一種分離純化石杉堿甲的常壓柱色譜組合法
【專利摘要】一種在常壓下采用堿性氧化鋁和硅膠柱色譜組合法分離純化石杉堿甲的方法，適用于草藥蛇足石杉的粗提物，其中石杉堿甲含量不低于1％。具體工藝為：先用堿性氧化鋁柱分離純化蛇足石杉粗提物，填料粒度100-200目或200-300目，干法裝柱，徑高比1:8～1:30，干法上樣，上樣比例1:10-100，氯仿一甲醇（80:1～8:1）洗脫，合并含石杉堿甲的流份，上硅膠柱繼續(xù)分離。硅膠柱工藝參數(shù)：填料粒度100-200目或200-300目，濕法裝柱，徑高比1:8～1:30，濕法上樣，上樣比例1:10-100，氯仿一甲醇（80:1～8:1）洗脫。所得產(chǎn)物經(jīng)丙酮重結(jié)晶即可獲得成品。本工藝路線經(jīng)濟實用、便于產(chǎn)業(yè)化。
【專利說明】一種分離純化石杉堿甲的常壓柱色譜組合法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從草藥蛇足石杉中分離高純度石杉堿甲的方法，具體涉及一種在常壓下采用堿性氧化鋁和硅膠柱色譜組合法分離純化高純度石杉堿甲的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]石杉堿甲是我國學(xué)者從草藥蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trve.)中分離得到的一種生物堿，藥理試驗顯示它是高效、可逆、低毒性的乙酰膽堿酶抑制劑，具有提高記憶的功能。1995年，石杉堿甲在國內(nèi)上市應(yīng)用于治療阿爾茲海默癥(AD)，商品名哈伯因。1997年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)其作為食品添加劑或營養(yǎng)保健品在美國銷售。
[0004]石杉堿甲在蛇足石杉中的含量僅萬分之幾，且蛇足石杉本身生長周期長，對生長環(huán)境要求高，不便大量人工栽培。而人工合成的制備工藝目前還無法用于工業(yè)化的放大生產(chǎn)，因此從植物中分離制備仍然是獲得它的主要途徑。
[0005]現(xiàn)已有一些有關(guān)石杉堿甲制備的文獻報道。
[0006]《從植物中提取石杉堿甲的工藝》(中國專利，CN200610017954.9)與本發(fā)明方法最為接近。它采用提取原液經(jīng)氯仿萃取后，萃取物上硅膠柱色譜分離，乙醇氯仿溶液洗脫，所得含石杉堿甲的流份經(jīng)丙酮重結(jié)晶3~4次，得石杉堿甲成品。與本發(fā)明主要采用的填料堿性氧化鋁相比，其全程采用的分離填料硅膠載樣量明顯偏小，僅為堿性氧化鋁的1/4左右，而價格卻是堿性氧化鋁的2倍以上，生產(chǎn)成本顯著高于本專利方法；本發(fā)明方法比上述專利多上一根色譜柱，但所獲得的柱層析產(chǎn)物經(jīng)I~2次結(jié)晶即可獲得符合《中國藥典》要求的成品，而上述專利需重結(jié)晶3~4次，一根色譜柱的洗脫周期為I~2天，而一次結(jié)晶的操作周期以2~3天計，上述 專利方法的生產(chǎn)周期卻比本發(fā)明方法的只長不短，在生產(chǎn)時間成本上也處于劣勢。
[0007]文獻還報道了中低壓制備色譜法、制備型高壓液相色譜法、高速逆流色譜法、重結(jié)晶法或上述幾種方法的綜合。以上方法或是依賴于昂貴的色譜填料與儀器設(shè)備，生產(chǎn)成本高昂；或是樣品處理量小，收率低，生產(chǎn)周期長，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是建立一條經(jīng)濟實用、便于產(chǎn)業(yè)化的石杉堿甲制備工藝路線。
[0010]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明適用的原料為草藥蛇足石杉的粗提物，其中石杉堿甲含量不低于I %。
[0011]將粗提物用乙醇或氯仿等有機溶劑溶解，拌入堿性氧化鋁(100-200目)。再按重量比稱取10-100倍量的堿性氧化鋁(100-200目或200-300目)，干法裝柱，徑高比1:8~1:30。粗提物干法上樣后，先用氯仿洗脫3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脫，堿性氧化鋁或硅膠薄層色譜檢測各流份，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏，稱重后，用氯仿溶解成樣品溶液備用。
[0012]再按重量比稱取10-100倍量的硅膠(100-200目或200-300目)，氯仿浸泡過夜后，濕法裝柱，徑高比1:8~1:30。樣品溶液濕法上樣后，先用氯仿洗脫3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脫，硅膠薄層色譜檢測各流份，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸骨。
[0013]上述干浸膏溶于丙酮，靜置過夜后，即可獲得符合《中國藥典》要求的結(jié)晶成品。
[0014]分離過程所得中間產(chǎn)物HPLC檢測的色譜條件為:ZORBAX Eclipse XDB — C18不鎊鋼柱(150mm X 4.6mm , 5Mm) (Agilent Technologies,美國)；流動相:甲醇一0.08mol/L醋酸銨溶液(32: 68，用冰醋酸調(diào)pH值至6.0);流速:I ml/ min ;檢測波長:310 nm;柱溫:30 °C。
[0015]所得成品含量測定的色譜條件遵循《中國藥典》二部，為:Z0RBAX Eclipse XDB—C18 不鎊鋼柱(150mm X 4.6mm , 5Mm) (Agilent Technologies,美國);流動相:憐酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)—乙腈(86: 14);流速:I mL/min;檢測波長:310 nm;柱溫:30 °C。
[0016]本工藝中的石杉堿甲總回收率可達(dá)到80%以上，經(jīng)1-2次結(jié)晶后，所得樣品純度即可符合《中國藥典》的要求。
[0017]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1石杉堿甲(Huperzine A)對照品的HPLC圖譜 圖2蛇足石杉粗提浸膏的HPLC圖譜
圖3堿性氧化鋁柱層析產(chǎn)物的HPLC圖譜 圖4硅膠柱層析產(chǎn)物的HPLC圖譜 圖5石杉堿甲(Huperzine A)對照品的HPLC圖譜 圖6結(jié)晶成品的HPLC圖譜
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明以下結(jié)合實施例做進一步描述，但并不限制本發(fā)明。
[0020]實施例1
取石杉堿甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用乙醇溶解，按樣品/吸附劑1:1的比例拌入100-200目堿性氧化鋁，得拌樣浸膏。再按樣品/填料重量比1:10稱取200-300目的堿性氧化鋁，干法裝柱，徑高比1:8。
[0021 ] 拌樣浸膏干法上樣后，先用氯仿洗脫I倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏，稱重后，用氯仿溶解成樣品溶液備用。
[0022]再按樣品/填料重量比1:10稱取100-200目的硅膠，氯仿浸泡過夜后，濕法裝柱，徑高比1:8。氯仿溶解的樣品溶液濕法上樣后，先用氯仿洗脫3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏。[0023]上述干浸膏按1:5的質(zhì)量體積比溶于丙酮，4°C以下靜置過夜后，即可析出符合《中國藥典》要求的結(jié)晶成品。
[0024]實施例2
取石杉堿甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用甲醇溶解，按樣品/吸附劑1:2的比例拌入100-200目堿性氧化鋁，得拌樣浸膏。再按樣品/填料重量比1:50稱取100-200目的堿性氧化鋁，干法裝柱，徑高比1:15。
[0025]拌樣浸膏干法上樣后，先用氯仿洗脫2倍柱體積，再用氯仿-甲醇(50:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份(HPLC檢測色譜圖見附圖3)，60°C減壓濃縮成干浸膏，稱重后，用氯仿溶解成樣品溶液備用。
[0026]再按樣品/填料重量比1:30稱取200-300目的硅膠，氯仿浸泡過夜后，濕法裝柱，徑高比1:17.5。氯仿溶解的樣品溶液濕法上樣后，先用氯仿洗脫2倍柱體積，再用氯仿-甲醇(24:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份(HPLC檢測色譜圖見附圖4)，60°C減壓濃縮成干浸膏。
[0027]上述干浸膏按1:10的質(zhì)量體積比溶于丙酮，4°C以下靜置過夜后，即可析出符合《中國藥典》要求的結(jié)晶成品(HPLC檢測色譜圖見附圖6)。
[0028]實施例3
取石杉堿甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用甲醇溶解，按樣品/吸附劑1:3的比例拌入100-200目堿 性氧化鋁，得拌樣浸膏。再按樣品/填料重量比1:100稱取100-200目的堿性氧化鋁，干法裝柱，徑高比1:30。
[0029]拌樣浸膏干法上樣后，先用氯仿洗脫3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(8:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份(HPLC檢測色譜圖見附圖3)，60°C減壓濃縮成干浸膏，稱重后，用氯仿溶解成樣品溶液備用。
[0030]再按樣品/填料重量比1:100稱取200-300目的硅膠，氯仿浸泡過夜后，濕法裝柱，徑高比1:30。氯仿溶解的樣品溶液濕法上樣后，先用氯仿洗脫3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(8:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏。
[0031]上述干浸膏按1:20的質(zhì)量體積比溶于丙酮，4°C以下靜置過夜后，即可析出符合《中國藥典》要求的結(jié)晶成品。
[0032]由于在不背離本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容的前提下有許多不同的實施方案，應(yīng)該認(rèn)識到，本發(fā)明的范圍不受上述具體實施例的限制，而僅受權(quán)利要求書的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種在常壓下采用堿性氧化鋁和硅膠柱色譜組合法分離純化高純度石杉堿甲的方法，其特征在于本發(fā)明適用的原料為草藥蛇足石杉的粗提物，其中石杉堿甲含量不低于1%。
2.將權(quán)利要求1所述的粗提物用乙醇或氯仿等有機溶劑溶解，按樣品/吸附劑1:1~1:3的比例拌入100-200目堿性氧化鋁，得拌樣浸膏，再按樣品/填料重量比1:10~1:100稱取100-200目的堿性氧化鋁，干法裝柱，徑高比1:8~1:30。
3.將權(quán)利要求2所述的拌樣浸膏干法上柱，先用氯仿洗脫I~3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏，稱重后，用氯仿溶解成樣品溶液備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中獲得的干浸膏重量，按照樣品/填料重量比1:10~1:100稱取100-200目或200-300目的硅膠，氯仿浸泡過夜后，濕法裝柱，徑高比1:8~1:30 ;將權(quán)利要求3所述的樣品溶液濕法上樣后，先用氯仿洗脫I~3倍柱體積，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脫，收集到的各流份與對照品一起點樣于硅膠薄層板上，用氯仿-甲醇系統(tǒng)展開，合并含石杉堿甲的流份，60°C減壓濃縮成干浸膏。
5.將權(quán)利要求4所述的干浸膏按1:5~1:20的質(zhì)量體積比溶于丙酮，4°C以下靜置過夜后，即可析出符合《 中國藥典》要求的結(jié)晶成品。
【文檔編號】C07D221/22GK103804293SQ201210437662
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】徐朝暉, 阮克鋒, 馮怡 申請人:上海張江中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)工程研究中心