，與其他類型藥物相比具有更好的療效。另外，β_微管蛋白表達異常與腫瘤的惡性生物學行為密切相關(guān)，大量的研究表明，α、β_微管蛋白異常表達也出現(xiàn)在直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞中。故監(jiān)測β_微管蛋白在癌變過程中表達水平的變化對腫瘤治療研究以及提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，改善預后都具有重要意義。其次，由于β -Tubulin的蛋白在大部分細胞中的表達比較恒定，因此也被廣泛用于Western Bloting實驗時的內(nèi)參，也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。抗β-Tubulin小鼠單克隆抗體可以通過與β-Tubulin的特異性結(jié)合再加上相應熒光標記或酶標二抗共同作用對β -Tubulin進行染色來觀察細胞結(jié)構(gòu)，或者檢測實驗樣品中β-Tubulin的表達量進而調(diào)整上樣量,確定上樣量相等,進而比較不同條件下或者不同組織中目的蛋白表達量變化。目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種β-Tubulin的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的β -Tubulin的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、用于科研或臨床、可用于科研或臨床免疫組化檢測β-Tubulin表達、Western Bloting實驗時的內(nèi)參、以及免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)的小鼠抗人β -Tubulin單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 (I)根據(jù)β-Tubulin的基因序列(ΝΜ_006086· 3)的編碼框，設(shè)計I對特異引物，Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增β -Tubulin基因，構(gòu)建重組表達載體PET28a-0 -Tubulin，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原。(2)采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)制備β-Tubulin單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。(3)采用免疫印跡法(Western blot)檢測β-Tubulin單抗的效價及特異性,免疫熒光觀察細胞微管結(jié)構(gòu)，通過免疫組織化學分析β -Tubulin單克隆抗體染色人宮頸鱗癌、前列腺癌和食管鱗狀細胞癌石蠟切片。(4)根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體β -Tubulin重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體β -Tubulin的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明提供的以原核表達的β-Tubulin蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌β -Tubulin單克隆抗體的雜交瘤細胞株，名稱為3G7，該細胞株3G7已于2012年7月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 6349，建議分類命名為小鼠抗人β-Tubulin雜交瘤細胞系。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株3G7，CGMCC No. 6349產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID Ν0:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 10。本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO: 7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID N0:8編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明應用重組人的β-Tubulin蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)，通過ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗β -Tubulin的雜交瘤細胞株，命名為3G7，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對β-Tubulin單抗進行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上；ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在I : 100000以上。免疫印跡法(Western blot)檢測β -Tubulin單抗的效價及特異性，結(jié)果顯示在分子量55KDa處有一條明顯的區(qū)帶，證明是抗β-Tubulin小鼠單克隆抗體,梯度稀釋顯示抗體1:40000稀釋后條帶依然清晰,證明本單抗效價極高；免疫印跡法(Western blot)檢測Hela細胞裂解液、大鼠腦組織裂解液、小鼠腦組織裂解液中β -Tubulin蛋白的表達,結(jié)果均得到一條特異性條帶,表明β -Tubulin蛋白的表達，說明本單抗具有廣泛的物種反應性；人宮頸鱗癌、前列腺癌和食管鱗狀細胞癌石蠟切片經(jīng)抗β-Tubulin抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實驗結(jié)果上來看，本發(fā)明制備了高效價，高特異性的β-Tubulin單克隆抗體,用該抗體檢測證實,其對細胞中的β-Tubulin蛋白具有高識別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測β-Tubulin表達,Western Bloting實驗時的內(nèi)參，以及免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。



圖1SDS-PAGE分析純化后的β -Tubulin單克隆抗體。圖2ELISA法測定β -Tubulin單克隆抗體滴度。圖3是免疫印跡法(Western blot)檢測β-Tubulin單抗的純度及特異性。LaneI: β-Tubulin 單抗工作濃度 1:5000。Lane 2: β-Tubulin 單抗工作濃度 1:10000。Lane3: β-Tubulin 單抗工作濃度 1:20000。Lane 4: β-Tubulin 單抗工作濃度 1:40000。圖4是免疫印跡法(Western blot)檢測Hela細胞裂解液(Lane I)、大鼠腦組織裂解液(Lane 2)、小鼠腦組織裂解液中β-Tubulin (Lane 3)蛋白的表達。圖5是免疫熒光檢測觀察細胞微管結(jié)構(gòu)。I:DAPI染色細胞核。2: β -Tubulin單抗免疫熒光結(jié)果。3:Merge(l+2)。圖6是免疫組織化學檢測分析β -Tubulin單克隆抗體染色人宮頸鱗癌石蠟切片。圖7是免疫組織化學檢測分析β -Tubulin單克隆抗體染色前列腺癌石蠟切片。圖8是免疫組織化學檢測分析β -Tubulin單克隆抗體染色食管鱗狀細胞癌石蠟切片。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。實施例I :雜交瘤細胞株3G7及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得I、抗原制備(I)獲得目的基因在該實施例中，根據(jù)β -Tubulin的基因序列(NM_006086. 3)的編碼框，設(shè)計I對特異引物引物I :5，-GGATCCATGAGGGAGATCGTGCACATCC-3，(SEQ ID NO: I)引物2 :5，-CTCGAGTCACTTGGGGCCCTGGG-3' ； (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增β -Tubulin基因。
(2)構(gòu)建重組表達載體將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體 PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒 PET28a-P -Tubulin。(3)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。(4)誘導表達和蛋白純化將步驟(2)提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C，220rpm培養(yǎng) IOh,取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為O. 8，加入O. 2mMIPTG誘導表達，16°C誘導過夜，收集菌液超聲，取上清用Ni-NTA瓊脂糖親和層析法純化β -Tubulin 蛋白。2、單抗的制備和純化(I)、免疫動物—般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行三次免疫注射。首次免疫。純化的重組蛋白β-Tubulin (用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，IOOug/只，頸背部皮下多點注射；二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白β-Tubulin (用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，IOOug/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白β-Tubulin (用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，IOOug/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法檢測效價，選擇效價最高者用于細胞融合。加強免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50ug腹腔注射。3天后，取脾臟融合。(2)、細胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合(1:5 1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進行雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清以純化的β-Tubulin蛋白(10 μ g/ml)包被酶標板，每孔100 μ l，4°c包板過夜。甩掉包被液，加入200 μ I 5%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細胞培養(yǎng)檢測上清100 μ I (陰性對照為？8510(^1)，371孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50 μ I，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗β-Tubulin雜交瘤細胞株，命名為3G7，亞型鑒定為IgGl。
將選出的陽性雜交瘤細胞株3G7克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法)，獲得能產(chǎn)生高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人β -Tubulin雜交瘤細胞系3G7，該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6349。(3)單克隆抗體的大量制備與純化將步驟(2)獲得的細胞株3G7接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體β-Tubulin的純化采用Protein A親和層析法。首先制備proteinA親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗β -Tubulin的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2. 5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖I)。
(4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度以純化的β-Tubulin蛋白(10 μ g/ml)包被酶標板,每孔100 μ 1,4°C包板過夜。甩掉包被液，加入2 O O μ I 5 %的脫脂奶粉，3 7 °C封閉I h后，洗滌3次，將純化的抗體按1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000 進行稀釋，以每孑L100 μ I加入酶標板中(陰性對照為PBS100 μ 1)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50 μ 1，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在I : 100000以上(參見圖2)。實施例2 :單克隆抗體鑒定及應用I、小鼠抗β-Tubulin單克隆抗體的鑒定裂解提取Hela細胞裂解液，上樣至10%的SDS-PAGE膠孔中，20 μ g/孔，電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后，用抗β -Tubulin抗體進行免疫染色，加入實施例I步驟(3)制備并純化的β-Tubulin單克隆抗體，工作濃度分別設(shè)為1:5000、1:10000、I 20000、1:40000，4°C過夜，加入HRP標記的羊抗鼠抗體，工作濃度1:5000,于37°C反應Ih，每個濃度梯度均出現(xiàn)分子量為55KDa的條帶(參見圖3)，與文獻報道相符，證明此抗體為抗β -Tubulin的特異性抗體；梯度稀釋顯示抗體1:40000稀釋后條帶依然清晰,證明本單抗效價極聞。2,Hela細胞裂解液、大鼠腦組織裂解液、小鼠腦組織裂解液中β -Tubulin蛋白表達的檢測用Western blot法檢測細胞裂解液中β-Tubulin蛋白的表達。各細胞取蛋白各50 μ g，用8% SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，加入實施例I步驟(3)制備并純化的β-Tubulin單克隆抗體(工作濃度1:5000)，4°C過夜。加入HRP標記的羊抗鼠抗體(工作濃度1:5000)于37°C反應lh，ECL顯色后觀察結(jié)果。結(jié)果均出現(xiàn)分子量為55KDa的條帶(參見圖4)，說明抗β -Tubulin的3G7單克隆具有廣泛的物種反應性。3、免疫熒光細胞染色和DAPI染色人結(jié)直腸癌細胞SW480用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS沖洗，用含1%正常羊血清、1%牛血清、O. 5%牛血清白蛋白、O. 1% Triton X-100的PBS室溫孵育30min,以阻斷非特異性反應。加實施例I步驟(3)制備并純化的β-Tubulin單克隆抗體(1:50)4°C孵育過夜。沖洗，加TRITC標記的羊抗鼠IgG，室溫避光孵育2h。去除二抗，加入DAPI染色液室溫作用15分鐘以上。PBS沖洗，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，用合適波段激發(fā)，照相保存實驗結(jié)果。實驗結(jié)果清楚觀察到DAPI染色的細胞核顯現(xiàn)藍色熒光，細胞骨架呈現(xiàn)紅色熒光(參見圖5)。說明此抗β-Tubulin的特異性抗體可用于免疫熒光檢測觀察細胞微管結(jié)構(gòu)。4、免疫組化應用檢測用β-Tubulin單抗，按常規(guī)法作病理切片，對人宮頸鱗癌、前列腺癌和食管鱗狀細胞癌石蠟切片進行免疫組化染色。具體方法為切片依次置于二甲苯Ι、ΙΙ、ΙΙΙ脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇1、11中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。3% H2O2中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中 一抗為實施例I步驟(3)制備并純化的β-Tubulin單克隆抗體，稀釋度為1:1000。放置在孵育盒內(nèi)4°C冰箱中過夜孵育約12小時，將孵育盒從冰箱取出，恢復至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘。取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3 5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強度。待強度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5-10分鐘，蘇木素染液復染I分鐘，O. 5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5-10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定按照國外學者對組織中β-Tubulin的判定標準，β-Tubulin蛋白陽性反應為黃到棕黃色細小顆粒，定位于胞漿。人宮頸鱗癌(參見圖6)、前列腺癌切片(參見圖7)和食管鱗狀細胞癌(參見圖8)經(jīng)抗β -Tubulin抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此
單克隆抗體可以特異性的應用于免疫組織化學實驗。實施例3 :單克隆抗體可變區(qū)測序根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物zh08 5’-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3’(SEQ ID NO :3)zhrll 5’-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3’(SEQ ID NO :4)z 101 5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’(SEQ ID NO :5)zlr05 5’-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3’(SEQ ID NO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5X IO6雜交瘤細胞3G7的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用zh08和zhrll為引物進行PCR擴增單克隆抗體β-Tubulin重鏈可變區(qū)，用zlOl和zlr05為引物進行PCR擴增單克隆抗體β -Tubulin輕鏈可變區(qū)，PCR反應均采用熱啟動，反應條件94°C 5分鐘；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個循環(huán)；72°C 7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391bp，重鏈長度420bp)?？寺〉絇GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后在IPTGIX-gal平板上進行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進行測序,確定了單克隆抗體β -Tubulin的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。單克隆抗體β -Tubulin可變區(qū)的DNA序列和氨基酸序列單克隆抗體β -Tubulin 重鏈可變區(qū) DNA 序列(5，— 3’，420bp) (SEQ ID NO:7)；單克隆抗體β-Tubulin 的輕鏈可變區(qū) DNA序列(5，—3’，391bp) (SEQ ID NO:8)；單克隆抗體β-Tubulin重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(140氨基酸)(SEQ IDNO:9)； 單克隆抗體β -Tubulin輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10 IDNO:10)。
權(quán)利要求
1.一種以原核表達的β-Tubulin蛋白免疫小鼠獲得的分泌β-Tubulin單克隆抗體的雜交瘤細胞株3G7，保藏編號為CGMCC No. 6349。
2.一種由權(quán)利要求I所述的雜交瘤細胞株3G7產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID Ν0:10ο
4.一種DNA分子SEQ ID NO: 7，它編碼權(quán)利要求3中所述的重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQID Ν0:9。
5.一種DNA分子SEQ ID NO: 8，它編碼權(quán)利要求3中所述的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQID NO:10。
全文摘要
一種小鼠抗人β-Tubulin單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。所述的分泌β-Tubulin單克隆抗體的雜交瘤細胞株克隆號為3G7，保藏編號為CGMCCNo.6349。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株3G7產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDNO:10。本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQIDNO:7，它編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:9；一種DNA分子SEQIDNO:8，它編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測β-Tubulin表達，WesternBloting實驗時的內(nèi)參，以及免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。
文檔編號C07K16/18GK102776154SQ20121030070
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者尹芝南, 張林剛, 郗日沫 申請人:天津三箭生物技術(shù)有限公司