專利名稱：優(yōu)化的Fc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的經(jīng)優(yōu)化的Fe變體、生產(chǎn)它們的工程化方法、及其應(yīng)用，特別是用于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特定抗原的免疫學(xué)蛋白質(zhì)。在大多數(shù)哺乳動物包括人和小鼠中，抗體由成對的重鏈和輕鏈多肽鏈構(gòu)成。每條鏈由個別免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此這樣的蛋白質(zhì)使用通稱免疫球蛋白。每條鏈由稱為可變區(qū)和恒定區(qū)的兩種不同區(qū)組成。輕鏈和重鏈可變區(qū)在抗體間顯示明顯的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示較小的序列多樣性，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白質(zhì)以引發(fā)重要的生化事件。人類有五種不同類別的抗體，包括IgA (其包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (其包括亞類IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4)、和IgM。這些抗體類別之間的區(qū)別性特征是其恒定區(qū)，盡管可變區(qū)中可能存在細(xì)微差異。

圖1顯示了 IgGl抗體，本文用作例子來描述免疫球蛋白的一般結(jié)構(gòu)特征。IgG抗體為四聚體蛋白質(zhì)，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。IgG重鏈由四個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以Vh-Ch1-Ch2-Ch3的順序從N-到C-末端連接，稱為重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)1、重鏈恒定區(qū)2、和重鏈恒定區(qū)3。IgG ChU Ch2、和Ch3結(jié)構(gòu)域也分別稱為恒定區(qū)伽馬I (C Y I)、恒定區(qū)伽馬2 (Cy 2)、和恒定區(qū)伽馬3 (Cy 3)。IgG輕鏈由兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，以的順序從N-到C-末端連接，分別稱為輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)?？贵w的可變區(qū)包含分子的抗原結(jié)合決定簇，因此決定了抗體對其靶抗原的特異性?？勺儏^(qū)如此命名是因?yàn)樗c相同類別內(nèi)的其它抗體在序列上差別最明顯。大多數(shù)序列可變性發(fā)生于互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)?？傆嬘?個⑶R，每條重鏈和輕鏈各三個，稱為Vh⑶R1、Vh⑶R2、Vh⑶R3、Vl⑶R1、VlCDR2、和VlCDR3。⑶R外的可變區(qū)稱為框架(FR)區(qū)。盡管不像CDR那樣多變，但不同抗體間FR區(qū)中的確存在序列可變性?？傮w上，抗體的這種特征性構(gòu)造提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，免疫系統(tǒng)能夠在其上探測到實(shí)質(zhì)性的抗原結(jié)合多樣性(CDR)以獲得對大批抗原的特異性。對于來自不同生物體的多種可變區(qū)片段，可獲得許多高分辨率的結(jié)構(gòu)，一些是非結(jié)合的，一些與抗原 復(fù)合?？贵w可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特征已很好的表征(Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16;Morea et al., 2000, Methods 20:267-279，引入作為參考)，而且抗體的保守性特征已使大量抗體工程技術(shù)的開發(fā)成為可能(Maynardet al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376，引入作為參考)。例如，有可能將來自一種抗體例如鼠抗體的CDR移植到另一種抗體例如人抗體的框架區(qū)上。本領(lǐng)域稱為“人源化”的這一過程使得由非人抗體生成免疫原性更低的抗體治療劑成為可能。包含可變區(qū)的片段能在沒有抗體其它區(qū)時存在，包括例如包含Vh-C Y 1和￥11-(^的抗原結(jié)合片段(Fab)、包含'的可變區(qū)片段(Fv)、包含在同一條鏈中連接在一起的V1^P'的單鏈可變區(qū)片段(scFv)、以及多種其它可變區(qū)片段(Little et al., 2000, Immunol Today21:364-370，引入作為參考)?？贵w的Fe區(qū)與許多Fe受體和配體相互作用，賦予一系列稱為效應(yīng)器功能的重要的功能性能力。對于IgG，如圖1所示，F(xiàn)e區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域C y2和C y3以及通向Cy2的N末端鉸鏈。針對IgG類的一個重要的Fe受體家族為Fe伽馬受體(Fe Y R)。這些受體介導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞分支(arm)之間的通訊(Raghavan et al., 1996, Annu RevCell Dev Biol 12:181-220;Ravetch et al., 2001, Annu Rev TmmunoI 19:275-290)。在人類中，該蛋白質(zhì)家族包括Fe y RI (CD64)，包括同種型Fe y RIa, Fe y Rib、和Fe y RIc ；Fe yRII(CD32)，包括同種型Fe Y RIIa (包括同種異型H131和R131)、Fe Y RIIb (包括 Fe Y RIIb-1 和 FcyRIIb-2)、和 Fe Y RIIc;以及 Fe Y RIII (CD16)，包括同種型Fe yRIIIa(包括同種異型V158和F158)和Fe Y RIIIb (包括同種異型Fe y RIIIb-NAl和Fe y RIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65，引入作為參考)。這些受體典型的具有胞外域、跨膜區(qū)、和胞內(nèi)域，其中胞外域介導(dǎo)與Fe的結(jié)合，胞內(nèi)域可能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一些信號事件。這些受體表達(dá)于多種免疫細(xì)胞中，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜 酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗格漢斯(Langerhans)細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、和、S T細(xì)胞。Fc/Fc Y R復(fù)合體的形成將這些效應(yīng)細(xì)胞募集到結(jié)合抗原的部位，典型的導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號事件和重要的后續(xù)免疫反應(yīng)諸如炎癥介導(dǎo)物的釋放、B細(xì)胞活化、胞吞作用、吞噬作用、和細(xì)胞毒性攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬細(xì)胞的效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的潛在機(jī)制。其中表達(dá)Fe Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞裂解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) (Raghavan et al.，1996，Annu Rev CellDev Biol 12:181-220;Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766;Ravetch etal.，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290，引入作為參考)。其中表達(dá)Fe Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞的吞噬作用的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬(ADCP)。已經(jīng)解析了人Fe Y R胞外域的許多結(jié)構(gòu)，包括Fe yRIIa(pdb 登錄號 1H9V) (Sondermann et al.，2001，J Mol Biol 309:737-749) (pdb 登錄號 1FCG) (Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol6:437-442)、Fe Y RIIb (pdb 登錄號2FCB) (Sondermann et al.，1999，Embo J 18:1095-1103);和 Fe Y RIIIb (pdb 登錄號 1E4J)(Sondermann et al.，2000，Nature406:267-273，引入作為參考)。所有 Fe Y R 結(jié)合 Fe 上的相同區(qū)域，位于C Y 2結(jié)構(gòu)域N末端和前面的鉸鏈，如圖2所示。此相互作用在結(jié)構(gòu)上得到很好的表征(Sondermann et al.，2001，J Mol Biol 309:737-749，引入作為參考)，并且已經(jīng)解析了與人Fe y RIIIb胞外域結(jié)合的人Fe的幾種結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1E4K) (Sondermann etal., 2000, Nature 406:267-273) (pdb 登錄號 IIIS 和 IIIX) (Radaev et al.，2001，J BiolChem 276:16469-16477，引入作為參考)，同樣解析了人IgE Fc/Fc y e RIa復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(pdb 登錄號 1F6A) (Garman et al.，2000，Nature 406:259-266，引入作為參考)。不同IgG亞類對Fe Y R具有不同親和力，典型的，與IgG2和IgG4相比，IgGl和IgG3基本上更好的結(jié)合所述受體。所有Fe Y R結(jié)合IgG Fe上的相同區(qū)域，然而具有不同的親和力:高親和力結(jié)合物Fe Y RI對IgGl的Kd為KT8M'而低親和力受體Fe Y RII和Fe Y RIII通常分別以Kr6和10_5結(jié)合。Fe Y RIIIa和Fe Y RIIIb的胞外域96%相同，然而Fe y RIIIb沒有胞內(nèi)信號域。另外，盡管FcyRI, Fcy RIIa/c、和Fe y RIIIa是免疫復(fù)合物觸發(fā)的活化的正調(diào)節(jié)物，特征為具有含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞內(nèi)域，而Fe YRIIb具有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)，因此是抑制性的。因此，前者稱為活化受體，而Fe Y RIIb稱為抑制受體。所述受體在不同免疫細(xì)胞上的表達(dá)樣式和水平方面也有所不同。另一復(fù)雜性水平是人蛋白質(zhì)組中許多Fe Y R多態(tài)性的存在。具有臨床意義的特別相關(guān)的多態(tài)性是V158/F158FCYRIIIa。與F158同種異型相比，人IgGl以更高親和力結(jié)合V158同種異型。已經(jīng)證明這種親和力差異，以及推測的其對ADCC和/或ADCP的影響是抗 CD20 抗體 rituximab ( Rituxan , IDEC Pharmaceuticals Corporation 的注冊商標(biāo))功效的重要決定因素。V158同種異型患者對rituximab治療反應(yīng)良好；然而，更低親和力F158同種異型患者反應(yīng)很弱(Cartron et al.，2002，Blood 99:754-758，引入作為參考)。大約10-20%的人是V158/V158純合的，45%是V158/F158雜合的，35-45%的人是 F158/F158 純合的(Lehrnbecher et al.，1999，Blood94:4220-4232; Cartron etal.，2002，Blood 99:754-758，引入作為參考)。因此80-90%的人為弱反應(yīng)者，即他們具有至少一個F158Fc YRIIIa等位基因。Fe上交疊但分開的部位，如圖1所示，用作與補(bǔ)體蛋白質(zhì)Clq的接觸面。Fc/Clq結(jié)合以與Fc/Fc Y R結(jié)合介導(dǎo)ADCC相同的方式介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。Clq與絲氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復(fù)合物，以形成Cl復(fù)合物。Clq能夠結(jié)合六個抗體，盡管結(jié)合兩個IgG就足以激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。類似于Fe與Fe Y R的相互作用，不同IgG亞類對Clq具有不同親和力，典型的，與IgG2和IgG4相比，IgGl和IgG3基本上更好的結(jié)合所述FcyR。對于Fc/Clq復(fù)合物，目前沒有可獲得`的結(jié)構(gòu)；然而，誘變研究已將人IgG上Clq的結(jié)合部位定位到牽涉殘基D270、K322、K326、P329、和 P331、以及E333 的區(qū)域(Idusogie et al.，2000，JImmunol 164:4178-4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575，引入作為參考)。如圖1所示，F(xiàn)e上Cy2和Cy3結(jié)構(gòu)域之間的部位介導(dǎo)與初生兒受體FcRn的相互作用，其結(jié)合將內(nèi)吞的(endocytosed)抗體從內(nèi)體(endosome)再循環(huán)回血流(Raghavan etal.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ghetie et al.，2000，Annu Rev Immunol18:739-766，引入作為參考)。與因全長分子的尺寸大而排除腎臟過濾偶聯(lián)，該過程導(dǎo)致范圍為一至三周的良好抗體血清半衰期。Fe與FcRn的結(jié)合在抗體輸送中也扮演關(guān)鍵角色。Fe上FcRn的結(jié)合部位也是細(xì)菌蛋白質(zhì)A和G結(jié)合的部位。在蛋白質(zhì)純化過程中采用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和層析，典型的利用這些蛋白質(zhì)的緊密結(jié)合作為純化抗體的手段。因此，F(xiàn)e上該區(qū)域的保真度對抗體的臨床特性及其純化二者都是重要的?？色@得的大鼠Fc/FcRn復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Martin et al., 2001, Mo I Cell7:867_877，引入作為參考)，以及Fe與蛋白質(zhì)A 和 G 的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Erikssonet al.，1995，Structure 3:265-278;Tashiro et al.，1995，Curr Opin Struct Biol5:471-481，引入作為參考)提供了對Fe與這些蛋白質(zhì)的相互作用的了解。Fe區(qū)的關(guān)鍵特征是發(fā)生在N297的保守性N連接糖基化，如圖1所示。該碳水化合物，或者有時稱為寡糖，對抗體扮演了至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)與功能角色，是抗體必須用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的基本原因之一。盡管不想局限于一種理論，但相信此碳水化合物的結(jié)構(gòu)效果可能是穩(wěn)定或溶解Fe，決定C Y 3與C Y 2結(jié)構(gòu)域之間的特定角度或柔性水平，保持兩個C y 2結(jié)構(gòu)域不跨越中心軸互相聚集，或者上述的組合。Fe與Fe Y R和Clq的有效結(jié)合需要該修飾，并且N297碳水化合物的組成改變或其消除影響與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, BiotechnolBioeng74:288-294;Mimura et al.,2001,J Biol Chem 276:45539-45547;Radaevet al.,2001,J Biol Chem 276: 16478-16483;Shields et al.,2001,J BiolChem276:6591-6604;Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740;Simmons etal.,2002, J Immunol Methods 263:133-147，引入作為參考)。然而該碳水化合物與Fe Y R的特異性接觸很小，若有的話(Radaev et al.，2001，J Biol Chem276:16469-16477，引入作為參考)，表明N297碳水化合物在介導(dǎo)Fc/Fc y R結(jié)合中的功能角色可能是通過其在決定Fe構(gòu)象中扮演的結(jié)構(gòu)角色來發(fā)揮的。 這得到了四種不同F(xiàn)e糖型(glycoform)的一組晶體結(jié)構(gòu)的支持，其顯示寡糖的組成影響C Y 2的構(gòu)象及作為結(jié)果的Fc/Fc Y R接觸面的構(gòu)象(Krapp et al.，2003，J Mol Biol325:979_989，引入作為參考)。以上討論的抗體的特征一對靶物的特異性、介導(dǎo)免疫效應(yīng)器機(jī)制的能力、和長血清半衰期一使抗體成為有力的治療劑。單克隆抗體在治療上用于多種病癥包括癌癥、炎癥、和心血管疾病的治療。目前有超過十種抗體產(chǎn)品在出售，有數(shù)百種在開發(fā)。除了抗體之外，在研究和治療中發(fā)現(xiàn)有越來越多作用的抗體樣蛋白質(zhì)是Fe融合物(Chamow etal.， 1996，Trends Biotechnol14:52-60;Ashkenazi et al.，1997，Curr Opin Immunol9:195-200，引入作為參考)。Fe融合物是其中一種或多種多肽與Fe可操作連接的蛋白質(zhì)。Fe融合物將抗體的Fe區(qū)及因此其有利的效應(yīng)器功能和藥動學(xué)與受體、配體、或其它一些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的靶物結(jié)合區(qū)組合起來。后者的角色是介導(dǎo)靶物識別，因此其在功能上類似于抗體可變區(qū)。由于Fe融合物與抗體的結(jié)構(gòu)和功能交疊，因此本發(fā)明中有關(guān)抗體的討論直接擴(kuò)展到Fe融合物?？贵w破壞腫瘤細(xì)胞有許多可能的機(jī)制，包括通過阻斷所需生長途徑的抗增殖、導(dǎo)致凋亡的胞內(nèi)信號、受體增強(qiáng)的下調(diào)和/或周轉(zhuǎn)(turnover)、⑶C、ADCC, ADCP,以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的促進(jìn)(Cragg et al., 1999, Curr Opin TmmunoI 11:541-547;Glennie etal., 2000, Immunol Today 21:403_410，引入作為參考)?？鼓[瘤功效可能起因于這些機(jī)制的組合，并且它們在臨床治療中的相對重要性似乎是癌癥依賴的。不考慮此抗腫瘤武器兵工廠，抗體作為抗癌藥的效力是不能令人滿意的，特別是考慮到它們的高成本?；颊吣[瘤反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示單克隆抗體在治療效果中只提供了較之正常單藥劑細(xì)胞毒性化療劑的少量改善。例如，僅有一半復(fù)發(fā)性低級非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤患者對抗⑶20抗體rituximab有反應(yīng)(McLaughlin et al.，1998，J Clin 0ncoll6:2825-2833，引入作為參考)。在 166 名臨床患者中，6%顯示完全反應(yīng)，42%顯示部分反應(yīng)，中值反應(yīng)持續(xù)時間為大約12個月。用于治療轉(zhuǎn)移性乳癌的抗HER2/neu抗體trastuzumab ( Hci ccplinSs，Genentech的注冊商標(biāo))功效更低。用trastuzumab治療222名受測患者時，總反應(yīng)率僅為15%，其中8個完全反應(yīng)，26個部分反應(yīng)，中值反應(yīng)持續(xù)時間和存活期為9至13個月(Cobleigh et al.，1999，J ClinOncol 17:2639-2648，引入作為參考)。目前，對于抗癌療法，死亡率的任何微小改善均認(rèn)為是成功。因此，存在增強(qiáng)抗體破壞靶癌細(xì)胞的能力的重大需要。Fe YR介導(dǎo)的效應(yīng)器功能在抗體抗癌活性中的角色已在小鼠中論證(Clyneset al.， 1998，Proc Natl Acad Sci USA95:652-656;Clynes et al.，2000，Nat Med6:443-446，引入作為參考)，并且Fe與某些Fe Y R之間相互作用的親和力與基于細(xì)胞的測試中的靶向細(xì)胞毒性有關(guān)(Shields et al.，2001，J BiolChem 276:6591-6604;Prestaet al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490;Shields et al.,2002,JBiol Chem277:26733-26740，引入作為參考)。此外，已經(jīng)觀察到人臨床功效與其Fe Y RIIIa的高(V158)或低(F158)親和力多態(tài)型同種異型之間的關(guān)聯(lián)(Cartron et al.，2002，Blood99:754-758，引入作為參考)。已經(jīng)針對不同目的對Fe進(jìn)行了誘變研究，其中有典型的變成丙氨酸(稱為丙氨酸掃描)或者由序列同源性替代指導(dǎo)的替代(Duncan et al.，1988，Nature332:563-564;Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662;Lund et al., 1992, MolImmunol 29:53-59;Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117;Lund etal.,1995,Faseb J 9:115-119;Jefferis et al., 1996, Immunol Lett54:101_104;Lundet al., 1996,J Immunol 157:4963-4969;Armour et al., 1999,Eur J Immunol29:2613-2624;Shields et al., 2001,J Biol Chem276:6591-6604)(US 5,624, 821;US5,885, 573;PCT WO 00/42072;PCT W099/58572)，全部引入作為參考。大多數(shù)替代降低或消除與Fe Y R的結(jié)合。然而，在獲得具有更高Fe Y R親和力的Fe變體方面已經(jīng)獲得了一些成功。(參見例如US 5,624,821和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的位置235替代人氨基酸(谷氨酸到亮氨酸的突變)，將小鼠抗體與人Fe y RI的結(jié)合增強(qiáng)了 100 倍(Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564) (US5, 624，821)。Shields 等用丙氨酸掃描誘變來定位對Fe y R結(jié)合重要的Fe殘基，隨后用非丙氨酸突變替代挑選的殘基(Shields et al., 2001, J Biol Chem276:6591-6604;Presta et al.,2002,Biochem SocTrans 30:487-490) (PCT W000/42072)，加入作為參考。還用通過在改造或變體細(xì)胞系中表達(dá)抗體而產(chǎn)生的改造糖型實(shí)現(xiàn)了 Fe對Fe Y R 增強(qiáng)的親和力(Uniafia et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davieset al.,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294;Shields et al., 2002, J BiolChem277:26733-26740; Shinkawa et al.，2003，JBiol Chem 278:3466-3473，引入作為參考)。該方法已造成抗體結(jié)合Fe YRIIIa和介導(dǎo)ADCC能力的增強(qiáng)?？贵w的另一種主要缺點(diǎn)是它們需要生產(chǎn)要求(Garber, 2001，Nat Biotechnol19:184-185; Dove, 2002，Nat Biotechnol 20:777-779，引入作為參考)?？贵w必須在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，并且目前市售的抗體連同其它高需求生物治療劑本質(zhì)上耗費(fèi)了所有可用的生產(chǎn)能力。開發(fā)中的數(shù)百種生物制劑中，大多數(shù)是抗體，急需更有效且更廉價的生產(chǎn)方法?？贵w生產(chǎn)能力不足的后續(xù)影響是三重的。首先，它顯著提高生產(chǎn)商的商品成本，該成本轉(zhuǎn)移到患者身上。第二，它阻礙已批準(zhǔn)的抗體產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)，限制高需求治療劑對患者的可用性。最后，因?yàn)榕R床試驗(yàn)需要大量尚不能盈利的蛋白質(zhì)，供給不足阻礙增長中的抗體供應(yīng)渠道向市場發(fā)展。已經(jīng)在企圖緩和該問題的嘗試中探索了替代性生產(chǎn)方法。正在尋求轉(zhuǎn)基因植物和動物作為可能更廉價且能力更高的生產(chǎn)系統(tǒng)(Chadd et al., 2001, Curr Opin Biotechnol12:188-194，引入作為參考)。然而，這樣的表達(dá)系統(tǒng)卻可能生成明顯不同于人糖蛋白的糖基化樣式。這可能導(dǎo)致效應(yīng)器功能降低乃至缺乏，因?yàn)槿缫陨纤懻摰?，碳水化合物結(jié)構(gòu)能顯著影響Fe Y R和補(bǔ)體結(jié)合。非人糖型的潛在更大問題可能是免疫原性；碳水化合物是對免疫系統(tǒng)而言抗原性的關(guān)鍵來源，非人糖型的存在有引發(fā)中和治療劑的抗體的重大機(jī)會，或者更糟的是引起不良免疫反應(yīng)。因此，由轉(zhuǎn)基因植物和動物生成的抗體的功效和安全性仍不確定。細(xì)菌表達(dá)是解決抗體生產(chǎn)問題的另一種有吸引力的辦法。細(xì)菌例如大腸桿菌中的表達(dá)提供了有成本效益且能力高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)諸如抗體，細(xì)菌表達(dá)有許多障礙，包括這些復(fù)雜分子的折疊與組裝、正確二硫化物形成、以及缺乏糖基化時的溶解度、穩(wěn)定性、和功能性，因?yàn)樵诩?xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)是不糖基化的。已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)了結(jié)合抗原的全長未糖基化抗體(Simmons et al., 2002, JImmunol Methods263:133-147，引入作為參考)，因此，在缺乏真核陪伴機(jī)制時由細(xì)菌表達(dá)的抗體有可能折疊、裝配、和形成正確二硫化物。然而，由細(xì)菌表達(dá)的抗體用作治療劑的最終效用仍然受糖基化缺乏的阻礙，它導(dǎo)致缺乏效應(yīng)器功能并可能導(dǎo)致弱穩(wěn)定性和溶解度。對于在高濃度配制，對于臨床應(yīng)用要求的長時段，這很可能更成問題?？傊?，需要具有增強(qiáng)的治療特性的抗體。發(fā)明概述本發(fā)明提供了優(yōu)化了許多治療學(xué)相關(guān)特性的Fe變體。這些Fe變體通常包含于變體蛋白質(zhì)內(nèi)，其優(yōu)選包含抗體或Fe融合蛋白。本發(fā)明的一個目的是提供新的Fe位置，在此可以進(jìn)行氨基酸修飾以生成優(yōu)化的Fe 變體。所述 Fe 位置包括 230、240、244、245、247、262、263、266、273、275、299、302、313、323、325、328、和332，其 中Fe區(qū)殘基的編號為Kabat中的EU索引(EU index)。本發(fā)明描述了在任何所述新的Fe位置的任何氨基酸修飾，目的是生成優(yōu)化的Fe變體。本發(fā)明的又一目的是提供本文已經(jīng)表征的Fe變體。在一個實(shí)施方案中，所述Fe變體在選自下組的位置包含至少一個氨基酸替代:221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、和337，其中Fe區(qū)殘基的編號為Kabat中的EU索引。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fe變體包含至少一個選自下組的替代:D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E2331、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L2341、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L2351、L235K、L235M、L235N、L235P權(quán)利要求
1.包含親本Fe多肽的Fe變體的蛋白質(zhì)，所述Fe變體在Fe區(qū)中包含選自如下的氨基酸取代:267D、267E、和328 F，其中編號依照EU索引。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)化的Fc變體、其生產(chǎn)方法、包含優(yōu)化的Fc變體的Fc多肽、以及使用優(yōu)化的Fc變體的方法。
文檔編號C07K16/00GK103172731SQ20121046018
公開日2013年6月26日 申請日期2005年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者格雷戈里.A.拉扎爾, 黨偉, 約翰.R.德斯賈萊斯, 謝爾.B.卡基, 奧米德.瓦法, 羅伯特.海斯 申請人:贊科股份有限公司