專利名稱：芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種芋螺毒素多肽Ebl. 6的制備方法。
背景技術：
芋螺屬腹足綱軟體動物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區(qū)，我國有芋螺100多種，主要分布在西沙群島、海南島及臺灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計約存在5萬多種不同活性的多肽(McIntosh JM, Jones RM. Toxicon，2001，39 :1447-1451. Xa-芋螺多肽(a -CTX)屬于芋螺多肽A超家族，特異作用于肌肉型或神經元型nAChRs。絕大多數a -芋螺多肽含12-18個氨基酸、兩對二硫鍵(CCXmCXnC，連接方式為1_3，2_4)。根據m，n的數目不同，a -芋螺多肽細分為a 3/5，a 4/3，a 4/4，a 4/6，a 4/7亞家族。目前發(fā)現某些a -芋 螺多肽具有鎮(zhèn)痛活性，其中a -芋螺多肽Vcl. I (GCCSDPRCNYDHPEIC0NH2)是來自維多利亞芋螺(Conus Victoriae),由16個氨基酸組成,含兩對二硫鍵(二硫鍵的排列方式為1-3,2-4)(SandalI et al. Biochemistry, 2003,42 :6904-6911.)。研究表明 Vcl. I 在神經性疼痛動物模型中表現出了較好的鎮(zhèn)痛活性并具有加速損傷神經恢復的作用(Satkunanathanet al. Brain Res.，2005，1059 :149_158)，2006年已進入臨床研究階段。α-芋螺多肽作用的靶點與傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物的靶點不同，且不成癮，這對開發(fā)新一代鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。Ebl. 6 (GCCSNPACMLKNPNLC-NH2，序列I)來自中國南海西沙群島黑星芋螺，由-芋螺毒素信號肽保守序列克隆得到，其序列與已報道的α-芋螺毒素顯著不同。前期初步研究表明，該肽對大鼠神經病理性疼痛模型具有很強的鎮(zhèn)痛作用(劉珠果等.·型芋螺多肽及其應用，中國發(fā)明專利申請?zhí)朲L201010121879. 7)。前期合成Ebl. 6采用儀器合成，縮合劑為N，N’ - 二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)/I-羥基苯并三唑(HOBt)，偶合率高。但該方法不利于手工大量合成，因為縮合劑DCC反應后形成不溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)的N，N’ - 二環(huán)己基脲(D⑶)，給縮合反應及樹脂洗滌帶來不便。另外，Ebl. 6線性肽折疊成目標物質采用C18柱反相吸附，乙腈洗脫,成本高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種制備芋螺多肽Ebl. 6 (GCCSNPACMLKNPNLC-NH2)的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽；2)折疊Ebl. 6線性肽得到多肽粗品；3)純化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Ebl. 6。上述方法中，采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽包括如下步驟先用Fmoc保護氨基酸、以Rink樹脂為固相載體、DIC/HOBt為縮合劑、哌啶為脫保護劑，從C端依次偶聯(lián)合成，得到肽樹脂；再將所述肽樹脂裂解得到Ebl. 6線性肽。其中，Fmoc保護氨基酸為 Fmoc-Cys(Trt) - OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Pro-OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -OH。上述合成Ebl. 6線性肽方法中，摸索選用了縮合劑苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)/HOBt/異丙基二乙胺(DIEA)，發(fā)現儀器與手工合成目標肽均較雜，產率低。最后采用縮合劑DIC/H0BT，儀器合成與手工合成的效率均很高。上述合成Ebl. 6線性肽方法中，步驟I)中，所述Rink樹脂和每一個所述Fmoc保護氨基酸的摩爾比為1:4。上述方法中，折疊Ebl. 6線性肽按照包括如下步驟的方法進行(a)將Ebl. 6線性肽在濃度為O. 1-0. 3M、pH值為8. 0-8. 4的緩沖液中折疊；所述緩沖液為碳酸氫銨緩沖液或醋酸銨緩沖液或Tris緩沖液；
(b)將經步驟(a)得到的折疊產物經AmberliteXAD16大孔吸附樹脂吸附后,用無水乙醇浸洗，收集浸洗產物，即得到多肽粗品。上述方法中，所述純化所述多肽粗品按照包括如下步驟的方法進行將所述多肽粗品用C18反相HPLC柱純化，得到芋螺多肽Ebl. 6。上述步驟(a)中的緩沖液具體為濃度為O. 25M NH4Ac緩沖液、濃度為O. 2MNH4HC03緩沖液、濃度為O. IM NH4HCO3緩沖液或濃度為O. IM Tris-HCl緩沖液，pH值均為8. 0 8. 4。由于Ebl. 6線性肽含有4個半胱氨酸，分子內折疊形成兩對二硫鍵的產物才具有活性，因此對折疊線性肽所需的緩沖溶液進行篩選，發(fā)現Ebl. 6在NH4HC03、NH4Ac或Tris緩沖體系緩沖液(ρΗ=8. (Γ8. 4)形成一個主要產物峰，而考慮到規(guī)模生產成本，且NH4HCO3折疊液價廉易得。因此，在本發(fā)明的實施例中采用的緩沖液為濃度為O. IM順4!10)3緩沖液，pH值具體為8.0。上述折疊時間為18h。在步驟(b)中，在所述收集浸洗產物步驟后，還包括如下步驟將所述浸洗產物旋蒸濃縮去除乙醇、凍干，得到多肽粗品。由于Ebl. 6線性肽溶解度低，給折疊后多肽的回收、純化帶來不便。文獻中多對二硫鍵多肽的折疊產物富集一般采用C18反相吸附，乙腈或甲醇洗脫，溶劑消耗量大，成本高(K. Sandra, et al. Anal. Bioanal. Chem.，2006，385:671-677)，因此，在本發(fā)明的實施例中，采用AmberliteXAD16大孔吸附樹脂對Ebl. 6折疊產物進行吸附，乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用C18柱純化；乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生。此方法可實現緩沖體系及樹脂的反復循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本。AmberliteXAD16大孔吸附樹脂也可以用其他離子交換大孔吸附樹脂替換。由上述的方法制備得到的芋螺多肽Ebl. 6也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明合成多肽Ebl. 6的過程中，首先采用縮合劑DIC/H0BT提高了手工合成線性肽的效率；再選取PH值為8. O、濃度為0. IM NH4HCO3緩沖液作為折疊緩沖液，不僅價廉易得，而且折疊率高；再將折疊得到的產物經過AmberliteXAD 16大孔吸附樹脂進行吸附、乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用于后續(xù)的C18柱純化，同時乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生，此步驟可實現緩沖體系及樹脂的反復循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本；最后通過純化得到大量合成多肽。該多肽Ebl. 6的二硫鍵配對方式正確，且具有高的鎮(zhèn)痛活性。


圖I為不同縮合劑對Ebl. 6線性肽合成效率的影響圖2為折疊緩沖液對Ebl. 6線性肽折疊的影響圖3為Eb I· 6裂解后的HPLC分析4為Ebl.6折疊后的HPLC分析5為Ebl. 6反相高效液相色譜純化后HPLC分析6為Eb I· 6兩步折疊法測二硫鍵的HPLC分析7為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后2小時的鎮(zhèn)痛效果
圖8為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后4小時的鎮(zhèn)痛效果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例多肽Ebl. 6的氨基酸序列為序列表中的序列1，且C端酰胺化，
gccsnpacmlknpnlc-nh2 )。下述實施例中HPLC分析如無特殊說明，分析條件均如下KromasiI C18柱(4. 6mmX 250mm,北京分析儀器廠)，洗脫梯度0 Imin, 5 10%B ； I 25min, 10 50%B ；25 28min, 50 95%B ；A 為含 O. 1%TFA 的 H2O, B 為含 O. 1%TFA 的乙腈(ACNV1^OI lml/min。DIC化學名稱為N，N’ -異丙基碳二酰亞胺。實施例I、芋螺多肽Ebl. 6的規(guī)模制備一、芋螺多肽Ebl. 6規(guī)模制備的條件摸索I、不同縮合劑對Ebl. 6線性肽手工固相合成效率的影響Ebl. 6線性肽的前期合成采用儀器合成，在433A多肽合成儀(ABI美國應用系統(tǒng)生物公司儀器)上進行，使用Fmoc保護的氨基酸(上海吉爾生化有限公司)和取代率為
O.60mmol/g的Rink樹脂，縮合劑為DCC/HOBt。反應體系中，樹脂與氨基酸的摩爾比為1: 5，每次合成O. Immol肽樹脂，偶合率高(圖1_A)。但該方法不利于手工大量合成，因為縮合劑DCC反應后形成不溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)的N，N’ -二環(huán)己基脲(DCU )，給縮合反應及樹脂洗滌帶來不便。因此進一步摸索適于手工固相合成的縮合劑Ebl. 6線性肽合成的過程如下米用Fmoc 保護氨基酸(Fmoc-Cys (Trt) - OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH)、取代率為0. 60mmol/g的Rink樹脂、哌唳脫保護，縮合劑分別采用HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt ;樹脂與氨基酸的摩爾比為1:4，每次合成IOmmol。上述線性肽合成方法與后面實驗二中步驟I的線性Ebl. 6線性肽的合成基本相同，不同的是合成量lOmmol，且采用的縮合劑分別為HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt，HPLC分析。結果縮合劑采用HBTU/HOBt/DIEA合成的目標肽非常雜，目標峰附近出現了兩個很大的雜峰(結果與圖IB無顯著差異)；縮合劑采用DIC/HOBt合成的目標肽，目標峰附近只有很小的雜質峰(圖1D)。采用DIC/HOBt為縮合劑合成肽樹脂的粗產率為94. 6%，裂解后線性肽的粗產率為107. 8%，粗產率大于100%原因是粗肽中含有水、TFA、有機溶劑等雜質引起，線性肽純度約為63. 6%。為了排除手工合成與儀器合成可能差別采用DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA縮合劑進行試驗儀器合成，結果如圖IB和IC所示，IB為HBTU/HOBt/DIEA，IC為DIC/HOBt ;看出HBTU/HOBt/DIEA的效果仍很差，排除了手工合成與儀器合成可能差別。因此，采用縮合劑DIC/HOBt，儀器合成(圖1C)與手工合成(圖ID) (IOmmol)線性肽的效率均很高，目標峰附近只有較少的雜質峰，因此可以采用縮合劑DIC/HOBt手工合成得到的線性肽Ebl. 6。2、折疊緩沖液對Ebl. 6線性肽折疊的影響在pH=8. O 的 O. 25M NH4Ac、O. 2M NH4HCO3'O. IM NH4HCO3'O. IM Tris-HCl 緩 沖體系，分別加入線性肽Ebl. 6至肽濃度為O. 2mg/mL,室溫(25°C )攪拌18h進行氧化折疊，HPLC分析。結果如圖2所示，為不同折疊緩沖液對Ebl. 6線性肽折疊的影響，A、B、C、D分別為在 ρΗ=8· O 的 0. 25Μ NH4Ac、0. 2M NH4HC03、0. IM NH4HCO3>0. IM Tris. HCl 緩沖體系中折疊的HPLC分析圖，發(fā)現Ebl. 6線性肽在上述緩沖體系中折疊效率均高。結合規(guī)模折疊時成本考慮，選用比較廉價易得的0. IM NH4HCOdt為緩沖體系。上述pH=8. O的0. IM NH4HCO3緩沖體系按照如下方法制備在20mL去離子水中加入0. 16g碳酸氫銨攪拌溶解，再用鹽酸調節(jié)pH=8. O即得20mL pH=8. O的0. IM NH4HCO3緩沖體系。二、芋螺多肽Ebl. 6的規(guī)模制備I、Ebl. 6線性肽的合成米用Fmoc 保護氨基酸(Fmoc-Cys (Trt) - OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH)、縮合劑DIC/HOBt、Rink樹脂、哌啶脫保護，自C端起依次偶聯(lián)合成，樹脂與每一個Fmoc保護氨基酸的摩爾比為1:4 ;具體合成方法以40mmol Ebl. 6線性肽手工固相合成步驟為例描述如下I)肽樹脂合成40mmol (66. 67g)取代率為O. 60mmol/g的Rink樹脂加入I升固相反應腔，用250mL左右的二氯甲烷(DCM)浸泡3h ;用20%哌啶/DMF分別脫保護兩次(10min、30min)；依次用200mL的DMF、甲醇(MeOH)、DCM、DMF、DCM、DMF (3次)洗滌5min ;然后加入活化的Fmoc-Cys (Trt) -OH (160mmol,93. 712g)(溶于 300ml NMP，加入 DIC (108mmol,26. 28mL,
I.05eq)/H0Bt (176mmol，23. 7812g，I. I eq)，在冰浴下活化 lh)，振蕩(220r/min) 6h ;茚三酮檢測陰性后，用約200mL的DMF，DCM, DMF, DCM, DMF (2次)洗滌5min，即完成了第一個氨基酸Cys的連接。然后按上述方法及多肽序列依次連接剩余氨基酸，縮合時間24小時，縮合后均進行茚三酮檢測，若樹脂呈藍色，需進行封閉操作。封閉液為乙酸酐(20mmol，30.25mL，8. 0eq)/340mmol DIEA(320mmol，58. 2mL,8. 5eq)/NMP (約250mL)，25°C振蕩lh，洗滌順序同上。最后一個氨基酸Gly連接完畢后，用20% 哌啶 /DMF 脫除 Fmoc 基兩次(10min、30min)，再用 250ml 的 DMF，MeOH, DCM, DMF，DCM,DMF, DCM (3次)依次洗滌，抽干。晾干后得肽樹脂199. 3g，粗產率為94. 6%，合成量為40mmol。
2)肽樹脂的裂解199. 3g 肽樹脂的裂解加入 99. 7mL I, 2_ 乙二硫醇(EDT)/39. 8mL H20,39. 8mL 三異丙基硅烷(TIS) /1773. 8mL三氟乙酸(TFA)裂解3h，減壓蒸除TFA等裂解液，加入冷卻的無水乙醚約5L攪拌，靜置Ih后，抽濾，無水乙醚洗滌三次，晾干，得線性多肽Ebl. 6粗品72g。裂解后線性多肽Ebl. 6粗品的HPLC分析，結果如圖3所示，得到線性多肽Ebl. 6粗品。2、規(guī)模氧化折疊I)氧化折疊40L不銹鋼桶中加入36L O. IM NH4HCO3緩沖液(pH=8)，機械攪拌下加入8克由I得到的線性多肽Ebl. 6粗品，折疊(攪拌)18小時，折疊產物(折疊液)HPLC分析。結果如圖4所示，可看到為一主要目標峰。 2)折疊產物富集向折疊產物中加入400克AmberliteXAD16大孔吸附樹脂(北京慧德昌科技有限責任公司)，吸附3h，濾出樹脂，先用蒸餾水洗滌3次，然后用O. 5升無水乙醇浸洗3次，合并浸洗液，旋蒸濃縮并凍干，得到目標多肽Ebl. 6粗品。目標多肽Ebl. 6粗品的回收率為82. 3%，取部分多肽Ebl. 6凍干進行規(guī)模純化。3、產品純化工藝將上述2得到的目標多肽Ebl. 6選用動態(tài)軸向壓縮柱(Kromasil C18,100 Α IOym (5CmX40Cm))，江蘇漢邦科技有限公司)進行反相液相色譜純化，上樣量350mgEbl. 6粗品，將其溶于IOOml 5%乙腈水溶液，離心后上樣。上樣速度5ml/min。流速30ml/min。A 為含 O. 1%TFA 的 H2O, B 為含 O. 1%TFA 的 ACN0 洗脫梯度=Time 為 0 70min、B% 為29Γ46%、檢測波長214nm，收集目標肽，濃縮后凍干，得到純化多肽Ebl. 6。一次純化得純度98. 5%的目標肽150毫克。將上述純化多肽Ebl. 6經HPLC分析，結果如圖5所示，得到純化多肽Ebl. 6。實施例2、多肽Ebl. 6的檢測上述由實施例I得到的純化多肽Ebl. 6經過測序，氨基酸序列為序列表中的序列I，再將該多肽進行如下進一步檢測I、多肽Eb I· 6 二硫鍵的測定多肽Ebl. 6 二硫鍵的測定采用兩步折疊法首先合成線性肽Ebl.6 (合成方法同上述實施例I實驗二的步驟I)，第一步空氣氧化折疊形成第一對二硫鍵(Cysl_Cys3),然后碘氧化出去Acm保護基形成第二對二硫鍵(Cysl-Cys3, Cys2_Cys4),第一步氧化折疊條件為0. IM Tris-HCl緩沖液，pH=7. 7,磁力攪拌約28h，HPLC分析折疊進程。折疊充分，用稀醋酸終止反應，富集脫鹽凍干后，進行下一步折疊。第二步氧化折疊條件10mM碘液與O. 4mg/mL的第一步折疊產物等體積混合,避光反應IOmin后，加入適量抗壞血酸溶液終止反應，HPLC分析產物情況，富集凍干純化。將兩步折疊產物與一步折疊產物混合進樣，進行HPLC分析，判斷多肽的二硫鍵連接方式。結果如圖6所示，可以看出，Ebl.6二硫鍵的連接方式為“Cysl-Cys3，Cys2-Cys4”。2、多肽Ebl. 6鎮(zhèn)痛活性的測定規(guī)模合成多肽Ebl. 6的鎮(zhèn)痛活性用大鼠坐骨神經松扎模型(CCI，Bennett GJ, XieYK. Pain, 1988,33 :87-107)進行驗證。大鼠(雄性，體重200_220g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)麻醉后，在股段中部切開皮膚和肌肉，暴露坐骨神經干。將約2厘米的神經游離出來，并用2-0號絲線在其上作4道較松的結扎，結扎間距約2毫米，結扎程度以神經有形變但不影響神經被膜血管流通為準(在40倍放大鏡下觀察)。然后，以4-0號縫合線肌肉和皮膚均用棉線縫合，一周后拆線。手術七天后使用Ugo 37215型壓痛儀測試大鼠痛閾值，痛閾值下降40%以上者視為建模成功大鼠。將建模成功的大鼠分成5組，每組8只第一組為陽性對照組(嗎啡5mg/Kg+加巴噴丁 100mg/Kg)，嗎啡采用皮下注射lmg(0. lmL)，加巴噴丁采用灌胃給藥的方式O. 2mg(0. 18mL);第二至四組分別為實施例I中實驗二得到的純化多肽Ebl. 6的三個不同劑量組(I μ g/Kg、4. 98 μ g/Kg和49. 8 μ g/Kg)，用生理鹽水(O. 9%)配制，濃度分別為50 μ g/mL>5 μ g/mL、l μ g/mL,靜脈注射劑量均為O. 2mL (大鼠體重均約為200g);第五組為陰性對照組，注射O. 2mL濃度為O. 9%的生理鹽水。給藥前和給藥2h、4h后，測試大鼠痛閾值，實驗設三次重復。實驗數據采用Micrsoft Excel軟件和軟件origin6. O繪圖處理,計算痛閾提高率，公式為(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值，用平均值土標準差表示。 結果如圖7和圖8所示，圖7為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后2小時的鎮(zhèn)痛效果，圖8為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后4小時的鎮(zhèn)痛效果；可見，靜脈給予Ebl. 6 4. 98 μ g/Kg和49. 8 μ g/Kg 2小時后，大鼠痛閾提高率分別為46. 8%±9· 2和57. 4%土 17. 8，顯著高于給予陽性對照藥物組(39. 7%±11. 4)。給藥4小時后，痛閾提高率分別為26. 1%±14. 8、36. 8%±15. 9,39. 1%±8· 9 均高于陽性對照組(19. 0%±11· O)。上述結果表明，采用本發(fā)明的方法合成的多肽Ebl. 6 二硫鍵連接正確，且具有高的鎮(zhèn)痛活性。
權利要求
1.一種制備芋螺多肽Ebl. 6的方法，包括如下步驟1)采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽；2)折疊Ebl. 6線性肽得到多肽粗品；3)純化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Ebl. 6。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 所述采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽包括如下步驟先用Fmoc保護氨基酸、以Rink樹脂為固相載體、DIC/HOBt為縮合劑、哌啶為脫保護劑，從C端依次偶聯(lián)合成，得到肽樹脂；再將所述肽樹脂裂解得到Ebl. 6線性肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于 所述Rink樹脂和每一個所述Fmoc保護氨基酸的摩爾比為1:4。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述折疊Ebl. 6線性肽按照包括如下步驟的方法進行 Ca)將所述Ebl. 6線性肽在濃度為O. 1-0. 3M、pH值為8. 0-8. 4的緩沖液中折疊；所述緩沖液為碳酸氫銨緩沖液或醋酸銨緩沖液或Tris緩沖液； (b)將經步驟(a)得到的折疊產物經AmberliteXAD 16大孔吸附樹脂吸附后,用無水乙醇浸洗，收集浸洗產物，即得到多肽粗品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法。本發(fā)明公開了一種制備芋螺多肽Eb1.6的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)采用縮合劑DIC/HOBt合成Eb1.6線性肽；2)折疊所述線性肽，即得到芋螺多肽Eb1.6。本發(fā)明的方法首先采用縮合劑DIC/HOBT提高了手工合成線性肽的效率；再選取pH值為8.0、濃度為0.1MNH4HCO3緩沖液作為折疊緩沖液，不僅價廉易得，而且折疊率高；再將折疊得到的產物經過AmberliteXAD16大孔吸附樹脂進行吸附、乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用于后續(xù)的C18柱純化，同時乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生，此步驟可實現緩沖體系及樹脂的反復循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本。
文檔編號C07K1/06GK102875654SQ20121036142
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權日2012年9月25日
發(fā)明者戴秋云, 徐艷, 董銘心, 余碩, 劉珠果, 王孝花, 周尚民, 李海濤, 代琴 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所