專利名稱：以固定的納米材料微球作基底的dna或rna合成裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA/RNA的合成技術(shù)，具體地說,涉及一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置。
背景技術(shù)：
近年來，基因工程因其在疾病診斷、治療領(lǐng)域上的應(yīng)用前景而備受關(guān)注。常規(guī)技術(shù)手段中，長鏈DNA均由化學(xué)合成的短鏈寡核苷酸通過聚合酶反應(yīng)拼接而成。因此，短鏈寡核苷酸的合成正確率、成本、效率直接決定了長鏈DNA的質(zhì)量與生產(chǎn)成本。商用合成儀的最小產(chǎn)量為IOnmol量級，這超出了大多實(shí)驗(yàn)室的需求量，許 多研究致力于合成pmol量級的短鏈寡核苷酸，恰能滿足一般需求。微流體方法及微陣列方法是合成pmol量級短鏈寡核苷酸的主要手段，大多研究也基于此開展。其中，Quake小組是研究微流體合成方法的代表，在“A microfluidic oligonucleotidesynthesizer，，Vol. 38 I 21February 2010, Nucleic Acids Research 中，充分體現(xiàn)了微流體合成DNA的優(yōu)點(diǎn)，如合成量適中(一般為nmol量級)、無交叉污染、可實(shí)現(xiàn)高通量合成等。但這種方法亦存在諸多問題尚未解決，如操作復(fù)雜、結(jié)構(gòu)或原料昂貴、原料溶液消耗過剩、因微泵和微閥的引入導(dǎo)致成本上升和效率下降等。Jingdong Tian小組是研究微陣列合成方法的代表，在“Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNAmicrochips” Vol. 432 | 23/30 December, Nature 中，詳細(xì)闡述了微陣列方法合成 DNA 的優(yōu)點(diǎn)，如合成密度高、高通量、精度高、合成效率高等。但該方法也存在若干問題，如產(chǎn)量太小，甚至不足以引發(fā)PCR反應(yīng)；單獨(dú)處理某種特定的寡核苷酸難度很大等。因此，開發(fā)一種合成量為pmol量級、高正確率、高效率、低成本的DNA合成儀，以滿足實(shí)驗(yàn)室需求成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置，其包括供液裝置和基片；其中，基片上設(shè)有通孔陣列，納米材料微球固定于各孔中，所述納米材料微球經(jīng)表面化學(xué)修飾后作為DNA或RNA合成的基底材料，將脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑通過供液裝置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。所述納米材料微球?yàn)槎趸尬⑶颍蛘哌m合用于在其表面合成DNA或RNA的材料制成的微球，比如聚苯乙烯微球等。優(yōu)選通過燒結(jié)的方法將納米材料微球固定于通孔陣列的各孔中。優(yōu)選所述基片為硅片。以硅片為襯底，采用低壓化學(xué)氣相淀積形成內(nèi)外共兩層掩膜層，其中，內(nèi)層為二氧化硅掩膜層，外層為氮化硅掩膜層，制成基片。所述供液裝置優(yōu)選使用噴墨打印機(jī)，且在不同墨盒中分別裝載四種脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑，不同的溶液及試劑對應(yīng)于打印機(jī)調(diào)色系統(tǒng)中相應(yīng)的RGB 值。所述納米材料微球表面經(jīng)化學(xué)修飾后含-NH-CO-基團(tuán)，并在最外端形成-OH基團(tuán)。
優(yōu)選所述通孔為倒楔形。本發(fā)明進(jìn)一步提供采用上述合成裝置合成DNA或RNA的方法將脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑通過供液裝置加入到基片上的通孔陣列中，基片的通孔中有固定的微球，在微球表面完成DNA或RNA合成，反應(yīng)結(jié)束后，沖洗或浸泡基片，回收合成的 DNA 或 RNA。本發(fā)明的一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置，綜合了微流體合成方法和微陣列合成方法的優(yōu)勢，既具有微流體合成方法合成量適中、高通量、無交叉污染的特點(diǎn)，又具有微陣列合成方法合成工藝簡單、合成效率高的特點(diǎn)，有望應(yīng)用于合成特 異性短鏈寡核苷酸的場合，例如引物、探針和由短鏈組成長鏈的合成工作等。與現(xiàn)有技術(shù)相t匕，優(yōu)點(diǎn)在于(一)采用固定在孔或腔體內(nèi)的納米材料微球作合成DNA/RNA的基底，一方面可同時高通量合成不同種類的DNA/RNA，且其產(chǎn)量適中；另一方面在保證反應(yīng)腔集成密度的基礎(chǔ)上，腔體間的物理隔離亦可避免交叉污染。( 二)采用噴墨打印機(jī)將合成反應(yīng)中所需的微量試劑輸送至相應(yīng)的反應(yīng)腔中進(jìn)行合成反應(yīng)，可避免因引入微泵、微閥所致的試劑流通速率小、成本高的問題，且具有通量高、操作簡單、效率高等優(yōu)勢。


圖I為本發(fā)明較佳實(shí)施例中基片及基片上通孔陣列的制備流程示意圖。圖2為本發(fā)明較佳實(shí)施例中對二氧化硅微球表面進(jìn)行化學(xué)修飾的流程示意圖。圖3本發(fā)明較佳實(shí)施例中DNA化學(xué)合成示意圖。圖4本發(fā)明較佳實(shí)施例中DNA或RNA合成裝置工作原理示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。 實(shí)施例以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置I. I以硅片為襯底采用薄膜生長、光刻、干法刻蝕和濕法腐蝕的方法制作硅陣列式通孔操作步驟如下I)以厚度為400 μ m的雙拋硅片I為襯底，采用低壓化學(xué)氣相淀積雙面生長兩層掩膜層(內(nèi)層為二氧化娃掩膜層2,厚度IOOnm,外層為氮化娃掩膜層3,厚度IOOnm),如圖IA ；2)正面光刻制作陣列式通孔所需的圖形，背面保護(hù)，濕法腐蝕或干法刻蝕步驟I)中生長的掩膜層，然后以光刻膠為掩膜，采用反應(yīng)離子刻蝕技術(shù)刻蝕氮化硅掩膜層，再用氫氟酸溶液腐蝕二氧化硅掩膜層，如圖IB ；3)用氫氧化鉀溶液腐蝕硅片至硅片穿通，如圖IC ；
4)采用背面反應(yīng)離子刻蝕技術(shù)去除氮化硅掩膜層和二氧化硅掩膜層，形成陣列式倒楔形通孔4，且倒角為53°。當(dāng)?shù)组_口邊長為120 μ m時，其容積為78. 5nL，如圖1D，得到硅陣列式通孔。I. 2將二氧化硅微球固定于倒楔形硅通孔中操作步驟如下5)硅片正面鍵合一層干膜5，光刻形成與倒楔形硅通孔陣列相同的圖形，如圖IE ；6)用移液器將配好的含有濃度為10%的二氧化硅微球濁液滴入已貼上干膜的倒楔形通孔，重復(fù)多次，完成自組裝，使倒楔形通孔中裝滿二氧化硅微球6，后續(xù)化學(xué)合成反應(yīng)均在微球表面進(jìn)行，該倒楔形通孔即為反應(yīng)腔，如圖1F(該工藝既可以保證通孔內(nèi)的合成量適中，又能避免引入微泵、微閥所致的成本上升和試劑流通速率下降問題)；
7)先將硅片浸入丙酮，使其上的干膜發(fā)生卷曲而剝離，以去除反應(yīng)腔間、干膜上過量的二氧化硅微球7，再用氫氧化鉀去除殘余干膜，如圖IG ；8)將娃片于1050°C燒結(jié)處理12h,使二氧化娃微球表面熔化,實(shí)現(xiàn)微球間及微球與倒楔形側(cè)壁間的物理性粘結(jié)，即可將微球固定于通孔中，形成有陣列式反應(yīng)腔的芯片8，以滿足后續(xù)化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)中沖洗反應(yīng)腔內(nèi)殘余試劑的要求，如圖1G。I. 3在反應(yīng)腔/孔內(nèi)進(jìn)行DNA/RNA合成反應(yīng)首先化學(xué)修飾微球，使其形成-NH-CO-基團(tuán)，以便靈活切割合成后的DNA/RNA ;繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)修飾，使其最外端形成-OH基團(tuán)，以使所需的第一個核苷酸與之反應(yīng)，鏈接其上，如圖2。本發(fā)明采用典型的“脫保護(hù)-偶聯(lián)-蓋帽-氧化”合成方法。具體的化學(xué)合成實(shí)施方法為=EPSON六色壓電式噴墨打印機(jī)的不同墨盒中裝入合成反應(yīng)所需的試劑，分別為四種不同脫氧核苷酸溶液、一種脫保護(hù)的弱酸(例如四唑)及一種切割產(chǎn)物用的弱堿(例如氨水)。將六種試劑作為打印機(jī)相應(yīng)顏色的墨水處理，六種墨水均有唯一的RGB值。本發(fā)明在Microsoft PPT中設(shè)置與六種墨水RGB值完全一致的色塊作為輸入，通過控制不同色塊的位置、大小來控制打印頭噴出液體種類、位置和數(shù)量，實(shí)現(xiàn)將合成反應(yīng)中所需的微量試劑輸送至芯片上裝滿微球的腔體中，完成DNA的化學(xué)合成，如圖3。基本工作原理如圖4。倒楔形通孔陣列的芯片8及其支架9等均固定不動，支架下端真空泵接口 10可產(chǎn)生負(fù)壓，以沖洗化學(xué)合成過程中的殘余試劑；芯片上有裝滿固定二氧化硅微球的倒楔形通孔陣列，所有化學(xué)合成均在孔中進(jìn)行；打印機(jī)將實(shí)驗(yàn)中所需不同液體通過不同顏色的墨盒及管路11，輸送至確定的倒楔形反應(yīng)腔，此時打印頭12的運(yùn)動方向是左右方向，噴出試劑13不是單一種類，圖4A為系統(tǒng)工作的正視圖，圖4B為系統(tǒng)工作的側(cè)視圖。此時打印頭的運(yùn)動方向是垂直于紙面向里或向外方向，噴出試劑14是單一種類。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置，其特征在于，包括供液裝置和基片；其中，基片上設(shè)有通孔陣列，納米材料微球固定于各孔中，所述納米材料微球經(jīng)表面化學(xué)修飾后作為DNA或RNA合成的基底材料，將脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑通過供液裝置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，所述納米材料微球?yàn)槎趸栉⑶蚧蚓郾揭蚁┪⑶颉?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，通過燒結(jié)的方法將納米材料微球固定于通孔陣列的各孔中。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，所述基片為硅片。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，以硅片為襯底，采用低壓化學(xué)氣相淀積形成內(nèi)外共兩層掩膜層，其中，內(nèi)層為二氧化硅掩膜層，外層為氮化硅掩膜層，制成基片。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，所述供液裝置為噴墨打印機(jī)，且在不同墨盒中分別裝載四種脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑，不同墨盒中的溶液及試劑對應(yīng)于打印機(jī)調(diào)色系統(tǒng)中相應(yīng)的RGB值。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成裝置，其特征在于，所述納米材料微球表面經(jīng)化學(xué)修飾后含-NH-CO-基團(tuán)，并在最外端形成-OH基團(tuán)。
8.采用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述合成裝置合成DNA或RNA的方法，其特征在于，將脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑通過供液裝置加入到基片上的通孔陣列中，在微球表面完成DNA或RNA合成，反應(yīng)結(jié)束后，沖洗或浸泡基片，回收合成的DNA或RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以固定的納米材料微球作基底的DNA或RNA合成裝置，包括供液裝置和基片；其中，基片上設(shè)有通孔陣列，納米材料微球固定于各孔中，所述納米材料微球經(jīng)表面化學(xué)修飾后作為DNA或RNA合成的基底材料，將脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸單體溶液及反應(yīng)試劑通過供液裝置加入到固定有微球的各孔中，在微球表面完成DNA或RNA合成。該裝置綜合了微流體合成方法和微陣列合成方法的優(yōu)勢，既具有微流體合成方法合成量適中、高通量、無交叉污染的特點(diǎn)，又具有微陣列合成方法合成工藝簡單、合成效率高的特點(diǎn)，有望應(yīng)用于合成特異性短鏈寡核苷酸的場合，例如引物、探針和由短鏈組成長鏈的合成工作等。
文檔編號C07H21/04GK102962015SQ20121047282
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者李志宏, 梁子才, 李輝, 余懷強(qiáng), 王瑋, 王任鑫 申請人:北京大學(xué)