專利名稱：針對乏氧誘導(dǎo)因子-1α的納米抗體及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及針對乏氧誘導(dǎo)因子-I a (HIF-1 α )的納米抗體、編碼所述納米抗體的核苷酸序列、能夠表達(dá)所述納米抗體的載體及宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
乏氧是腫瘤普遍存在的現(xiàn)象，細(xì)胞乏氧會導(dǎo)致乏氧誘導(dǎo)因子-Ia (HIF-Ia，hypoxia-induciblef actor-1 alpha)的表達(dá)水平顯著高于正常組織，HIF-I α與HIF-I β 二聚化形成的HIF-I蛋白因子促進(jìn)血管再生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的繁殖、侵襲、轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡。抑制HIF-Ια可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展轉(zhuǎn)移(Semenza GL:Targeting HIF-I for cancer therapy. Nature reviews Cancer2003,3(10) : 721-732)。通過阻斷HIF-Ia通路來治療腫瘤細(xì)胞逐漸受到關(guān)注，HIF-I a的PAS-B結(jié)構(gòu)域(Per-Arnt-Sim-B)主要負(fù)責(zé)HIF-I a與HIF-I β 二聚化以及與下游靶基因的結(jié)合區(qū)(技術(shù)參考To K K, Sedelnikova O A, The phosphorylation status ofPAS-Bdistinguishes HIF-Ialpha from HIF_2alpha in NBSl repression.The EMBOjournal,2006,25 (20):4784-4794) (Lee K, Zhang H,Acriflavine inhibits HIF-Idimerization, tumor growth,andvascularization. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(42):17910-17915),因此以HIF-I α的PAS-B結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)，減少HIF-I (HIF-1 a與HIF-1 β 二聚化形成的及與靶基因結(jié)合后才具備調(diào)控活性)的含量，從而抑制腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移，為其應(yīng)用于腫瘤的診斷與治療奠定基礎(chǔ)。納米抗體(variabledomain of the heavy chain of HCAbs, VHH)最初是由比利時(shí)科學(xué)家在胳馬它科動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的(C. Hamers-Casterman, Naturally occurringantibodies devoid of lightchains, 1993，363:446-448)—種天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAbs)的基礎(chǔ)上運(yùn)用分子生物學(xué)手段技術(shù)進(jìn)行抗體工程革命,得到能與抗原結(jié)合的重鏈抗體可變區(qū)，而形成的納米級的抗體分子，其晶體結(jié)構(gòu)直徑2. 5納米，長度為4納米。早期診斷與靶向治療一直是抗腫瘤研究的主要難題，關(guān)鍵是藥物能在體內(nèi)快速而準(zhǔn)確地滲透到腫瘤病灶部位，且對正常組織的損傷降到最低，這就對抗體的親和性及組織滲透性提出了更高的要求。納米抗體具有獨(dú)特的性質(zhì)如分子量小、組織相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、抗原識別能力強(qiáng)、生產(chǎn)易于實(shí)現(xiàn)并生產(chǎn)成本低等。因此，在腫瘤的診斷與治療方面比其他抗體更具優(yōu)勢。近幾年，在腫瘤診斷與治療的研究方面取得了較大的進(jìn)展。目前，尚沒有針對HIF-I α的PAS-B結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)的特異性納米抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-I a (HIF-1 α )的納米抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-la (HIF-Ia)的納米抗體的編碼序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-I α的納米抗體，所述抗體是SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
一種能夠編碼所述針對乏氧誘導(dǎo)因子-I α的納米抗體的DNA分子，是用SEQ IDNO 2所示的序列?！N表達(dá)載體，它含有SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。一種宿主細(xì)胞，它含有上述表達(dá)載體。本發(fā)明的一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-I α的納米抗體能與HIF-I α的PAS-B結(jié)構(gòu)域發(fā)生良好地特異性結(jié)合。


圖I表達(dá)載體pGEX-4T-l-HIF-l a -PAS-B構(gòu)建流程圖。圖2是含有構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-HIF-l a -PAS-B的菌體表達(dá)的HIF-1 a -PAS-B結(jié)構(gòu)域純化前后的SDS-PAGE電泳圖Μ為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(14. Π16. OkDa)，I裂解沉淀，2裂解上清，3穿透峰，4洗脫峰。圖3帶有純化標(biāo)簽his的納米抗體蛋白VHH16的基因電泳圖Nco I和Not I雙酶切驗(yàn)證重組載體 pET-28-VHH16，M 為 Trans5K，I 為 pET-28_VHH16 (Nco I 和 Not I 雙酶切后)，2為VHH16 (VHH16基因全長為433bp VHH為393bp，由于引入酶切位點(diǎn)及連接而增加的堿基約為40bp)。圖4納米抗體蛋白VHH16誘導(dǎo)表達(dá)的全菌SDS-PAGE電泳圖M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10 170kDa)，l 為 BL21(DE3) (pET_28a(+))誘導(dǎo)產(chǎn)物，2 8 :分別是 BL21 (DE3)(PET-28-VHH16)在 IPTG 做誘導(dǎo)劑時(shí)誘導(dǎo) 2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h 的誘導(dǎo)產(chǎn)物。圖5抗體VHH16親和層析純化后的SDS-PAGE分析:M為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(l(Tl70kDa) I為裂解液，2為裂解上清，3為裂解沉淀，4為穿透峰，5飛為洗脫峰(VHH16蛋白分子量約為15kDa)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例IHIF-1 a -PAS-B結(jié)構(gòu)域蛋白的制備過程，其中HIF-1 a -PAS-B結(jié)構(gòu)域蛋白為帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白(I)引物根據(jù)HIF-Ia-PAS-B結(jié)構(gòu)域在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編碼基因序列(NCBIReferenceSequence :ΝΜ_001530. 3)設(shè)計(jì)，上游引物HIF-1 a -PAS-B+: 5，-CGCGGATCCATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTC-3’ (SEQIDNO 3)下游引物HIF-1 a -PAS~B~: 5，~GCCCTCGAGCTACAAGTCGTGCTGAATAATACCACT~3，(SEQID NO 4)
在下劃線部分引入BamH I, Xho I的限制性酶切位點(diǎn)，以HIF-I α全序列克隆載體 pFlKOF-HIF-l α (購買于 Kazusa DNA Research Institute)為模板，PCR 擴(kuò)增HIF-1 a-PAS-B基因(目的克隆基因序列見SEQ ID NO :5 (348bp)，由SEQ ID NO :5序列表達(dá)的氨基酸序列見 SEQ ID NO :6)，連接至 pGEX-4T-l (pGEX_4T_l 購買于 GE healthcare)表達(dá)載體，經(jīng)過基因序列測定，以確定所獲得的目的基因序列的正確性。(見圖I)(2)構(gòu)建成功的基因工程菌BL21 (pGEX-4T-l-HIF_l a -PAS-B)及對照菌BL21 (pGEX-4T-l)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的HIF-1 a -PAS-B結(jié)構(gòu)域(見圖2)和單獨(dú)的GST蛋白，并將帶有GST標(biāo)簽的HIF-1 a -PAS-B結(jié)構(gòu)域經(jīng)過GST_tag親和層析柱純化，獲得高純度的目的蛋白。實(shí)施例2針對HIF-I α的PAS-B結(jié)構(gòu)域的納米抗體篩選過程(I)包被抗原用包被緩沖液(O. 05Μ碳酸鹽緩沖液pH 9. 6)配制100 μ g/mL的·GST_HIF-1 a -PAS-B溶液，用包被緩沖液(O. 05Μ碳酸鹽緩沖液pH 9.6)配制100 μ g/mL的GST溶液；用上述兩種溶液分別包被免疫管，靜置過夜；GST_HIF-1 a -PAS-B溶液包被的免疫管稱A管，GST溶液包被的免疫管稱B管；(2)封閉棄去上清，用pH為7. 4的PBS (磷酸鹽緩沖液)洗滌A管和B管各三次。加入含2% (g/ml)脫脂奶的PBS溶液，37°C靜置3h，棄去上清，用PBST (磷酸鹽緩沖液，含
O.05%的Tween-20)洗滌A管和B管各三次，再用PBS洗滌A管和B管各三次；(3)納米抗體噬菌體文庫的預(yù)處理取300 μ L 2% (g/ml)脫脂奶的pH為7. 4的PBS溶液并向其中加入非免疫駱駝納米抗體噬菌體展示基因庫(其中非免疫駱駝納米抗體曬菌體展不基因庫的構(gòu)建參考文獻(xiàn)Monegal A, Ami D, Martinelli C，Huang H, AliprandiM，Capasso P，F(xiàn)rancavilla C，Ossolengo G，de Marco A:Immunological applicationsof single-domain llamarecombinant antibodies isolated from a naive library.Protein engineering, design & selection:PEDS 2009，22 (4) : 273-280)，保證納米抗體的量為5X1012pfu左右，將上述溶液加入B管中，共孵育lh，得到預(yù)處理后的納米抗體噬菌體文庫；(4)將B管中的液體轉(zhuǎn)移到A管中，棄B管，A管37°C靜置2h ;(5)洗滌A管棄去上清，用PBST洗滌三次后用PBS洗滌三次；(6)洗脫向A管中加入ImL O. IM三乙胺溶液，常溫振蕩5min。IM Tris-HCl將溶液PH調(diào)至7. 5，加入6 μ L質(zhì)量濃度為O. 25%胰蛋白酶水溶液，振蕩15min，置于冰上；(7)侵染用A管溶液侵染大腸桿菌TGl (購自New England Biolabs)，37°C孵育45min ；(8)加入輔助噬菌體M13K07 (購買于New England Biolabs)浸染TG1，37C孵育45min,產(chǎn)生并純化曬菌體用于下一輪篩選。(9)將經(jīng)(8)篩選收集到的噬菌體納米抗體文庫按實(shí)施例2的步驟再進(jìn)行2輪的篩選。實(shí)施例3用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)篩選HIF-1 a -PAS-B特異性單個(gè)陽性克隆(I)噬菌體納米抗體的制備在進(jìn)行到第3輪步驟(7)得到的大腸桿菌TGl (購自New EnglandBiolabs)涂平板，挑取96個(gè)含噬菌體的單克隆細(xì)菌分別接種到96孔板中，37°C培養(yǎng)過夜，以M13K07:TG1=20:1的比例加入輔助噬菌體M13K07，37°C孵育45min，離心，棄上清，重懸菌體，培養(yǎng)過夜。離心，將所得上清待用；(2)包被包被 100 μ g/mL GST_HIF_1 a -PAS-B，每孔 100 μ L 于新 96 孔板，4°C靜置過夜。同樣包被GST作為陰性對照；(3)封閉棄包被液，用pH為7. 4的PBS洗三次。每孔加入含有質(zhì)量濃度為2%的脫脂奶的PBS (pH為7. 4)溶液，靜置2h ；(4)棄去封閉液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。按照反應(yīng)孔的標(biāo)號對應(yīng)加入本實(shí)施例步驟(I)制備的噬菌體上清，孵育2h ；(5)加入酶標(biāo)二抗棄去(4)中的溶液，用PBST洗三次和PBS各洗三次。向各反應(yīng)孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗M13K07單克隆抗體(二抗)，孵育Ih ；(6)加底物顯色液棄去(5)中的溶液，用PBST洗三次后再用PBS各洗三次。向各個(gè)反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB (2mg/mL TMB乙醇溶液O. 5mL ；pH為5. 5底物緩沖液(O. 2MNa2HP04,0. IM 檸檬酸)IOmL ；0. 75%Η20232 μ L)底物溶液 100 μ L,孵育 15min ；(7)終止反應(yīng)向各個(gè)反應(yīng)孔中加入50 μ L 2Μ稀硫酸； (8)結(jié)果判定用酶標(biāo)儀于450nm下測各孔OD值。實(shí)驗(yàn)組讀數(shù)大于O. 30且大于陰性對照讀數(shù)I倍以上的噬菌體可以判定為陽性克隆。(9)選取 Phage ELISA 檢測結(jié)果較為理想的 6 個(gè)(VHH5、VHH6、VHH7、VHH8、VHH16、VHH20)陽性克隆進(jìn)行了測序分析，獲取的片段序列(即納米抗體的DNA序列)翻譯成氨基酸序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6個(gè)氨基酸序列基本一致，特別是CDR-3區(qū)的序列完全一致，只有框架區(qū)存在個(gè)別氨基酸的差別。將CDR1，CDR2，CDR3序列相同的氨基酸序列視為同一抗體。(10)我們選擇VHH16 (SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列，能夠表達(dá)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的DNA序列是用SEQ ID NO 2所示的序列)用于后續(xù)Anti-HIF-I α納米抗體的表達(dá)、純化及其檢測實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4特異性納米抗體重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28-VHH16的構(gòu)建(I)提取陽性克隆TGl重組質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶Nco I和Not I處理提取VHH16基因；(2)將提取的質(zhì)粒pET_28a(+)(購買于Novagen)用Nco I和Not I雙酶切，重組連接形成可表達(dá)帶his純化標(biāo)簽的pET-28a_VHH16質(zhì)粒。酶切驗(yàn)證見圖4。實(shí)施例5納米抗體蛋白在大腸桿菌中表達(dá)純化(I)將實(shí)施例4所述的含his純化標(biāo)簽的pET_28a_VHH16質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL2I (DE3)(購于 TransGen)。(2)菌體活化至0D_為O. 7時(shí)，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至
O.3mM，繼續(xù)在20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)20h (培養(yǎng)時(shí)間的條件篩選見圖4)。(3)離心，收集菌體_20°C冷凍待用。(4)加溶菌酶裂解細(xì)菌，離心，收上清中可溶性蛋白，經(jīng)His-tag親和柱親和純化獲得純度較高的抗體蛋白。(見圖5)
實(shí)施例6抗體VHH16生物活性的ELISA鑒定(I)包被抗原用包被緩沖液將GST_HIF-1 a -PAS-B融合蛋白稀釋至終濃度為I μ g/mL>2 μ g/m L>4 μ g/mL>8 μ g/mL> 16 μ g/mL(每個(gè)濃度做 3 個(gè)平行)，每孔加入 100 μ L,4°C靜置過夜。用同樣的方法包被GST和包被緩沖液分別作為陰性對照和空白對照。(2)封閉去包被液，用PBS洗滌三次。每孔加入含有2% (g/ml)脫脂奶的PBS(PH7.4)溶液，靜置2h。(3)加入實(shí)施例5得到的抗體VHH16 :棄去封閉液，用PBST洗三次后再用PBS洗滌三次。按照反應(yīng)孔的標(biāo)號對應(yīng)加入VHH16抗體(3 4 μ g/mL)，孵育2h。(4)加入anti-his單抗棄去VHH16蛋白，用PBST洗三次后再用PBS洗滌三次。向各反應(yīng)孔中加入稀釋的anti-his單抗，孵育lh。(5)加入酶標(biāo)二抗棄去anti-his單抗，用PBST洗三次后再用PBS洗滌三次。向各反應(yīng)孔中加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗屬抗血清，孵育lh。(6)加底物顯色液棄去上清，用PBST洗三次后再用PBS洗滌三次。向各個(gè)反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液，孵育15min。(7)終止反應(yīng)向各個(gè)反應(yīng)孔中加入2M稀硫酸終止液。(8)結(jié)果判定在450nm下用酶標(biāo)儀測各孔OD值。實(shí)驗(yàn)組讀數(shù)大于O. 30且大于陰性對照讀數(shù)I倍以上的噬菌體可以判定為陽性克隆。(9)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-Ia的納米抗體，其特征是所述抗體是SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一種能夠編碼權(quán)利要求I所述針對乏氧誘導(dǎo)因子-Ia的納米抗體的DNA分子，是用SEQID NO 2所示的序列。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于它含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了針對乏氧誘導(dǎo)因子-1α的納米抗體及其編碼序列，所述抗體是SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的一種針對乏氧誘導(dǎo)因子-1α的納米抗體能與HIF-1α的PAS-B結(jié)構(gòu)域發(fā)生良好地特異性結(jié)合。
文檔編號C07K16/18GK102924595SQ20121046544
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者黃鶴, 樊曉丹, 劉靜, 胡耀中 申請人:天津大學(xué)