專利名稱：一種制備端粒酶多肽疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備端粒酶多肽疫苗GV1001的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種威脅人類生命健康的常見病。目前的手術(shù)治療、放射治療、藥物治療等方法對一些惡性腫瘤的治療效果不顯著，治后副作用大。研究證實，端粒酶的激活、端粒長度的調(diào)節(jié)與腫瘤形成有密切的關(guān)系，在腫瘤治療過程中具有高度的特異性。近年來對端粒酶表達(dá)與腫瘤形成和發(fā)展之間的關(guān)系有很多報道，以端粒酶為靶點的腫瘤治療已經(jīng)取得良好的進(jìn)展。1999年，世界專利W000/02581公開了一系列包括GV1001在內(nèi)的來自端粒酶的抗原多肽。GV1001分子結(jié)構(gòu)式為L_谷氨酰-L-丙氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨 酰~L_売氨酰-L-売氨酰-L-蘇氨酰-L-絲氨酰-L-精氨酰-L-売氨酰-L-精氨酰-L-苯丙氨酰-L-異亮氨酰-L-脯氨酰-L-賴氨酸。GV1001是一種人工合成的端粒酶多肽疫苗，最初由丹麥Pharmexa公司研發(fā)，已證實可用于治療胰腺癌、非小細(xì)胞性肺癌和肝細(xì)胞性肝癌，目前上述研究分別進(jìn)入III期臨床、II期臨床和II期臨床，在歐洲和美國均獲得治療胰腺癌的孤兒藥地位。GV1001是目前唯一一種進(jìn)入臨床研究的基于端粒酶的HLA (人白細(xì)胞相關(guān)抗原)-II型多肽疫苗，能同時激活CD4+和CD8+響應(yīng)。該多肽的結(jié)合域能結(jié)合多種基于端粒酶的HLA-II型分子和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位。一些研究結(jié)果表明GV1001相關(guān)表位能自然的進(jìn)行免疫原性反應(yīng)。目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于GV1001合成工藝方法的詳細(xì)報道，中國專利CN100376290C提出以固相合成、酶促裂解、重組表達(dá)等方法制備，列出了連續(xù)流固相肽合成法合成該多肽，采用五氟苯基酯、TBTU或DIC活化，清除劑采用95% TFA,但專利中僅僅簡單介紹了一種通用的固相多肽合成方法，未提供詳細(xì)的技術(shù)過程，未列出產(chǎn)品純度、產(chǎn)率等重要數(shù)據(jù)。本專利首次詳細(xì)批露該多肽的固相合成方法及相應(yīng)的產(chǎn)品信息，優(yōu)選采用TFA用量更小的切割試劑，對環(huán)境更為友好，該方法能用于工業(yè)化生產(chǎn)制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一條適當(dāng)?shù)腇moc固相合成法合成端粒酶多肽疫苗GV1001的路線，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低、操作方便、對環(huán)境影響小、收率高。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案
一種制備端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，其特征在于，包括以下步驟
1)由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成樹脂為起始原料，反應(yīng)得到Fmoc-L-Lys (Boc)-樹脂；
2)將Fmoc-L-Lys(Boc)-樹脂采用Fmoc固相合成方法按端粒酶多肽疫苗GV1001的多肽序列逐一偶聯(lián)得到含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GV1001-樹脂；
3)裂解含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GV1001-樹脂，純化、凍干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。
其中所述固相合成樹脂包括但不限于CTC樹脂、WANG樹脂或HMPA樹脂。所述固相合成樹脂擔(dān)載量為O. I mmol/g-1. 6 mmol/g,優(yōu)選樹脂擔(dān)載量為O. 5mmoI /g-1. O mmol/g。其中，所述的步驟I為Fmoc-L-Lys (Boc) -OH和CTC樹脂在有機堿的作用下，在反應(yīng)溶劑中生成Fmoc-L-Lys (Boc) -CTC樹脂；所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF。所述的步驟I也可以采用Fmoc-L-Lys (Boc) -OH在催化劑和偶聯(lián)劑存在下，在反應(yīng)溶劑中和WANG樹脂或HMPA樹脂生成Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG樹脂或Fmoc-L-Lys (Boc) -HMPA樹脂；所述的催化劑為DMAP，所述的偶聯(lián)劑包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有機堿、HBTU/HOBt/ 有機堿、TBTU/HOBt/ 有機堿或 PyBOP/HOBt/有機堿；所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF ;所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA。
所述的步驟2中，F(xiàn)moc-L-Lys (Boc)-樹脂經(jīng)過重復(fù)的脫保護(hù)及與各Fmoc·保護(hù)氨基酸在反應(yīng)溶劑中在偶聯(lián)劑和有機堿的作用下偶聯(lián)，生成側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂；所述的偶聯(lián)劑包括 DCC/HOBt、DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/ 有機堿、HBTU/HOBt/有機堿、HATU/HOAt/有機堿或TBTU/HOBt/有機堿；所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF。Fmoc保護(hù)氨基酸依次為Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。所述步驟3中，裂解含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GVlOOl-樹脂采用的裂解試劑為TFA/H20、TFA/H20/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT 或 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT ；優(yōu)選體積比為 90/5/3/2 的 TFA/thioanisole/anisole/EDT，或體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 的TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。
更具體的，本發(fā)明所述的制備方法優(yōu)選包括如下步驟
所述的步驟I :將CTC樹脂置于反應(yīng)器中，經(jīng)NMP和/或DMF洗滌溶脹；在相當(dāng)于CTC樹脂擔(dān)載量O. 5-2倍量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH中加入體積為足以溶解上述溶質(zhì)的NMP和/或DMF，完全溶解后再加入相當(dāng)于Fmoc-L-Lys (Boc) -OH用量4倍量的DIPEA，混合后一起投至反應(yīng)器中反應(yīng)O. 5-10h,反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌得Fmoc-L-Lys (Boc) -CTC 樹脂?；蛩龅牟襟EI為將WANG樹脂或HMPA樹脂置于反應(yīng)器中，經(jīng)NMP和/或DMF洗滌溶脹；在相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Lys (Boc) -OH中加入相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的偶聯(lián)劑，并加入體積為足以溶解上述溶質(zhì)的NMP和/或DMF，完全溶解后加入反應(yīng)器；并將相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量O. 01-0. 2倍量的DMAP加至反應(yīng)器中反應(yīng)l_20h ;所述的偶聯(lián)劑包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有機堿、HBTU/HOBt/ 有機堿、TBTU/HOBt/ 有機堿或 PyBOP/HOBt/有機堿；所述的有機堿為TMP、NMM或DIPEA ;反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗漆得 Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG 樹脂或 Fmoc-L-Lys (Boc) -HMPA 樹脂。所述的步驟2為將體積比1:4的哌啶NMP溶液加至Fmoc-L-Lys (Boc)-樹脂中進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)；產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌后加入混合均勻的相當(dāng)于樹脂用量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Ρ -ΟΗ、足以溶劑各種溶質(zhì)的反應(yīng)溶劑及相當(dāng)于樹脂用量I. 5_10倍量的偶聯(lián)劑，反應(yīng)1-10 h ;反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌產(chǎn)物；以其他Fmoc保護(hù)氨基酸取代Fmoc-L-PiO-OH重復(fù)進(jìn)行上述操作最后得到側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂；所述其他 Fmoc 保護(hù)氛基酸依次為Fmoc-L-Ile_0H、Fmoc-L-Phe-OH> Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H>Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-Thr (tBu) -0H>Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H>Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH ;所述的偶聯(lián)劑包括 DCC/HOBt、DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/有機堿、HBTU/HOBt/有機堿、HATU/HOAt/有機堿或TBTU/HOBt/有機堿；所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF。所述的步驟3為向含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GVlOOl-樹脂中加入體積比為82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT 的裂解試劑，冰浴反應(yīng) O. 1-1 h 后，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1-10 h，然后抽濾。抽濾后將裂解試劑濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和/或N2氣吹至無TFA溢出，加入沉淀試劑靜置；離心分離沉淀的粗肽，粗肽經(jīng)純化、凍干得端粒酶多肽疫苗GVlOOl。 該步驟中，對含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GVlOOl-樹脂進(jìn)行裂解、沉淀得到的粗肽，其沉淀試劑包括乙醚、環(huán)己烷、石油醚、乙醚/石油醚(體積比為1:10-10:1)、乙醚/環(huán)己烷(體積比為1:10-10:1)，優(yōu)選乙醚或體積比為1:1的乙醚/石油醚，更優(yōu)選冰乙醚。所述端粒酶多肽疫苗GVlOOl是通過對含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GVlOOl-樹脂進(jìn)行裂解，得到的粗肽經(jīng)過高效液相色譜純化、凍干得到。此外，本發(fā)明中，縮略語的解釋如下
NMM N-甲基嗎啡啉。DIC N, N’ - 二異丙基碳二酰亞胺。DCC N, N' - 二環(huán)己基碳二酰亞胺。DBC :2，6-二氯苯甲酰氯。HBTU :苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽。TBTU :0-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸鹽。HOBt :1_羥基苯并三氮唑。HATU :2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯。HOAt :1_羥基-7-偶氮苯并三氮唑。DMAP :4- 二甲氨基吡啶。DMF : 二甲基甲酰胺。NMP :1-甲基-吡咯烷酮。DCM: 二氯甲烷。TFA:三氟乙酸。DIPEA N, N- 二異丙基乙基胺。TMP :2，4，6_ 三甲基吡啶。TIS :三異丙基硅烷。Thioanisole :甲基苯基硫釀。
Anisole :苯甲釀。EDT :1，2-乙二硫醇。Phenol :苯酌·。h為時間單位小時。CTC 樹脂
權(quán)利要求
1.一種制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，包括以下步驟 1)由Fm0c-L-Lys(B0c)-OH和固相合成樹脂為起始原料，反應(yīng)得到Fmoc-L-Lys (Boc)-樹脂； 2)將Fmoc-L-Lys(Boc)-樹脂采用Fmoc固相多肽合成方法按端粒酶多肽疫苗GVlOOl的多肽序列逐一偶聯(lián)得到側(cè)鏈基 團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂； 3)裂解側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂，純化、凍干得到端粒酶多肽疫苗GVlOOl； 其中所述固相合成樹脂包括但不限于CTC樹脂、WANG樹脂或HMPA樹脂；所述端粒酶多肽疫苗 GVlOOl 的序列為H-L-Glu-L-Ala-L-Arg-L-Pro-L-Ala-L-Leu-L-Leu-L-Thr-L-Ser-L-Arg-L-Leu-L-Arg-L-Phe-L-IIe-L-Pro-L-LyS-OH0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述固相合成樹脂的擔(dān)載量為O. I mmol/g-1. 6 mmol/g,優(yōu)選固相合成樹脂的擔(dān)載量為O. 5 mmol/g-1. O mmoI/gn
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟I中，F(xiàn)moc-L-Lys (Boc)-OH和CTC樹脂在有機堿的作用下，在反應(yīng)溶劑中生成Fmoc-L-Lys (Boc) -CTC樹脂；所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應(yīng)溶劑包括NMP 和 / 或 DMF。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟I中，F(xiàn)moc-L-Lys (Boc)-OH在催化劑和偶聯(lián)劑存在下，在反應(yīng)溶劑中和WANG樹脂或HMPA樹脂生成Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG樹脂或Fmoc-L-Lys (Boc) -HMPA樹脂；所述的催化劑為DMAP，所述的偶聯(lián)劑包括 DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有機堿、HBTU/HOBt/有機堿、TBTU/HOBt/有機堿或PyB0P/H0Bt/有機堿；所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF ;所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟2中,Fmoc-L-Lys (Boc)-樹脂經(jīng)過重復(fù)的脫保護(hù)及與各Fmoc保護(hù)氨基酸在反應(yīng)溶劑中在偶聯(lián)劑的作用下偶聯(lián)，生成側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂；所述的偶聯(lián)劑包括DCC/H0Bt、DIC/H0Bt,PyB0P/H0Bt/ 有機堿、HBTU/HOBt/ 有機堿、HATU/HOAt/ 有機堿或 TBTU/HOBt/ 有機堿；所述的有機堿包括TMP、NMM或DIPEA ;所述的反應(yīng)溶劑包括NMP和/或DMF ;所述的Fmoc保護(hù)氛基酸依次為Fmoc-L-Pro-0H、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH> Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H>Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-Thr (tBu) -0H>Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H>Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述步驟 3 中，裂解試劑為TFA/H20、TFA/H20/TIS、TFA/thioanisole/anisole/EDT 或 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT ；優(yōu)選體積比為 90/5/3/2 的 TFA/thioanisole/anisole/EDT，或體積比為 82. 5/5/5/5/2. 5 的 TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟I為將CTC樹脂置于反應(yīng)器中，經(jīng)NMP和/或DMF洗滌溶脹；在相當(dāng)于CTC樹脂擔(dān)載量O. 5-2倍量的Fmoc-L-Lys (Boc) -OH中加入體積為足以溶解上述溶質(zhì)的NMP和/或DMF，完全溶解后再加入相當(dāng)于Fmoc-L-Lys (Boc) -OH用量4倍量的DIPEA，混合后一起投至反應(yīng)器中反應(yīng)O. 5-10h，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌得Fmoc-L-Lys (Boc)-CTC樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述制備端粒酶多肽疫苗GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟I為將WANG樹脂或HMPA樹脂置于反應(yīng)器中，經(jīng)NMP和/或DMF洗滌溶脹；在相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Lys (Boc) -OH中加入相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的偶聯(lián)劑，并加入體積為足以溶解上述溶質(zhì)的NMP和/或DMF，完全溶解后加入反應(yīng)器；并將相當(dāng)于WANG樹脂或HMPA樹脂擔(dān)載量O. 01-0. 2倍量的DMAP加至反應(yīng)器中反應(yīng)l_20h ;所述的偶聯(lián)劑包括DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/ 有機堿、HBTU/HOBt/ 有機堿、TBTU/HOBt/ 有機堿或 PyBOP/HOBt/ 有機堿；所述的有機堿為TMP、NMM或DIPEA ;反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌得Fmoc-L-Lys (Boc) -WANG 樹脂或 Fmoc-L-Lys (Boc) -HMPA 樹脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述制備GVlOOl的方法，其特征在于所述的步驟2為將體積比1:4的哌唳NMP溶液加至Fmoc-L-Lys(Boc)-樹脂中進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌后加入混合均勻的相當(dāng)于樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的Fmoc-L-Pro-OH、足以完全溶解各溶質(zhì)的反應(yīng)溶劑及相當(dāng)于樹脂擔(dān)載量I. 5-10倍量的偶聯(lián)劑,反應(yīng)1-10 h ；反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)甲醇、NMP和/或DMF洗滌產(chǎn)物；以其他Fmoc保護(hù)氨基酸取代Fmoc-L-Pro-OH重復(fù)進(jìn)行上述操作最后得到側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GVlOOl-樹脂；所述其他Fmoc保護(hù)氨基酸依次為Fmoc-L-Ile_0H、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-Thr (tBu) -0H> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -OH> Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu) -OH ;所述的偶聯(lián)劑包括 DCC、DIC、DBC、DCC/HOBt、DIC/HOBt、HATU/HOAt/有機堿、HBTU/HOBt/有機堿、TBTU/HOBt/有機堿或PyBOP/HOBt/有機堿；所述的有機堿為TMP、NMM 或 DIPEA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述的步驟3為向含側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的GVlOOl-樹脂中加入體積比為90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT,或體積比為82. 5/5/5/5/2. 5的TFA/thioanisole/H20/phenol/EDT的裂解試劑，冰浴反應(yīng).O.I-Ih后，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1-ioh，然后抽濾，抽濾后將裂解試劑濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和/或N2氣吹至無TFA溢出，加入沉淀試劑靜置；離心分離沉淀的粗肽，粗肽經(jīng)純化、凍干得端粒酶多肽疫苗GVlOOl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備端粒酶多肽疫苗GV1001的方法，包括以下步驟1)由Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和固相合成樹脂為起始原料，反應(yīng)得到Fmoc-L-Lys(Boc)-樹脂；2)將Fmoc-L-Lys(Boc)-樹脂采用Fmoc固相合成方法按GV1001的多肽序列順序逐一偶聯(lián)得到側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GV1001-樹脂；3)采用裂解試劑裂解側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)的GV1001-樹脂，加入沉淀試劑沉淀得到粗肽；粗肽經(jīng)過純化、凍干得到端粒酶多肽疫苗GV1001。本發(fā)明采用的制備端粒酶多肽疫苗GV1001的工藝方法具有實際的工業(yè)化應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟實用價值。
文檔編號C07K1/06GK102875657SQ20121040366
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者朱頤申, 周云隆, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學(xué)