一種皂苷分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種皂苷分離純化方法。采用二維制備液相色譜從皂苷提取物中高效分離純化皂苷單體，第一維采用反相色譜柱，第二維采用親水色譜柱。流動相組成為乙腈、甲醇、乙醇或水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式。選取三七葉水提物第一維制備所得三個有代表性的餾分，通過第二維親水色譜制備獲得八個皂苷單體，其中包括兩對同分異構(gòu)體和一個新皂苷。該方法可以實現(xiàn)皂苷的目標制備，可獲取批量的已知活性皂苷，同時富集分離微量皂苷，從而不斷豐富皂苷庫，為皂苷類化合物的活性研究和單一成分的新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【專利說明】一種皂苷分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及皂苷類化合物的分離純化，具體地說是一種通過二維制備色譜分離技術(shù)從皂苷提取物中分離制備皂苷單體，包括常量已知皂苷、皂苷異構(gòu)體和微量新皂苷等的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阜苷(Saponins)是苷元(Sapogenins)為三職(Triterpenoids)或螺旋留燒類(SpiiOstane)化合物的一類糖苷。皂苷根據(jù)苷元連接糖鏈數(shù)目的不同，可分為單糖鏈皂苷、雙糖鏈皂苷及三糖鏈皂苷。在皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，由于苷元具有不同程度的親脂性，糖鏈具有較強的親水性，使皂苷成為一種表面活性劑，用力振搖其水溶液可產(chǎn)生持久性泡沫。
[0003]皂苷類化合物除具有表面活性、溶血、毒魚等特性外，還具有多種生理功能，是許多中藥的主要活性成分。皂苷的生物活性除與苷元有關(guān)外，與糖鏈的結(jié)構(gòu)也關(guān)系密切。
S.G.Sparg、王楠、張云峰和張存莉等分別對皂苷類化合物具有的生物活性進行了綜述，這些活性主要包括防治心血管系統(tǒng)疾病、抗癌、降血糖、降血脂、保肝、抗炎、抗過敏、抗微生物、抗衰老、抗生育等(S.G.Sparg, Μ.E.Light, J.van Staden, Biological activities anddistribution of plant saponins, Journal of Ethnopharmacology 94 (2004)219-243 ；王楠.皂苷生物活性的研究進展，醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20(2):211-214;張云峰，魏東，鄧雁如，等.三萜皂苷的生物活性研究新進展，中成藥，2006，28 (9):1349-1353 ;張存莉，吳戰(zhàn)庫，馬惠玲，等.留體皂苷的生物活性研究進展，西北林學(xué)院學(xué)報，2003，18(2):95-100.)。
[0004]適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的需要，為了揭示以皂苷類化合物為主要活性成分的中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，科研人員開展了大量有關(guān)皂苷類化合物的分離純化工作。采用的方法主要是使用甲醇或稀乙醇作提取溶劑，提取液回收溶劑后，用水稀釋，經(jīng)正丁醇萃取或大孔樹脂純化，得粗皂苷，最后用硅膠柱色譜進行分離或高效液相制備，得到單體，常用的洗脫劑有不同比例的氯仿-甲醇-水混合溶劑和水飽和的正丁醇。該方法主要存在以下問題:一是，皂苷類化合物極性較強，在正相洗脫液中的溶解性較差，導(dǎo)致其在硅膠柱分離時易產(chǎn)生拖尾和死吸附等問題；二是，皂苷類化合物一般只在紫外末端有吸收，這給制備高效液相色譜在線檢測帶來不便；三是，大量結(jié)構(gòu)相似或同分異構(gòu)體皂苷類化合物的聚類存在，對常規(guī)C18制備色譜的分離能力是一種挑戰(zhàn)；四是，皂苷類化合物在水中濃縮時會產(chǎn)生大量泡沫，給反相色譜柱后樣品處理帶來不便；五是，化合物制備可控性差，無法實現(xiàn)有效的目標制備，導(dǎo)致大量已知化合物的重復(fù)獲得，造成人力、物力的極大浪費；六是，色譜分離模式僵化，分離選擇性差，使得發(fā)現(xiàn)新化合物的困難越來越大。
[0005]五加科人參屬中三種重要植物-人參(Panax ginseng C.A.Mey)、三七(Panax
Notoginseng(Burk.)F.H.Chen)和西洋參(Panaxquinquefolium L.)中已發(fā)現(xiàn)的人參阜苷有100多種。主要包括達瑪燒型的 原人參二醇型(Protopanaxadiol)和原人參三醇型(Protopanaxatriol )、齊墩果燒型(Oleanane)以及奧克梯隆醇型(Ocotillol)阜苷。反相C18梯度洗脫是人參皂苷常用的分析方法，但分析時間一般較長。鑒于HILIC與RP分離機理完全不同，有研究報道采用HILIC分離模式等度洗脫分析人參皂苷類化合物，可有效縮短分析時間(Da Wei Louj Yoshihiro Saitoj Pawel K，Zarzyckij MitsuhiroOgawa, Kiyokatsu JinnojIsocratic separation of ginsenosides byhigh-performanceliquid chromatography on a diol column at subambienttemperatures,Anal.Bioanal.Chem.(2006) 385:96-104.；N.S.Quimingj N.L.Denolaj A.B.Solievj Y.Saitoj K.Jinnoj High performance Iiquidchromatographic separation and quantitativeanalysis of ginsenosidesusing a polyvinyl alcohol-bonded stationary phase, Chromatographia2007, 66, July (N0.1/2).；Noel S.Quimingj Nerissa L.Denolaj AzamjonB.SolievjYoshihiro SaitojKiyokatsu Jinnoj Retention behavior ofginsenosideson a poly (vinyl alcohol)-bonded stationary phase inhydrophilic interactionchromatography, Anal.Bioanal.Chem.(2007) 389:1477-1488.)。因目前商品化的親水色譜分離材料種類很有限，將其用于皂苷類化合物的制備還鮮有報道。此外，有研究報道釆用高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)分離制備人參皂苷類化合物(Qizhen Du, GeroldJerzcj Reiner Waibelbj Peter Winterhaltercj Isolation ofdammarane saponins fromPanax notoginseng by high—speedcounter—current chromatography, J.Chromatogr.A 1008 (2003) 173-180.；Young Wan Ha，Soon Sung Limj In Jin Haj Yun-CheolNa，Jung-Ju Seo，Heungsop Shin,Sung Ho Son,Yeong Shik Kimj Preparativeisolation of four ginsenosides from Korean red ginseng(steam-treated Panaxginseng C.A.Meyer)，by high-speedcounter-current chromatography coupled withevaporative light scatteringdetection, J.Chromatogr.A 1151 (2007)37-44.；YijunCheng,QionglinLiangj Ping Hu，Yiming Wang, Frank Wu Jun，Guoan Luoj Combinationofnorma1-phase medium—pressure Iiquid chromatography andhigh—performancecounter-current chromatography for preparation ofginsenoside-Ro from panaxginseng with high recovery and efficiency,Separation and PurificationTechnology 73 (2010) 397-402.)，但該方法主要適用于分離制備已知且高含量的化合物，而且適宜萃取溶劑體系的選擇非常困難，萃取過程中易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象給分離檢測帶來不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及一種皂苷的分離純化方法。采用二維制備液相色譜從皂苷提取物中分離純化皂苷單體，第一維采用反相色譜柱，第二維采用親水色譜柱。流動相組成為乙腈、甲醇、乙醇或水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式。
[0007]其中所述反相色譜柱為C18 TDE、X4、XTerra MS C18或SunFire C18 ;所述親水色譜柱為酰胺柱(XAmide)、兩性離子柱(ClickX1n)、麥芽糖柱(Click Maltose)、環(huán)糊精柱(Clicks-⑶)、二醇基柱(Diol)或硅膠柱(Silica)。色譜操作參數(shù)如下:色譜柱內(nèi)徑為
4.6-100mm ;樣品濃度為 lmg/mL-lg/mL ;進樣量為 I μ L_40mL ;流速為 0.5_480mL/min ;柱溫為 0-60。。。[0008]所述第一維制備流動相組成為乙腈-水、甲醇-水或乙醇-水；第二維制備流動相組成為乙腈-水、乙腈-甲醇、乙腈-乙醇、乙腈-甲醇-水或乙腈-乙醇-水。
[0009]選取三七葉水提物第一維所得3個有代表性的餾分(Fr.9，F(xiàn)r.11和Fr.13)，通過第二維親水色譜制備獲得8個皂苷單體，包括2對同分異構(gòu)體和I個新皂苷。所述化合物的結(jié)構(gòu)信息如下:
【權(quán)利要求】
1.一種皂苷分離純化方法，其特征在于:采用二維制備液相色譜從皂苷提取物中分離純化皂苷單體，第一維采用反相色譜柱，流動相組成為乙腈、甲醇或乙醇中的一種或兩種與水混合，洗脫方式為線性梯度或臺階梯度；第二維采用親水色譜柱，流動相組成為甲醇、乙醇或水中的一種或兩種與乙腈混合，采用等度洗脫方式。
2.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:所述反相色譜柱為C18TDE、X4>XTerra MS C18或SunFire C18 ;所述親水色譜柱為酰胺柱(XAmide)、兩性離子柱(ClickX1n)、麥芽糖柱(ClickMaltose)、環(huán)糊精柱(ClickP-CD)、二醇基柱(Diol)或硅膠柱(Silica)。
3.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:色譜操作參數(shù)如下:色譜柱內(nèi)徑為 4.6-100mm ;樣品濃度為 lmg/mL-lg/mL ;進樣量為 I μ L_40mL ;流速為 0.5-480mL/min ；柱溫為0-60°C。
4.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:所述第一維制備流動相組成為乙臆-水、甲醇-水或乙醇-水；第二維制備流動相組成為乙臆-水、乙臆-甲醇、乙臆-乙醇、乙腈-甲醇-水或乙腈-乙醇-水。
5.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:所述皂苷提取物為三七葉水提物。
6.一種權(quán)利要求5所 述皂苷類化合物的制備方法，其特征在于: 1)三七葉水提物先經(jīng)第一維制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為C18TDE柱；水(A)和乙腈(B)流動相體系；洗脫梯度為0-5min，體積濃度20% — 32%B; 5-45min,體積濃度32% — 68%B; 45-50min,體積濃度 68% — 100%B; 50-55min, 100%B ;流速為 300mL/min ;檢測波長為203nm ;樣品溶液濃度為300mg/mL，其采用體積濃度20%ACN_80%H20溶解；進樣體積為IOmL ;l_55min，每分鐘收集一份，共計54個組分，每個組分濃縮至干后備用； 2)在第一維制備所得54個組分中，皂苷主要分布在Fractions6-30共25個組分中；之后，針對這25個富含皂苷的組分進行第二維親水色譜制備，色譜柱為酰胺柱；采用乙腈水流動相體系，根據(jù)各個組分的色譜保留特性，流動相中乙腈的體積濃度控制在60%-95% ；采用等度洗脫方式制備皂苷單體。
7.—種權(quán)利要求6所述皂苷類化合物的制備方法，其特征在于: 選取第一維制備所得3個有代表性的餾分(Fr.9，F(xiàn)r.11和Fr.13)，通過第二維親水色譜制備獲得皂苷單體，化合物的具體制備過程如下: 選取Fraction 9采用親水色譜模式進行第二維制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為酰胺柱(XAmide);水(A)和乙腈(B)流動相體系；體積濃度76%B等度洗脫；流速為20mL/min ;檢測波長為203nm ;進樣量為ImL ;收集各個色譜峰,分別回收溶劑,經(jīng)核磁實驗確定，獲得Pl和P2兩個化合物； 選取Fraction 11采用親水色譜模式進行第二維制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為酰胺柱(XAmide);水(A)和乙腈(B)流動相體系；體積濃度80%B等度洗脫；流速為20mL/min ;檢測波長為203nm ;進樣量為lmL。收集各個色譜峰,分別回收溶劑,經(jīng)核磁實驗確定，獲得P3、P4、P5和P6四個化合物； 選取Fraction 13采用親水色譜模式進行第二維制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為酰胺柱(XAmide);水(A)和乙腈(B)流動相體系；體積濃度80%B等度洗脫；流速為20mL/min ;檢測波長為203nm ;進樣量為lmL。收集各個色譜峰,分別回收溶劑,經(jīng)核磁實驗確定，獲得P7和P8兩個化合物； 第一維所得3個有代表性的餾分(Fr.9，F(xiàn)r.11和Fr.13)，通過第二維親水色譜制備獲得8個皂苷單體，包括2對同分異構(gòu)體和I個新皂苷； 所述化合物的結(jié)構(gòu)信息如下:
【文檔編號】C07J17/00GK103724390SQ201210391032
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月15日
【發(fā)明者】梁鑫淼, 郭秀潔, 張秀莉, 郭志謀, 豐加濤, 肖遠勝 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所