專利名稱：一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝的制作方法
一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝技術領域
本發(fā)明屬于金絲桃苷的提取制備技術領域，具體涉及一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝。
背景技術：
刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus ( Rupr. etMaxim. ) Harms 的干燥根及根莖，莖、葉也可作藥用。主要分布在我國東北、華北、資源十分豐富。刺五加化學成分主要有苷類、木質(zhì)素類、黃酮類、多糖、微量元素及氨基酸。在祖國醫(yī)藥學中，刺五加做為藥物廣泛應用已有悠久歷史，是一個典型的固本強壯藥物。現(xiàn)代藥理研究表明刺五加可增強機體非特異性防御能力，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗損傷及抗疲勞作用外,還可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱等癥。
目前，隨著人民物質(zhì)文化生活水平的提高，人們的保健意識逐漸增強，刺五加的需求量與日劇增，全國年需求量達500萬公斤以上。以其為原料的產(chǎn)品如刺五加片、刺五加注射液、刺五加顆粒、刺五加膠囊、安神補腦膠囊、腦安片等深受國內(nèi)外歡迎，其中刺五加膠囊是以刺五加莖葉提取物為為原料的制劑，主要成分為黃酮類化合物，其中金絲桃苷為刺五加葉的主要活性成分。金絲桃苷分子式C21H2tlO12，分子量464. 38，具有多種生理活性。另外中醫(yī)處方對刺五加需求量也較大，使刺五加的市場供應日趨緊張?；谝陨现T多因素，近年來刺五加在化學成分、藥理作用、臨床療效方面的研究均取得可喜進展，刺五加制劑類型不斷增加，尋求簡便高效的刺五加提取工藝及藥理活性成分已成為目前醫(yī)藥研發(fā)領域中的重要課題之一。
目前獲得有效成分的手段均是應用經(jīng)典的提取分離方法，即選擇不同極性的有機溶劑作為提取溶媒，獲得不同極性的組分，不同組分再經(jīng)過硅膠柱進行單體化合物的分離， 傳統(tǒng)方法消耗有機溶劑量大，投入大，污染嚴重，而且有機試劑對人身體健康不益。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種降低生產(chǎn)成本、減小污染的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案如下一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，包括以下步驟(I)、取刺五加葉粗粉(40-60目)，加入其質(zhì)量2-3倍量的水，然后加入質(zhì)量比(2-3) :1 的纖維素酶和果膠酶的混合物使其達到O. 2-0. 3mg/ml,調(diào)節(jié)pH至4. 0-5. O,加熱至 40-60°C，酶解I. 5-2h，然后升溫至70-80°C滅活，得酶解液；(2 )、將酶解液中加入90-95%乙醇，浸泡后，滲漉提取，收集滲漉液，回收乙醇，得到濃縮液；(3)、將濃縮液加其質(zhì)量2-3倍量的水稀釋，過濾得上清液；(4)、將上清液上大孔吸附樹脂，水洗后，70-75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，減壓3干燥，得濃縮粉；(5)、將濃縮粉上反相樹脂柱層析，20-30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶， 再用甲醇重結(jié)晶得到金絲桃苷。
優(yōu)選地，步驟(2)中，將酶解液中加入其質(zhì)量6-8倍量的90-95%乙醇，浸泡l_2h。
優(yōu)選地，步驟(4)中，所述大孔吸附樹脂為HPD600或DlOl ;步驟(5)中，所述反相樹脂柱為JTY-I。
進一步地，所述刺五加葉為仿生栽培品。
優(yōu)選地，步驟(I)中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0-5. O。所述稀鹽酸的質(zhì)量濃度為 8-12%。
本發(fā)明產(chǎn)品金絲桃苷具有抗炎、解痙、利尿、止咳、降壓、降低膽固醇、蛋白同化、局部和中樞鎮(zhèn)疼以及對心、腦血管的保護作用等多種生理活性，可以制成藥學上可以接受的制劑。
本發(fā)明金絲桃苷提取以刺五加葉為原料，采用酶輔助提取法，以乙醇為溶劑進行洗脫，環(huán)保無污染，操作方便，降低了生產(chǎn)成本，且有效地提高了金絲桃苷的得率，其純度達到98%以上，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步地詳細介紹，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。
以下實施例中乙醇的“％”指體積百分比。
實施例I一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，包括以下步驟(I )、取刺五加Senticosus (Rupr. et Maxim. ) Harms,仿生栽培品)葉40目粗粉lOOOg，加入其質(zhì)量2倍量的蒸餾水，然后加入質(zhì)量比2:1的纖維素酶和果膠酶的混合物使其(指混合物，以下同理)達到O. 2mg/ml，質(zhì)量濃度為10%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 5， 加熱至50°C，酶解2h，然后升溫至70°C滅活，得酶解液；(2)、將酶解液中加入其質(zhì)量7倍量的90%乙醇，浸泡I.5h后，滲漉提取，收集滲漉液至無色，回收乙醇，得到濃縮液；(3)、將濃縮液加其質(zhì)量2倍量的蒸餾水稀釋，過濾得上清液；(4)、將上清液上HPD600大孔吸附樹脂，蒸餾水沖洗至近無色，70%乙醇洗脫至基本無色，收集洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得濃縮粉；(5)、將濃縮粉上JTY-I反相樹脂柱層析，30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶，再用甲醇重結(jié)晶得到淡黃色結(jié)晶粉末4. 78g，即金絲桃苷純品(高效液相色譜法測定其純度98%以上)。
實施例2一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，包括以下步驟(I )、取刺五加Senticosus (Rupr. et Maxim. ) Harms,仿生栽培品)葉50目粗粉lOOOg，加入其質(zhì)量2. 5倍量的蒸餾水，然后加入質(zhì)量比2. 5:1的纖維素酶和果膠酶的混合物使其達到0. 25mg/ml，質(zhì)量濃度為8%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，加熱至40°C，酶解2h，然后升溫至75°C滅活，得酶解液；(2)、將酶解液中加入其質(zhì)量8倍量的90%乙醇，浸泡2h后，滲漉提取，收集滲漉液至無色，回收乙醇，得到濃縮液；(3)、將濃縮液加其質(zhì)量2.5倍量的蒸餾水稀釋，過濾得上清液；(4)、將上清液上HPD600大孔吸附樹脂，蒸餾水沖洗至近無色，75%乙醇洗脫至基本無色，收集洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得濃縮粉；(5)、將濃縮粉上JTY-I反相樹脂柱層析，25%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶，再用甲醇重結(jié)晶得到淡黃色結(jié)晶粉末4. 69g，即金絲桃苷純品(高效液相色譜法測定其純度98%以上)。
實施例3一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，包括以下步驟(I )、取刺五加Senticosus (Rupr. et Maxim. ) Harms,仿生栽培品)葉60目粗粉1000g，加入其質(zhì)量3倍量的蒸餾水，然后加入質(zhì)量比3:1的纖維素酶和果膠酶的混合物使其達到O. 3mg/ml，質(zhì)量濃度為12%的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5. 0，加熱至60°C，酶解I.5h，然后升溫至80°C滅活，得酶解液；(2)、將酶解液中加入其質(zhì)量6倍量的95%乙醇，浸泡2h后，滲漉提取，收集滲漉液至無色，回收乙醇，得到濃縮液；(3)、將濃縮液加其質(zhì)量3倍量的蒸餾水稀釋，過濾得上清液；(4)、將上清液上DlOl大孔吸附樹脂，蒸餾水沖洗至近無色后，70%乙醇洗脫至基本無色，收集洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得濃縮粉；(5)、將濃縮粉上JTY-I反相樹脂柱層析，30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶，再用甲醇重結(jié)晶得到淡黃色結(jié)晶粉末4. 86g，即金絲桃苷純品(高效液相色譜法測定其純度98%以上)。
產(chǎn)物鑒定鑒定對象實施例廣3提取所得淡黃色結(jié)晶粉末。
鑒定I :熔點227 229°C，易溶于乙醇、甲醇、丙酮。
鑒定2 :與鹽酸-鎂粉反應，生成櫻紅色。
鑒定3 :硅膠薄層層析斑點在365nm紫外燈下呈棕黃色，10% (v/v)硫酸乙醇溶液噴霧后105°C烤板顯亮黃色，Rf值與金絲桃苷標準品的Rf值一致。
鑒定4 UV(CH3OH)nm:258 及 362 ；IR(KBr) cm-1 3420 (OH)，1650 (C=O)，1605 (C=C)， 1086 (C-O) ； 1HNMR(DMS0-d6) :12. 60 (1H, s’ OH), 7. 67 (1H, d, J=8. 5Hz，6’ _H)，7. 52 (1H, brs, 2’-Η)，6. 81(1H，d, J=8. 5Hz，5’_H)，6. 35 (1H，brs，8_H)，6. 15 (1H, brs,6-H) ,5. 35 (1H, d, J=7. 6Hz, I’ ’ -H) ; 13C-NMR (DMS0-d6) : 177. 2 (4_C)，161. 0 (7_C)，161. 0 (5_C)，156. 2 (9-或 2-C) 155. 9 (9-C 或 2-C)，148. 5 (4，_C)，144. 7 (3，_C)，133. 2 (3_C)，121. 8 (6，_C)， 120. 9(1，-C) ,115. 7(5，-C) ,115. 0(2，-C)，103. 2(10，-C)，101. 8(1，’ -C) ,98. 8 (6_C)， 93. 5 (8-C)，75. 7 (5，’ _C)，73. 0 (3，’ _C)，71. I (2，’ _C)，67. 7 (4，’ _C)，59. 9 (6，’ _C)。與金絲桃苷標準圖譜數(shù)據(jù)基本一致，確定所得化合物為金絲桃苷(hyperin)。
權利要求
1.一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于包括以下步驟 (1)、取刺五加葉粗粉，加入其質(zhì)量2-3倍量的水，然后加入質(zhì)量比(2-3):1的纖維素酶和果膠酶的混合物使其達到O. 2-0. 3mg/ml，調(diào)節(jié)pH至4. 0-5. O,加熱至40_60°C，酶解I.5-2h，然后升溫至70-80°C滅活，得酶解液； (2)、將酶解液中加入90-95%乙醇，浸泡后，滲漉提取，收集滲漉液，回收乙醇，得到濃縮液； (3)、將濃縮液加其質(zhì)量2-3倍量的水稀釋，過濾得上清液； (4)、將上清液上大孔吸附樹脂，水洗后，70-75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得濃縮粉； (5)、將濃縮粉上反相樹脂柱層析，20-30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶，再用甲醇重結(jié)晶得到金絲桃苷。
2.如權利要求I所述的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于步驟(2)中，將酶解液中加入其質(zhì)量6-8倍量的90-95%乙醇，浸泡l_2h。
3.如權利要求I所述的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于步驟(4)中，所述大孔吸附樹脂為HPD600或DlOl ;步驟(5)中，所述反相樹脂柱為JTY-1。
4.如權利要求1-3之任意一項所述的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于所述刺五加葉為仿生栽培品。
5.如權利要求1-3之任意一項所述的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于步驟(I)中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0-5.0。
6.如權利要求5所述的刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝，其特征在于所述稀鹽酸的質(zhì)量濃度為8-12%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺五加葉中金絲桃苷的酶輔助提取工藝。取刺五加葉粗粉，加入其質(zhì)量2-3倍量的水，然后加入質(zhì)量比(2-3):1的纖維素酶和果膠酶的混合物使其達到0.2-0.3mg/ml，調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，加熱至40-60℃，酶解1.5-2h，然后升溫至70-80℃滅活；加入90-95%乙醇，浸泡后，滲漉提取，收集滲漉液，回收乙醇，得到濃縮液；將濃縮液加其質(zhì)量2-3倍量的水稀釋，過濾得上清液；將上清液上大孔吸附樹脂，水洗后，70-75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得濃縮粉；將濃縮粉上反相樹脂柱層析，20-30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得粗結(jié)晶，甲醇重結(jié)晶得到金絲桃苷。本發(fā)明以刺五加葉為原料，采用酶輔助提取法，以乙醇為溶劑進行洗脫，環(huán)保無污染，操作方便，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C07H17/07GK102977164SQ201210435578
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權日2012年11月5日
發(fā)明者李攀登, 梁軍, 李坤鵬 申請人:河南牧翔動物藥業(yè)有限公司