專利名稱：鏈黑菌素類似化合物及其制備方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈黑菌素制備領(lǐng)域，具體涉及一種鏈黑菌素類似化合物及其制備方法和它們?cè)谥苽淇鼓[瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
鏈黑菌素是一個(gè)由絨毛鏈霉菌(Streptomyces flocculus)產(chǎn)生的具有獨(dú)特喹啉環(huán)結(jié)構(gòu)的抗腫瘤抗生素。其抗腫瘤活性良好，是一種廣譜抗腫瘤抗生素，對(duì)腦癌、頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌，特別是對(duì)白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的臨床療效。鏈黑菌素的藥理作用是可選擇性地抑DNA合成，主要作用于S期，一個(gè)分子的鏈黑菌素可與2000個(gè)分子的脫氧核苷酸穩(wěn)定地結(jié)合，并能使瘤細(xì)胞染色體斷裂，使已形成的DNA降解.由于具有較大的骨髓毒性，因此很少單獨(dú)用藥用于臨床。鏈黑菌素含有四個(gè)環(huán)，其中三個(gè)環(huán)幾乎處于同一 個(gè)平面，而第四個(gè)環(huán)與這個(gè)平面幾乎呈垂直狀態(tài)。絨毛鏈霉菌(Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223)被證實(shí)可以產(chǎn)生鏈黑菌素。我們利用分子生物學(xué)原理和技術(shù)，從這株鏈霉菌中獲得了鏈黑菌素生物合成基因簇，并在基因水平對(duì)鏈黑菌素的生物合成基因進(jìn)行選擇性失活獲得兩個(gè)相應(yīng)的突變菌株，從這兩個(gè)突變菌株中獲得了 3個(gè)鏈黑菌素家族化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鏈黑菌素類似化合物及其制備方法和它們?cè)谥苽淇鼓[瘤藥物中的應(yīng)用。鏈黑菌素產(chǎn)生菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223的菌種來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，寄存來(lái)源是上海醫(yī)藥工業(yè)研究院。參考文獻(xiàn)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》，1975，P202-205，科學(xué)出版社，北京。本發(fā)明通過(guò)對(duì)柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223進(jìn)行一系列針對(duì)鏈黑菌素(streptonigrin)生物合成基因敲除突變，獲得2個(gè)基因突變菌株，從這2個(gè)突變株的發(fā)酵液中分離到3個(gè)鏈黑菌素家族化合物。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種鏈黑菌素類似化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(I )所示
權(quán)利要求
1.一種鏈黑菌素類似化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式(I )所示
2.一種如權(quán)利要求1所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A、以鏈黑菌素原始產(chǎn)生菌柔毛鏈霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC 4. 1223為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇； B、對(duì)所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的羧酸酯酶基因StnA或甲基轉(zhuǎn)移酶基因stnQ3進(jìn)行選擇性失活，獲得StnA基因失活突變菌株Λ stnA或stnQ3基因失活突變菌株ΔstnQ3 ； C、對(duì)所述突變菌株△stnA進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵液經(jīng)分離純化，制得如權(quán)利要求1所述的鏈黑菌素類似化合物，其中，R1=OCH3或H，R2=OCH3, R3=OCH3 ； 或?qū)λ鐾蛔兙辍?stnQ3進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵液經(jīng)分離純化，制得如權(quán)利要求1所述的鏈黑菌素類似化合物，其中，R1=OCH3, R2=OH, R3=0H。
3.如權(quán)利要求2所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述對(duì)突變菌株AstnA的發(fā)酵液分離提純包括分離獲得粗提物，提純制得所述鏈黑菌素類似化合物。
4.如權(quán)利要求3所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述分離獲得粗提物具體為將滅菌后的大孔樹(shù)脂加入到突變菌株AstnA發(fā)酵液中，發(fā)酵培養(yǎng)后，分離出大孔樹(shù)脂經(jīng)中等極性有機(jī)溶劑A洗脫，獲得粗提物。
5.如權(quán)利要求4所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述中等極性有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿、二氯甲烷或丙酮。
6.如權(quán)利要求3所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于,R1= OCH3時(shí)，所述提純具體為將粗提物用正相硅膠進(jìn)行柱層析，用石油醚和中等極性有機(jī)溶劑B的混合物作為流動(dòng)相洗脫，經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，收集含有R1=OCH3的所述鏈黑菌素類似化合物的餾分濃縮得到粗分離物A，粗分離物A經(jīng)反相硅膠層析，用體積濃度為60% 70%的甲醇水溶液洗脫，經(jīng)HPLC檢測(cè)后合并餾分，濃縮干燥即得。
7.如權(quán)利要求3所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于,R1=H時(shí)，所述提純具體為將粗提物用正相硅膠進(jìn)行柱層析，用石油醚和中等極性有機(jī)溶劑B混合后作為流動(dòng)相洗脫，經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，收集含有R1=H的所述鏈黑菌素類似化合物的餾分濃縮得到粗分離物B ;粗分離物B經(jīng)反相硅膠層析，用體積濃度為50% 60%的甲醇水溶液洗脫，經(jīng)HPLC檢測(cè)后合并餾分，濃縮干燥即得。
8.如權(quán)利要求6或7所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述作為流動(dòng)相的石油醚和中等極性有機(jī)溶劑B的體積比為1:3 10:1。
9.如權(quán)利要求8所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述中等極性有機(jī)溶劑B為乙酸乙酯、乙醚、氯仿、二氯甲烷、丙酮或異丙醇。
10.如權(quán)利要求2所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述對(duì)突變菌株AstnQ3發(fā)酵液的分離提純具體為將液體發(fā)酵培養(yǎng)基離心后的濾液調(diào)整pH值為9 10，用不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑C反復(fù)萃取，而后取其水相濾液調(diào)整pH值為4.5 5. 5，再次用所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑C反復(fù)萃取，收集HPLC檢測(cè)到的含有R1=OCH3, R2=OH, R3=OH的鏈黑菌素類似化合物的洗脫相,濃縮得到粗提物；該粗提物經(jīng)反相硅膠柱層析，用體積濃度為40% 80%的甲醇水溶液洗脫，經(jīng)HPLC檢測(cè)合并餾分，濃縮后再經(jīng)凝膠柱層析，收集紅色組分，經(jīng)HPLC檢測(cè)后合并餾分，干燥即得。
11.如權(quán)利要求10所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑C為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。
12.如權(quán)利要求10所述的鏈黑菌素類似化合物的制備方法，其特征在于，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑C與所述離心后的濾液的體積比為1:3 2:1 ;與所述水相濾液的體積比為1:3 2:1。
13.—種如權(quán)利要求1所述的鏈黑菌素類似化合物在制備抗腫瘤和抗菌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鏈黑菌素類似化合物及其制備方法、用途。該鏈黑菌素類似化合物的結(jié)構(gòu)式為其中，R1=OCH3或H，R2=OCH3，R3=OCH3；或R1=OCH3，R2=OH，R3=OH。本發(fā)明以鏈黑菌素產(chǎn)生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4.1223作為出發(fā)菌株，分別對(duì)該菌株鏈黑菌素生物合成基因簇的羧酸酯酶基因stnA和甲基轉(zhuǎn)移酶基因stnQ3進(jìn)行選擇性失活，獲得羧酸酯酶失活突變菌株ΔstnA和甲基轉(zhuǎn)移酶失活突變菌株ΔstnQ3；分別對(duì)這兩個(gè)突變株發(fā)酵產(chǎn)物粗提物分離純化，即得。本發(fā)明的化合物作為抗腫瘤藥物鏈黑菌素的類似物可用于開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)C07D401/04GK102993168SQ201210376339
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者林雙君, 鄧子新, 徐飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)