專利名稱：血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種高效分離純化、富集血凝素肽HA標(biāo)簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門學(xué)科，重組蛋白質(zhì)的使用在近年來大大增加。為方便基因重組蛋白的標(biāo)記、追蹤、鑒定和純化，在目標(biāo)蛋白表達(dá)中會人為引進(jìn)一段標(biāo)簽多肽形成重組蛋白。因此分離純化、富集重組蛋白的技術(shù)越來越顯示其重要性。從成份復(fù)雜的表達(dá)體系中分離純化、富集目標(biāo)蛋白是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，而親和層析法是目前最廣泛的分離純化、富集重組蛋白的方法。

由于目前用于分離純化、富集HA重組蛋白的親和層析柱主要有金屬螯合親和柱以及利用酶的底物、反應(yīng)性燃料為配基的親和柱，這些親和柱存在非特異性吸附、洗脫條件劇烈、提純效果不佳等顯著缺點(diǎn)，而且金屬螯合親和柱還存在金屬離子脫落到洗脫液中的缺陷，這些都將限制分離提純出來的目標(biāo)蛋白后續(xù)的應(yīng)用、檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集HA標(biāo)簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱制備方法及其應(yīng)用。為達(dá)上述目的，本發(fā)明2次采用抗原抗體的特異性反應(yīng)和可離解的特性Ag + Ab(固相)O Ag-Ab (固相)原理，具體如下:
首先利用這一原理將HA短肽半抗原偶聯(lián)于Agarose上制得HA- Agarose親和柱,用于提取HA特異性多克隆抗體。再利用這一原理將提取所得的抗HA特異性抗體Ant1-HA偶聯(lián)到Agarose上制得Ant1-HA- Agarose免疫親和柱，用于分離純化、富集細(xì)胞裂解液中的HA標(biāo)簽重組蛋白。根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:
I)將免疫親和純化的血凝素肽HA特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料；
2)將HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。所制的HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱包含偶聯(lián)有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。所述的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體是用HA短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清,將含抗體血清上到偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱，清洗未結(jié)合的雜質(zhì)，用弱酸洗脫下HA特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。所述的HA短肽是由9個(gè)氨基酸即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，采用這9個(gè)氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團(tuán)制得巰基化的HA短肽，其序列為:1)半胱氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸即C-VPDYA，2)即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸YPYD-C。見序列表。所述的HA短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍(lán)蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應(yīng)生成碘乙?；疜LH或OVA，通過葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化HA短肽與碘乙?；腒LH或OVA混合，調(diào)pH=8.5，在室溫?fù)u動反應(yīng)60分鐘，經(jīng)G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。所述偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱，將2種方向相反巰基化的HA短肽半抗原與碘乙?；腁garose反應(yīng),形成化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體填料HA-Agarose,將HA-Agarose裝柱即得偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱。一種血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的應(yīng)用，其特征在于:免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體聯(lián)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn): 本發(fā)明所制得的免疫親和純化富集柱，具有以下顯著優(yōu)勢:
(1)作為配基的HA特異性多克隆抗體采用的是只有4-5個(gè)氨基酸的HA短肽為免疫原刺激動物產(chǎn)生的，抗體對表達(dá)體系中的HA標(biāo)簽蛋白識別能力更強(qiáng)；并且抗體采用免疫親和層析法提純，提純所得抗體特異性高，使得抗體和瓊脂糖珠偶聯(lián)密度大，偶聯(lián)率高，用這種高特異性的抗體所制得的免疫親和填料識別表達(dá)體系的HA標(biāo)簽重組蛋白效率明顯提高；
(2)采用過碘酸鈉活化的Agarose,使抗體和Agarose形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵,偶聯(lián)于填料上的抗體不容易脫落，能更準(zhǔn)確分離、富集HA標(biāo)簽重組蛋白；
(3)將所得的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體標(biāo)記上辣根過氧化物酶HRP得到Ant1-HA HRP，直接標(biāo)記一抗用來檢測免疫親和純化富集柱的富集效果更準(zhǔn)確；同時(shí)此免疫親和純化富集柱洗脫條件溫和，能反復(fù)使用，降低成本。是目前分離提純、富集HA標(biāo)簽重組蛋白理想的材料。


圖1為用免疫沉淀法檢測HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱吸附目標(biāo)蛋白圖。圖中:1為分子量標(biāo)記；
2為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解液原液上清5倍稀釋液IOPL ；
3為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解原液上清5倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的濾液ιομ ;
4為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解原液上清5倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液5PL;
5為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解原液上清5倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱柱富集后的洗脫液lOPL。
附圖1圖示說明HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱能識別重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)囷裂解液中的HA標(biāo)簽蛋白，并能將HA標(biāo)簽蛋白吸附，吸附在填料上的HA標(biāo)簽蛋白能用弱酸洗脫。附圖2為用免疫沉淀法檢測HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集效果圖。圖中:
I為分子量標(biāo)記；
2為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解液原液上清50倍稀釋液IOPL ；
3為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解液原液上清50倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集HA后的濾液IOPL ；
4為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解液原液上清50倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液lOPL。其中左邊4道未加HA多肽抑制，右邊4道加入HA多肽抑制。附圖2圖示說明HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱能從含重組HA標(biāo)簽蛋白很低的細(xì)菌裂解液中富集HA標(biāo)簽蛋白。用HA多肽能完全抑制，說明所獲得的免疫印記信號是HA特異性信號。附圖3為用HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱與Ant1-HA-HRP聯(lián)用效果圖。圖中:
NZHUS術(shù)。I為分子量標(biāo)記；
2為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì) 菌裂解原液上清10倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液5PL
3為重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解原液上清10倍稀釋液經(jīng)HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液15PL
注:附圖1、附圖2、附圖3實(shí)驗(yàn)所用到的重組HA標(biāo)簽蛋白的細(xì)菌裂解液來自同一管，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。
具體實(shí)施例方式提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的制備
1.1 HA短肽半抗原設(shè)計(jì)
采用由9個(gè)氨基酸殘基即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，用這9個(gè)氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氣酸疏基SH基團(tuán)制得疏基化的HA短妝。1.2 HA短肽免疫原制備
取5 mg/mL KLH 10 mL,加入100 μ L飽和Na2CO3，再加入I mL 10%的SDS混勻后煮沸5分鐘變性，再與碘乙酰-NHS反應(yīng)生成碘乙酰化KLH，通過G25 S印hadex去掉過量的碘乙酸后，加入55 mg的HA短肽半抗原，調(diào)pH=8.5，室溫反應(yīng)60分鐘后，得到HA -KLH共價(jià)鍵復(fù)合體，經(jīng)G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫抗原。改用OVA為載體蛋白用同樣方法制備檢測用包被抗原HA-OVA.1.3多克隆抗血清制備:用新西蘭大白兔為免疫動物，疫苗濃度為lmg/mL，首次免疫用0.5mL疫苗加ImL完全佐劑混勻多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫每次每兔用0.25mL疫苗加0.75mLPBS加ImL不完全佐劑混勻分2點(diǎn)注射，首次免疫后，每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，35-40天采集血清檢測滴度，血清滴度達(dá)到1:6400后進(jìn)行生產(chǎn)性血清制備。
權(quán)利要求
1.一種血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于: I)將免疫親和純化的血凝素肽HA特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料； 2)將HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所制的HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱包含偶聯(lián)有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體是用HA短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱，清洗未結(jié)合的雜質(zhì)，用弱酸洗脫下HA特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的HA短肽是由9個(gè)氨基酸即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，采用這9個(gè)氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團(tuán)制得巰基化的HA短肽，其序列為:1)半胱氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸即C-VPDYA，2)即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸YPYD-C。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的HA短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍(lán)蛋白KLH或卵清蛋白OVA常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應(yīng)生成碘乙?；疜LH或OVA，通過葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化HA短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調(diào)pH=8.5，在室溫?fù)u動反應(yīng)60分鐘，經(jīng)G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血凝素肽HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱，將2種方向相反巰基化的HA短肽半抗原與碘乙?；腁garos e反應(yīng),形成化學(xué)共價(jià)鍵復(fù)合體填料HA-Agarose,將HA-Agarose裝柱即得偶聯(lián)有HA短肽的免疫親和層析柱。
7.—種血凝素肽標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的應(yīng)用，其特征在于:免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效、特異富集血凝素肽HA標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途，本發(fā)明所提供的免疫親和純化富集柱包含偶聯(lián)有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的活化瓊脂糖填料和裝載該免疫親和填料的塑料柱。免疫親和填料偶聯(lián)的HA特異性多克隆抗體是用免疫親和法提取得到的，免疫親和純化富集柱是將免疫親和填料裝載入特制的塑料柱得到的。該免疫親和純化富集柱富集HA標(biāo)簽重組蛋白效率高、特異性強(qiáng)，洗脫條件溫和，可重復(fù)利用，是目前分離提純、富集HA標(biāo)簽重組蛋白理想的材料。
文檔編號C07K1/22GK103113455SQ20121048154
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者潘麗金, 謝體三, 寧歡歡, 張芬, 蕭浩 申請人:南寧市藍(lán)光生物技術(shù)有限公司