專利名稱：一種調(diào)控植物葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控植物葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉片衰老是作物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的生理生化和分子生物學(xué)過程，不僅受到植株和葉片的發(fā)育進(jìn)程影響，也受到外界環(huán)境因子的影響[Chandlee JM, et al, Physiologia Plantarum, 113: 1-8, 2001; Gepstein S， etal, Genome Biology, 5(3): 212, 2004; Nam HG, Trends Plant Sci, 8(6): 272-277， 2003]。葉片衰老的啟動(dòng)以后，光合功能迅速衰退，取而代之的是積累在葉片中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被快速降解并高效地轉(zhuǎn)運(yùn)到新生或忙藏器官中[Nam HG, Curr Opin Biotech,8: 200-207， 1997; Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58: 115-136， 2007; Smart CM,New Phytolj 126: 419-448， 1994; Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology,6: 79-84，2003]。因而，葉片衰老啟動(dòng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)關(guān)乎到作物的光合總量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再利用效率，即啟動(dòng)過早會(huì)減少光合產(chǎn)物(干物質(zhì))的積累，而啟動(dòng)過晚則減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再動(dòng)員(remobilization)。研究表明，一些情況下,適當(dāng)?shù)匮泳徣~片衰老不僅可以增加作物的產(chǎn)量潛力，而且還能夠提高作物的抗逆性[Rivero RM，et al, PNAS, 104(49):19631-19636，2007];另一些情況下，適當(dāng)?shù)丶铀偃~片衰老不僅可以提高作物在逆境中的收獲產(chǎn)量和質(zhì)量，也可以提高植株水平上的抗逆(旱)性(Munne B, et al, FunctionalPlant Biology, 31: 203-216，2004)。因此，發(fā)掘葉片衰老啟動(dòng)及其進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，建立它們?cè)谶z傳改良上的應(yīng)用模式，在作物的遺傳改良上具有重要的應(yīng)用前景。NAC是高等植物中所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其命名來源于上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因矮牽?；?、擬南芥47 / / 和基因[Aida M, et al, Plant Cell, 9(6):841 - 857，1997]。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是各成員的N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，整個(gè)N端區(qū)域可劃分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E)，其中亞結(jié)構(gòu)域A、C、D高度保守，亞結(jié)構(gòu)域C、D序列中含有核定位信號(hào)(nuclear localization signals, NLS),可能與轉(zhuǎn)錄因子核定位及啟動(dòng)子上特定順式元件的識(shí)別有關(guān)[Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262(6):1047-1051, 2000 ；0oka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003]。E 亞結(jié)構(gòu)域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亞家族中高度保守[Ooka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003] ο C 端是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)(transcrip tional activation regions, TARs),具有高度的多樣性，該端的共同特點(diǎn)是一些氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率高。2003年，Ooka等通過全基因組分析，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)105個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，在水稻中則發(fā)現(xiàn)75個(gè)NAC成員。通過比較NAC結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將它們分成2個(gè)大族，3個(gè)亞族(08應(yīng)034了八 ，應(yīng)10。根據(jù)近幾年報(bào)道，NAC家族又被劃分為為5個(gè)亞族(0sNAC3，ATAF,NAM, AtNAC3, NAP)。
NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物頂端分生組織及花器官分化[Sablowski RWM, et al, Cell,92 (I): 93-103，1998]、側(cè)根形成[Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17(11) : 2993-3006，2005]、次生壁增厚[Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23): 3024-3036, 2000]等植物特定發(fā)育過程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53: 383-397，2003)與非生物脅迫過程(Nogueira FT, et al, Plant Science, 169: 93-106，2005)中均起著重要作用，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物衰老進(jìn)程也起著重要的調(diào)控作用[Guo YF, Gan S，Plant Journal, 46 (4) :601-612, 2006]。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器宮建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。相較于MYB類、bZIP類及WRKY類的轉(zhuǎn)錄因子，NAC轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少。AtNAP是擬南芥NAC家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子。Guo等[Guo YF, Gan S，PlantJournal, 46(4) : 601-612, 2006]研究發(fā)現(xiàn)，AtNAP在調(diào)控?cái)M南芥衰老過程中起著重要的\\作用；AtNAP僅在衰老葉片中表達(dá)，且AtNAP的表達(dá)量與葉片的衰老程度成正相關(guān)，變化趨勢(shì)與衰老標(biāo)志基因說似J相一致；擬南芥突變體部無論是在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下還是在黑暗誘導(dǎo)狀態(tài)下均出現(xiàn)葉片衰老滯后表型；誘導(dǎo)AtNAP過表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明顯的提前衰老現(xiàn)象；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)水稻、四季豆的NAP皆能異源互補(bǔ)擬南芥突變體atoa/ 的滯綠表型，說明NAP轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物衰老中起著重要的作用。此后NAC家族其它成員在衰老過程中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)。Kim等發(fā)現(xiàn)突變體ore7衰老延緩的表型是由基因^⑶似突變?cè)斐傻?，OREl的表達(dá)隨衰老進(jìn)程上調(diào)，而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控OREl的miR164在衰老過程中受到抑制[Kim JH，et al, Science,322(5917) : 1053-1057, 2009] 'OREl的同源基因ORSl也在衰老過程中發(fā)揮著積極作用，ORSl過表達(dá)株系衰老提前，而ORSl的表達(dá)被抑制后衰老進(jìn)程也相應(yīng)的延遲，此外ORSl的表達(dá)受 H202 高度誘導(dǎo)[Balazadeh S，et al, Molecular Plant, 4(2): 346-360，2011]；VNI2不但調(diào)控木質(zhì)部導(dǎo)管的形成，而且能夠整合ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)，在衰老過程中發(fā)揮著重要作用，VNI2在衰老中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，突變體衰老加速，而過表達(dá)VNI2可以延緩衰老[Yang SD, et al, Plant Cell, 23(6) : 2155-2168，2011];新近發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)H202響應(yīng)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子JUBl同樣是一個(gè)衰老的負(fù)調(diào)控因子，JUBl可能通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)H202的水平而調(diào)控系統(tǒng)的衰老進(jìn)程[Wu AH, et al, Plant Cell, 24(8) : 482-506，2012]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠調(diào)控植物葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的能夠調(diào)控植物葉片衰老的植物轉(zhuǎn)錄因子，具體為ANAC072蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種，見圖2所示，但不局限于這些物種，包括與擬南芥UrahWoASi1S
)中ANAC072 (NCBI基因登錄號(hào)為At4g27410，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。本發(fā)明所提供的擬南芥衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的擬南芥ANAC072轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸之一 I) SEQ ID NO: I所示的DNA序列。2)編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中SEQ ID NO :1由973個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第I位至945位堿基；序列表中SEQ ID NO 2由314個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明還涉及所述植物葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述擬南芥葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072的編碼基因的細(xì)胞系。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的基因在 調(diào)控植物葉片衰老性狀、提高作物產(chǎn)量中可有重要應(yīng)用。


圖I為擬南芥ANAC072與其它擬南芥NAC家族轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)生樹。圖2為擬南芥ANAC072與其它植物該衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹分析。圖3為黑暗處理6天后野生型擬南芥和突變體的離體葉片衰老表型。圖4為正常生長(zhǎng)34天后Co I-O、anac072~l和anac072-2的第3、4片真葉中ANAC072的表達(dá)情況。圖5為正常生長(zhǎng)34天的狀態(tài)下Col-Q、anac072_l的離體葉片表型。圖6為正常生長(zhǎng)40天的狀態(tài)下Co\_Q、anac072_l和anac072_2的自然生長(zhǎng)狀態(tài)的衰老表型。圖7為正常生長(zhǎng)40天后CoH、anac072_l和mac072-2的離體葉片衰老表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ANAC072插入突變體材料的獲得
I.I擬南芥材料準(zhǔn)備
取在16h L/8h D光照，23°C條件下培養(yǎng)20天的擬南芥葉片。1.2 RNA 提取
取擬南芥材料約O. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，加Iml TRIzoKinvitrogen公司),混勻后,室溫放置15分鐘,加O. 2ml氯仿:異戍醇(24:1),劇烈搖動(dòng)15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)O. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。I. 3 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2Pg制備的總RNA，0. 5μ1 Rnaseinhibitor,加 DEPC 處理過的去離子水至 8· 5μ1, 2μ1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min,室溫放置 IOmin, 13000rpm 簡(jiǎn)短離心 5s。再依次加入 4μ1 5 X First-Strand buffer, 0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-1 dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄I小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于_20°C待用。I. 4 anac072~l插入突變體材料的鑒定
根據(jù) TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全長(zhǎng) CDS 序列及插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三條引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，AGTGATCGAGTGCTTCAGGAC 3’)和 ANAC072-RP (5，ACTCGTGCATAATCCAGTTGG 3’)作為 PCR 反應(yīng)的引物。PCR反應(yīng)體系為50μ1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，55°C復(fù)性40s，72°C延伸70s，循環(huán)35次，72°C充分延伸5min。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到純合突變體材料。1.5插入突變體材料的鑒定
根據(jù) TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全長(zhǎng) CDS 序列及插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三條引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，CTGGGCTAACGGATCTTTCTC 3’ )和 ANAC072-RP (5， GCTACATTTGTGAGATAATCTTAATGG 3’ )作為PCR反應(yīng)的引物。PCR反應(yīng)體系為50μ1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s， 55°C復(fù)性40s，72°C延伸70s，循環(huán)35次，72°C充分延伸5min。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到純合突變體材料。實(shí)施例2 :擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ANAC072功能分析
2.I序列比較分析
用Genedoc軟件分析了 ANAC072與其他擬南芥NAC家族蛋白的同源性，結(jié)果表明ANAC072具有典型保守的NAC domain,如圖I所示。我們利用軟件建立了 ANAC072同其他擬南芥NAC家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，其中ANAC072與ANACO19、ATNAC3的親緣關(guān)系最近。而后，我們發(fā)現(xiàn)在油菜、大豆、楊樹等植物中存在與ANAC072同源性較高的蛋白，如油菜BnNAC485與擬南芥ANAC072有很高的同源性。圖2展示了植物中ANAC072蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。2. 2.突變體葉片衰老指標(biāo)分析
2.2. I擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 : 3 : 0. 5 營(yíng)養(yǎng)液組分
權(quán)利要求
1.一種植物葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于為ANAC072蛋白，來源于擬南芥或油菜物種，包括與擬南芥中ANAC072蛋白的同源性高于30%的類似蛋白，ANAC072蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一種擬南芥葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072的編碼基因，其特征在于是下列核苷酸之一 1)SEQ ID NO: I所示的DNA序列； 2)編碼SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.含有權(quán)利要求I所述植物葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求2所述擬南芥葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072的編碼基因的細(xì)胞系。
5.如權(quán)利要求I所述植物葉片衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ANAC072蛋白在延緩葉片衰老從而提高作物產(chǎn)量的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控植物葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物ANAC072蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種，但不局限于這些物種，包括與擬南芥中ANAC072蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。擬南芥ANAC072轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQIDNO:1；2)編碼序列表中SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明涉及的蛋白將在植物延緩葉片衰老從而提高作物產(chǎn)量方面提供基因資源和方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102850446SQ20121036631
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者蒯本科, 高炯, 李收, 梁寧菁 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)