專利名稱：一種含抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑及制備方法和IgY全效牙膏的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及口腔用品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑及其制備方法和含抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預(yù)防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。
背景技術(shù)：
我國3飛歲兒童患齲率為25. 499Γ92. 72%，成人患齲率為40. 37%。其中變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌是主要致齲菌。細(xì)菌感染性疾病的發(fā)生，首先是通過細(xì)菌表面結(jié)合的粘附素與其存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)中相應(yīng)的受體發(fā)生特異性結(jié)合而定居于機(jī)體內(nèi)的特定器官。變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌的感染正是利用食物中的蔗糖合成大量的胞外多糖構(gòu)成牙菌斑的間質(zhì)，有助于細(xì)菌對牙面的附著及細(xì)菌間的相互附著，形成菌斑。 人們一直期望通過抑制變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌的毒性來達(dá)到防齲的目的。近幾年抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌IgY作為一種新型的生物防齲物質(zhì)受到廣泛關(guān)注。目前用于預(yù)防齲病的牙膏一般為含氟牙膏，在清除口腔致齲菌的同時也破壞了口腔內(nèi)維持微生態(tài)平衡的有益菌，
此外，我國牙齦、牙周疾病發(fā)病率占人口的70%以上，牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingival is)是慢性銀緣炎、慢性牙周炎、侵襲性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能夠與口腔上皮細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶結(jié)合，侵入牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，逃避免疫清除。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生二肽酰氨肽酶降解結(jié)締組織，促進(jìn)MMP-2和MMP-I活性增加。牙齦卟啉單胞菌的精氨酸和賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(1^^、1^^、1^ )能水解1^-12導(dǎo)致1剛￥產(chǎn)生減少。部分牙齦卟啉單細(xì)胞毛能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)L-Ia、L-li3、L_6、TNF°導(dǎo)致牙槽骨破壞。在牙周病患者同時伴隨著口臭的發(fā)生，其口臭主要有具核梭桿菌引起。目前沒有有效的治療口臭的方法，使用抗菌素類藥物治療口臭有很多弊端。
對于預(yù)防和治療牙周病和口臭從主要的病因菌牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌中著手是關(guān)鍵所在。
目前用于預(yù)防和治療牙周炎的牙膏一般為含有中草藥成分的牙膏。雖然這類的專利有很多，但均無明確療效。
現(xiàn)有文獻(xiàn)報道表明臨床上使用特異性IgY抗體預(yù)防齲齒和治療嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉，預(yù)防肺纖維化患者綠膿桿菌感染，減輕幽門螺桿菌引起的胃痛效果顯著，且無副作用和成癮性。
在我們研究的許多種類的IgY中發(fā)現(xiàn)，有的牙周病因菌免疫母雞產(chǎn)生的IgY抗體經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明沒有或沒有明顯的抑制牙周病和口臭的趨勢和療效。簡單的說，不是所有的IgY 都有明顯的治療作用。
由于牙周病和口臭的可疑病因菌有i^一種之多，但主要的可疑病因菌包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌等。在探索制備對應(yīng)的IgY用于治療牙周病和口臭的同時，我們推測牙齦卟啉單胞菌、 具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌都有可能引起牙周病和口臭；因?yàn)槲覀兪孪葻o法預(yù)測在這當(dāng)中的哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。
我們認(rèn)為必須有合適的抗牙周病和口臭的試驗(yàn)來確定哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素。從而指導(dǎo)制備抗牙周病和口臭的藥物或衛(wèi)生產(chǎn)品。
目前的現(xiàn)有技術(shù)沒有相關(guān)的提示指導(dǎo)技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合IgY是解決治療牙周病及其口臭的關(guān)鍵。
技術(shù)人員無法預(yù)先在不做抗牙周病和口臭的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。
技術(shù)人員無法預(yù)先在不做抗牙周病和口臭的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合IgY比單獨(dú)的抗牙齦卟啉單胞菌IgY、單獨(dú)的抗具核梭桿菌IgY的效果更好。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種含抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三在于提供一種含抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預(yù)防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。
作為本發(fā)明第一方面的抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10 70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫產(chǎn)蛋母雞而制備。
作為本發(fā)明第二方面的抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟
A.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌培養(yǎng)步驟
A. I細(xì)菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S. mutans)MT8148菌株和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株， 分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢瑁⑹褂帽姿嵴{(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°c凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用INNaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
上述抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，在所述步驟D后增加一 IgY純化步驟，具體是將變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑純品。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液， 添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
作為本發(fā)明第三方面的含有上述抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏，包含有由抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑構(gòu)成的抗致病菌制劑，所述抗致病菌制劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成
抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合特異性IgY抗體和抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體按1:1質(zhì)量比混合后的制劑O. 1-3. 0%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油I.0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑、抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性 IgY抗體制劑的保護(hù)劑。
在本發(fā)明所述牙膏的一個優(yōu)選實(shí)施例中，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成卡波浦爾O. I O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 I. 3%、卡拉膠O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜 O. I O. 5% ;糖精鈉 O. I O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%, PEG-12000. 5 5. 0%，椰油酰胺丙基甜菜堿O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, SiO2L O 30%,去離子水余量。
本發(fā)明用于預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏對預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭病菌具有明顯的效果。
本發(fā)明的預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏區(qū)別于含氟牙膏的優(yōu)勢即在清除口腔致齲菌的同時還保護(hù)了口腔內(nèi)維持微生態(tài)平衡的有益菌，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)預(yù)防齲病方法的不足之處。
本發(fā)明的預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏用于預(yù)防變形鏈球菌、 遠(yuǎn)緣鏈球菌以及與其有共同抗原決定簇的厭氧菌引起的齲齒、牙齦炎和由牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌以及與其有共同抗原決定簇的厭氧菌引起的牙周炎及口臭等。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方案。下面實(shí)施例所涉及的菌種皆由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。
實(shí)施例I :
抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌培養(yǎng)步驟
A. I細(xì)菌種類細(xì)菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S.mutans)MT8148菌株和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus) 6715菌株，分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片;
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用INNaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY純品經(jīng)ELISA方法測定，抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為 1:1280000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:1280000/mg蛋白。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實(shí)施例2
抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌培養(yǎng)步驟
A. I細(xì)菌種類細(xì)菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S. mutans)MT8148菌株和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株， 分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼， 打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右， 用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY純品經(jīng)ELISA方法測定，抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為 1:1280000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:1280000/mg蛋白。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實(shí)施例3
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟
A. I細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)；
A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株， 分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經(jīng)ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實(shí)施例4
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟
A. I細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)；
A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株， 分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼， 打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至 5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右， 用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經(jīng)ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實(shí)驗(yàn)例I :
變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原；牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合免疫原按本發(fā)明的方法免疫產(chǎn)蛋母雞，取第一次免疫后30天免疫雞蛋，并按本發(fā)明的方法制備出抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體的提取物和抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體的提取物，應(yīng)用ELISA方法測定抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體結(jié)合不同抗原的生物學(xué)效價(見表I):
表I抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體的提取物、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體的提取物的效價
權(quán)利要求
1.抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10 70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫廣蛋母雞而制備。
2.權(quán)利要求I所述的抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌培養(yǎng)步驟 A. I細(xì)菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)； A.2取變形鏈球菌(S. mutans)MT 8148菌株和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株，分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片； B.免疫原制備步驟 B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原； B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億； B.3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億； C.免疫步驟 使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原,然后姆隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次； D.變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備 收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置_20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟D后増加一IgY純化步驟，具體是將變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑純品。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水こ酸鈉調(diào)節(jié)PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至.7. 0-8. 0，置-20°C保藏。
5.含有抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預(yù)防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏，包含有由抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑構(gòu)成的抗致病菌制劑，所述抗致病菌制劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成 抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合特異性IgY抗體和抗變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體按1:1質(zhì)量比混合后的制劑O. 1-3. 0%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油.I.0-30. 0%、聚こ烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚こ烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑、抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的保護(hù)劑。
6.如權(quán)利要求5所述的牙膏，其特征在于，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成卡波浦爾O. I O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 I. 3%、卡拉膠.O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜O. I .O. 5% ;糖精鈉O. I O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%, PEG-12000. 5 5. 0%，椰油酰胺丙基甜菜堿.O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, SiO2L O 30%,去離子水余量。
全文摘要
本發(fā)明公開的抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10～70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30～90重量份的遠(yuǎn)緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫產(chǎn)蛋母雞而制備。本發(fā)明還公開了該抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法以及含有抗變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預(yù)防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。本發(fā)明用于預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏對預(yù)防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭病菌具有明顯的效果。
文檔編號C07K16/12GK102973939SQ201210398690
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者陳健芬, 羅鑫龍, 孫曉青, 張萍 申請人:上海美加凈日化有限公司