專利名稱：一種新的用于缺血心臟保護(hù)作用的κ-阿片受體激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用無依賴性新型阿片類藥物治療缺血性心臟疾病的基礎(chǔ)研究和臨床研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
缺血性心臟病是當(dāng)今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動脈內(nèi)溶栓及冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌細(xì)胞再灌注損傷日益受到心臟病學(xué)家的高 度重視。研究表明K -阿片受體在體內(nèi)廣泛存在(如口心、腦等組織和器官)，就心臟而言占主導(dǎo)地位的K-阿片受體在心肌缺血/缺血再灌注過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。來自動物實驗的大量證據(jù)表明，外源性K -阿片受體選擇性激動劑U50488H可明顯降低缺血/缺血再灌注的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、減少心肌梗死面積，降低心律失常的發(fā)生率，改善心臟及冠脈微循環(huán)功能等。前期的實驗研究還發(fā)現(xiàn)，由于U50488H的水溶性較低，分子量小，進(jìn)入血液循環(huán)后可以通過血腦屏障，因此在改善缺血心肌的同時，可能引起機(jī)體成癮和依賴，因而嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。我們力圖對現(xiàn)有的K -阿片受體選擇性激動劑U50488H進(jìn)行改造，獲得一種新的化合物——季胺化U50488H。改造后的產(chǎn)物可以顯著地提高其水溶性，增大分子量，使其不能通過血腦屏障，可以減輕或避免因U50488H通過血液循環(huán)進(jìn)入腦組織引起的成癮性和依賴性，保留其在外周對缺血心臟的保護(hù)作用，這種具有心肌保護(hù)作用的新型阿片類藥物可用于學(xué)術(shù)研究，也為臨床應(yīng)用防治缺血性心臟病提供可能的新藥，因而具有很好的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
我們采用化學(xué)上成熟的方法，對K -阿片受體選擇性激動劑U50488H進(jìn)行季胺化改造，季胺化改造主要分為兩個步驟首先將U50488H中的鹽酸中和去掉，使其變成游離
堿-U50488 (該游離堿為一種叔胺)；然后將游離堿U50488與碘甲燒反應(yīng),生成一種季銨
鹽——季胺化U50488H。季胺化后的U50488H呈淡黃色粉末樣，經(jīng)質(zhì)譜分析，確認(rèn)所得產(chǎn)物為U50488H的碘甲烷季銨鹽C2tlH29Cl2IN2O15詳細(xì)的方法、步驟見具體實施方式
。為了驗證改造后的季胺化U50488H能否通過血腦屏障，并檢驗其對缺血/缺血再灌注心臟的保護(hù)作用，我們做了以下幾方面的實驗研究。一、季胺化改造前后比較和色譜分析鑒定(一 )季胺化改造前后分子量和水溶性比較1.改造前后的分子量測定季胺化U50488H分子量為511. 2695，U50488H的分子量為405. 7895。顯示改造后的季胺化U50488H分子量明顯增大。2.改造前后的水溶性測定在相同時間和條件下，每毫升水可以溶解季胺化U50488H 5毫克；同樣每毫升水只能溶解U50488H 2毫克，顯示改造后的季胺化U50488H水溶解度明顯增加。通過上述比較，顯示了季胺化U50488H的分子量和水溶解度都明顯增加，這些理化性狀提示改造后的季胺化U50488H不易通過血腦屏障。(二)季胺化改造前后標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析1. U50488H標(biāo)準(zhǔn)品與生理鹽水的色譜分析單純生理鹽水和用生理鹽水溶解U50488H標(biāo)準(zhǔn)品后分別進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明2. 4min出現(xiàn)的波峰為生理鹽水；6. Smin出現(xiàn)的波峰為U50488H標(biāo)準(zhǔn)品(見圖1A、B)。2.季胺化U50488H標(biāo)準(zhǔn)品與生理鹽水的色譜分析單純生理鹽水和用生理鹽水溶解季胺化U50488H標(biāo)準(zhǔn)品后分別進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明2. 4min出現(xiàn)的波峰為生理鹽水；
6.8min出現(xiàn)的波峰為季胺化U50488H標(biāo)準(zhǔn)品(見圖1C)。二、季胺化改造前后的血清和腦組織液的色譜分析(一 )靜脈注射季胺化改造前后的血清色譜分析1.標(biāo)準(zhǔn)血清的液相色譜分析取不給任何藥物的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明分別在2. 4min、4min、5. 5min、8min和9. 4min時出現(xiàn)5個波峰。由于血清中各種成份較多，除2. 4min出現(xiàn)的波峰由生理鹽水引起外，其余4個峰所代表的物質(zhì)尚不清楚(圖2A)。2.注射U50488H后血清色譜分析給大鼠靜脈注射U50488H后5min時取靜脈血，將經(jīng)離心后所得血清進(jìn)行色譜分析，結(jié)果出現(xiàn)了 6個波峰，其中在7. 2min時出現(xiàn)的波峰由U50488H所引起(圖2B)。3.注射季胺化U50488H后血清色譜分析給大鼠靜脈注射季胺化U50488H后5min時取靜脈血，將經(jīng)離心后所得血清進(jìn)行色譜分析，結(jié)果出現(xiàn)了 6個波峰，其中在7. 2min時出現(xiàn)的波峰由季胺化U50488H所引起(圖2C)。上述結(jié)果表明靜脈注射U50488H和季胺化U50488H后，經(jīng)色譜分析均可在血清中檢測到所注射的藥物，說明二者均可隨血液循環(huán)分布到全身。( 二)靜脈注射季胺化改造前后的腦組織液色譜分析1.標(biāo)準(zhǔn)腦組織液的液相色譜分析取不給任何藥物的標(biāo)準(zhǔn)腦組織液進(jìn)行色譜分析，分別在2. 5min、8. 5min和10. 5min時出現(xiàn)3個波峰,除2. 5min出現(xiàn)的波峰由生理鹽水引起夕卜，其余2個峰所代表的物質(zhì)尚不清楚(圖3A)。 2.注射U50488H后腦組織液色譜分析給大鼠靜脈注射U50488H后5min時取腦組織，將經(jīng)離心后所得腦組織上清液進(jìn)行色譜分析，結(jié)果出現(xiàn)了 4個波峰，其中在7. 2min時出現(xiàn)的波峰由U50488H所引起(圖3B)。3.注射季胺化U50488H后腦組織液色譜分析給大鼠靜脈注射季胺化U50488H后5min時取腦組織，將經(jīng)離心后所得腦組織上清液進(jìn)行色譜分析，結(jié)果出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)腦組織液的液相色譜分析相同的結(jié)果(圖3C)。上述結(jié)果表明分別靜脈注射U50488H和季胺化U50488H后，在腦組織液中可以檢測到U50488H，說明其經(jīng)血液循環(huán)可以通過血腦屏障進(jìn)入腦組織；而靜脈注射季胺化U50488H后，在腦組織液中未能檢測到季胺化U50488H，說明其不能通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，可以克服由K -阿片受體選擇性激動劑U50488H引起的依賴和成癮等毒副作用，證明了對K -阿片受體選擇性激動劑U50488H的季胺化改造是成功的，實現(xiàn)了我們對其改造的目的。為了證明改造后的季胺化U50488H是否具有對缺血/缺血再灌注心臟的保護(hù)作用，我們在動物實驗中對其進(jìn)行了觀察。三、季胺化改造后對缺血心臟的保護(hù)作用季胺化改造后的U50488H對缺血心臟保護(hù)作用的實驗研究，是通過建立大鼠心肌缺血/缺血再灌注模型來實現(xiàn)的。詳細(xì)的實驗方法、步驟見具體實施方式
。(一 )季胺化U50488H對缺血心肌梗死面積的影響各實驗組大鼠心臟均采用伊文思藍(lán)-TTC雙染色，其中藍(lán)色部分為非缺血區(qū)，紅色部分為缺血區(qū)，白色部分為梗死區(qū)。心肌損傷的程度可用心肌梗死區(qū)域與危險區(qū)域(缺血區(qū)加上梗死區(qū))的比值)來表示，該比值越小，表示心肌損傷程度越輕；比值越大，說明心肌損傷程度越重。實驗結(jié)果顯示，Sham(假手術(shù))組染色為藍(lán)色，說明該組大鼠心肌無缺血；I/R(缺·血/缺血再灌注)組有藍(lán)色、紅色和部分白色區(qū)域組成，說明該組大鼠心肌部分發(fā)生缺血和梗死 ’與I/R組相比，在I/R前給予U50488H或季胺化U50488H預(yù)處理的兩個實驗組，無白色區(qū)域，即無明顯梗死面積出現(xiàn)；而在季胺化U50488H預(yù)處理之前，給予K -阿片受體特異性阻斷劑nor-BNI靜脈注射，又有白色區(qū)域即心肌梗死出現(xiàn)。經(jīng)計算機(jī)軟件分析系統(tǒng)測得心臟梗死區(qū)域與危險區(qū)域的面積，并計算二者比值后，發(fā)現(xiàn)I/R組為39. 8±2. 2，給予U50488H預(yù)處理(6. 4±1. 8)或季胺化U50488H預(yù)處理(6. 3±0. 6)均能有效縮小心肌梗死面積，減輕心肌損傷的程度，且二者的作用無統(tǒng)計學(xué)差異；在季胺化U50488H預(yù)處理前給予nor-BNI (37. 8±2. 6)，可阻斷其縮小心肌梗死面積的作用，說明季胺化U50488H對心肌梗死心臟的保護(hù)效應(yīng)是通過K -阿片受體介導(dǎo)的(圖4)。( 二)季胺化U50488H對缺血心肌酶學(xué)和自由基的影響按照測試試劑盒說明書所述方法步驟，我們分別對各實驗組大鼠血清中的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)進(jìn)行了測定。1.血清 LDH、CK、GOT、MDA 和 NO 的測定LDH、CK、GOT、MDA和NO存在于正常心肌細(xì)胞漿中，只有在心肌細(xì)胞受到損傷或壞死時，它們才可能大量釋放到血液中。因此，測定血清中這些物質(zhì)的含量可以作為反映心肌損傷程度的指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組血清中的LDH、CK、GOT、MDA和NO的含量均有明顯升高，說明缺血/缺血再灌注時，心肌受損 ’與I/R組相比，U50488H+I/R組和季胺化U50488H+I/R組明顯降低，且有統(tǒng)計學(xué)意義，說明U50488H或季胺化U50488H的預(yù)處理可以明顯減輕缺血/缺血再灌注時的心肌損傷，對心肌具有保護(hù)作用；二者對心肌的保護(hù)作用經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差異，說明季胺化改造后的U50488H能發(fā)揮和改造前一樣的心臟保護(hù)作用；而在季胺化U50488H的預(yù)處理之前，給予nor-BM靜脈注射，這些物質(zhì)的含量又有明顯升高，提示季胺化U50488H的作用被阻斷，說明季胺化U50488H對缺血心臟的這種保護(hù)作用是通過K -阿片受體介導(dǎo)的(圖5)。2.血清SOD的測定氧自由基損傷是心肌缺血/缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，而SOD作為自由基清除劑，可以對抗這種損傷。實驗結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組血清中的SOD有明顯降低，說明心肌缺血/缺血再灌注時，氧自由基大量產(chǎn)生，消耗過多的SOD，導(dǎo)致血清SOD含量顯著降低；U50488H+I/R組和季胺化U50488H+I/R組中血清SOD則明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，說明經(jīng)U50488H或季胺化U50488H的預(yù)處理后，可以明顯升高血清中SOD的含量，減輕缺血/缺血再灌注時氧自由基對心肌造成的損傷，對心肌具有保護(hù)作用；二者作用經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差異，說明季胺化改造后的U50488H能發(fā)揮和改造前一樣的心臟保護(hù)作用；而在季胺化U50488H的預(yù)處理之前，給予nor-BNI靜脈注射，血清中SOD含量明顯降低，提示季胺化U50488H升高缺血/缺血再灌注時血清SOD含量的作用被阻斷，說明季胺化U50488H對缺血心臟的這種保護(hù)作用是通過K -阿片受體介導(dǎo)的(圖6)。(三)季胺化U50488H對缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響心肌組織切片經(jīng)TUNEL染色后，所有的細(xì)胞核均被染為藍(lán)色(圖7，左圖)，而凋亡細(xì)胞核則被試劑標(biāo)記顯示為綠色點狀(圖7，右圖)。實驗結(jié)果顯示，Sham組幾乎無心肌細(xì)胞凋亡；I/R組有大量心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；而 給予U50488H或季胺化U50488H預(yù)處理后，則顯著性減少了心肌缺血/缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡；兩者對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用無明顯差異，說明季胺化改造前后的U50488H能發(fā)揮相同的抗心肌細(xì)胞凋亡的作用；而在季胺化U50488H的預(yù)處理之前，給予nor-BNI靜脈注射，凋亡心肌細(xì)胞明顯增加，季胺化U50488H對心肌凋亡的抑制作用被阻斷，說明季胺化U50488H對缺血心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用是通過K -阿片受體介導(dǎo)的(圖7)。總之，研究表明K -阿片受體選擇性激動劑U50488H，在心肌缺血/缺血再灌注過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。由于其進(jìn)入血液循環(huán)后可以通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，因此在改善缺血心肌的同時，容易引起機(jī)體成癮和依賴的毒副作用，因而嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。本實驗證明，K-阿片受體選擇性激動劑U50488H經(jīng)季胺化改造后，通過增大分子量和提高水溶性，使其在血液循環(huán)中不能通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，避免引起機(jī)體成癮和依賴等毒副作用的可能性。同時又完全保留了與改造前相同的對缺血心臟的保護(hù)作用，且這些作用能被K -阿片受體特異性阻斷劑所阻斷，說明其對缺血心臟的保護(hù)作用是通過K -阿片受體所介導(dǎo)，進(jìn)一步證明了所合成的季胺化U50488H為新一類K -阿片受體選擇性激動劑。本研究為K-阿片受體選擇性激動劑U50488H的醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1季胺化改造前后標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析圖2季胺化改造前后的血清色譜分析圖3季胺化改造前后的腦組織液色譜分析圖4季胺化U50488H對缺血心肌梗死面積的影響(Sham :假手術(shù)組，I/R :缺血/缺血再灌注組，U50 U50488H+I/R 組，季胺化 U50 :季胺化 U50488H+I/R 組，nor-BNI nor-BNI+ 季胺化 U50488H+I/R 組)圖5血清LDH、CK、GOT、MDA和NO的測定(分組同圖4)圖6血清SOD的測定(分組同圖4)圖7季胺化U50488H對缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響(分組同圖4)
具體實施例方式一、U50488H的季胺化改造(1)U50488游離堿的制備
IXXInJ 一 IXXAJp hci 16 ^ 16取U50488H粉末，逐漸加入蒸餾水至完全溶解，滴加飽和Na2CO3至溶液PH為10，用乙酸乙酯萃取,經(jīng)薄層色譜(Thin Layer Chromatography,TLC)檢測為純品(展開劑乙酸乙酯甲醇=5 2)，然后用無水硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑，得淡黃色油狀物即為U50488游離堿，產(chǎn)率97. 3%。
(2)碘甲烷季銨鹽的制備
Ch3I ciXXanXD
'(5r在N2保護(hù)下，將U50488置于三頸瓶中，加入新蒸CH3I (分子量142，密度2. 28g/ml)，回流(42°C )，大約5h后，經(jīng)TLC檢測，原料幾乎消失，停止反應(yīng)，蒸出CH3I,得粗品(淡黃色固體)，用柱層析分離得淡黃色粉末樣固體(CH3Cl2 甲醇=10 1)，產(chǎn)率61.6%。U50488H的季胺化改造結(jié)束后，運(yùn)用質(zhì)譜法分析，確認(rèn)所得淡黃色粉末樣產(chǎn)物即為U50488H 的碘甲烷季銨鹽 C2tlH29Cl2IN2O15二、U50488H改造前后的高效液相色譜分析鑒定取成年健康SD雄性大鼠12只，稱重，以30g/L戊巴比妥鈉(2mg/kg)腹腔注射麻醉，固定。頸前部備皮后，剪一頸前正中縱向切口，逐層分離至氣管暴露，做一氣管插管，保證其呼吸通暢。依次分離右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸靜脈，各做一血管插管，分別為實驗完畢抽取血液和建立給藥途徑所用。其中6只靜脈注射U50488H 2mg/kg,于給藥后5min通過插管抽取血液和開顱取大腦半球組織,另外6只靜脈注射季胺化U50488H 10mg/kg (為明確季胺化U50488H究竟是否能透過血腦屏障，特加大給藥劑量)，取材方法同前所述。實驗所取血液經(jīng)室溫靜置IOmin后，4000轉(zhuǎn)/min離心25min，抽取上層血清置于-80°C凍存?zhèn)溆?；所取腦組織按2ml Img的比例加入新鮮超純水，經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎儀勻漿后，14000轉(zhuǎn)/min離心2h，抽取上層清液即腦組織液置于_80°C凍存?zhèn)溆?。以上操作在冰上進(jìn)行。高效液相色譜測定時，U50488H和季胺化U50488H標(biāo)準(zhǔn)品可直接上機(jī)檢測；血清和腦組織液則須在4°C解凍，分別加入乙酸乙酯，旋渦充分混勻，7000轉(zhuǎn)/min離心15min，然后抽取上清液，經(jīng)N2吹干，加入甲醇，旋渦混勻，再經(jīng)有機(jī)相濾器抽濾后，方可上機(jī)檢測。液相條件為:甲醇30%,水70% ;波長290nm ;流速lml/min ;描記時間15min。三、建立動物心肌缺血/缺血再灌注模型
取成年健康SD雄性大鼠，稱重，麻醉(方法同前所述)，固定。頸前部和胸前部備皮后，剪一頸前正中縱向切口，逐層分離至氣管暴露，做一氣管插管。依次分離右側(cè)頸總動脈、右側(cè)股動脈和左側(cè)頸靜脈，各做一血管插管，其中右頸總動脈插管插至左心室，分別為記錄左心室內(nèi)壓(右頸總動脈插管也用于實驗完畢抽取血液樣本)、記錄動脈血壓和建立給藥途徑所用。連接呼吸機(jī)和心電圖針狀電極，逐層打開胸腔至心臟完全暴露，在心室收縮期小心剪開心包，在左冠狀動脈前降支距左心耳下緣l_2mm處以6-0絲線穿線，備用。實驗共分5個組，(I)對照組(Sham)，該組在大鼠開胸后，對左冠狀動脈只穿線，不結(jié)扎。(2)缺血/缺血再灌注組(I/R)，將結(jié)扎線輕輕提起，用血管鉗夾緊，給予缺血30min，然后松開血管鉗，使其恢復(fù)再灌注120min。(3)U50488H+I/R組(U50)，在缺血前IOmin靜脈注射U50488H，余同I/R組。(4)季胺化U50488H+I/R組(季胺化U50)，在缺血前IOmin靜脈注射季胺化U50488H，余同I/R組。(5) nor-BNI+季胺化U50488H+I/R組(nor-BNI)，在靜脈注射季胺化U50488H之前IOmin靜脈注射nor-BNI，余同季胺化U50組。實驗完畢，通過血管插管抽取血液，離心備用(方法同前所述)。
四、季胺化U50488H對缺血心肌梗死面積的影響實驗的手術(shù)部分同心肌缺血/缺血再灌注模型的建立。實驗完畢，將大鼠冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎(Sham組不結(jié)扎)，經(jīng)大鼠右頸動脈插管將20g/L的伊文思藍(lán)約Iml注入大鼠心臟，待大鼠口唇變藍(lán)后，迅速摘除大鼠心臟進(jìn)行TTC染色。做TTC染色時，用干凈鋒利刀片將結(jié)扎線以下的大鼠心臟切成約2mm厚的薄片，置于新鮮配制的TTC溶液中37°C水浴孵育15min，取出觀察心肌梗死面積。其中，未發(fā)生缺血處被TTC染成紅色，由于被伊文思藍(lán)掩蓋而呈現(xiàn)藍(lán)色；發(fā)生缺血的心肌部分被TTC染成紅色；而心肌發(fā)生梗死的部分既不能被伊文思藍(lán)染色，也不能被TTC染色，因而呈現(xiàn)蒼白色。等待色差明顯后，將心臟薄片放入4%多聚甲醛中固定，隔夜拍照。五、血清LDH、CK、GOT、MDA、NO 和 SOD 的檢測各項指標(biāo)檢測時，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。六、季胺化U50488H對缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響實驗的手術(shù)部分同心肌缺血/缺血再灌注模型的建立。實驗完畢，立即取心臟結(jié)扎線以下缺血區(qū)作冰凍切片，然后做TUNEL染色，在熒光顯微鏡下拍照。
權(quán)利要求
1.首次對K-阿片受體激動劑U50488H進(jìn)行季胺化改造，獲得一種新的κ -阿片受體激動劑——季胺化U50488H。
2.季胺化U50488H的特征在于，它不能通過血腦屏障，避免了引起機(jī)體成癮和依賴等毒副作用的可能性；但是仍然具有保護(hù)缺血/缺血再灌注心臟的功能；且能被K -阿片受體特異性阻斷劑所阻斷。這種具有心肌保護(hù)作用的新型阿片類藥物可用于學(xué)術(shù)研究，也為臨床應(yīng)用防治缺血性心臟病提供可能的新藥，因而具有很好的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前旦-5^ O
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對缺血心臟具有保護(hù)作用新的κ-阿片受體激動劑——季胺化U50488H。季胺化U50488H是在極性溶劑和催化劑條件下，由κ-阿片受體激動劑U50488H和CH3I反應(yīng)生成。該季胺化產(chǎn)物能夠像U50488H一樣明顯改善缺血/再灌注心臟的功能，明顯減少心肌梗死面積，降低心肌酶的漏出和顯著減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量。這種新的化合物的顯著特點是它不能通過血腦屏障，避免了因U50488H通過血液循環(huán)進(jìn)入腦組織引起可能發(fā)生的成癮性和依賴性。這種具有心肌保護(hù)作用的新型κ-阿片受體激動劑可用于學(xué)術(shù)研究，也可為臨床應(yīng)用防治缺血性心臟病提供可能的新藥，因而具有很好的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前景。
文檔編號C07D295/135GK102993125SQ20121036099
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者裴建明, 王躍民, 王倩梅, 郭海濤, 樊榮, 張淑苗, 李娟 , 馮娜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)