專利名稱：用于核桃蛋白定性定量檢測的elisa試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于核桃蛋白定性定量檢測的間接ELISA試劑盒及其檢測方法，屬于食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著人民生活水平的提高，食品安全問題日益凸顯?！叭矍璋肥录备谷藗儚?qiáng)化了非食品用添加劑的食品安全問題，但食用添加劑的不合法添加形勢日趨惡劣，如各種各樣蛋白飲品(粉、乳等)中魚龍混雜的蛋白原料添加，各種各樣的調(diào)制奶、酸奶、核桃乳、核桃粉、奶粉中添加大豆粉等，牛奶、黃牛奶、山羊奶、馬奶等的相互摻假問題，極大的影響了食品消費(fèi)市場的安全和消費(fèi)者的消費(fèi)信心。因此，加強(qiáng)其檢驗(yàn)方法的研究迫在眉睫。 目前蛋白質(zhì)檢測方法主要包括蛋白質(zhì)電泳技術(shù)、液相色譜技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、免疫技術(shù)等。其中只有ELISA檢測法具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)已有利用大豆蛋白多克隆抗體ELISA方法測定火腿腸大豆蛋白含量，利用提純牛乳酪蛋白免疫試驗(yàn)動物，獲得針對酪蛋白的多克隆抗體，建立了牛奶中牛奶蛋白質(zhì)含量的ELISA檢測方法，具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性。但是，核桃蛋白定量檢測和摻假檢驗(yàn)的試劑盒仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，通過制備核桃蛋白多克隆抗體，建立了一種間接ELISA法，為我國食品行業(yè)中核桃蛋白定量和摻假問題提供了一種重要的監(jiān)測手段；該試劑盒包括陽性抗原、陰性血清、一抗、ELISA酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、稀釋液、封閉液、底物顯色液、終止液、洗滌液、包被緩沖液，其中陽性抗原為核桃蛋白，一抗為抗核桃蛋白多克隆抗體；其它試劑為ELISA試劑盒公知的、市場上有產(chǎn)品銷售的組分。本發(fā)明試劑盒可包括如下組分
(1)ELISA96孔酶標(biāo)板每個試劑盒裝有一塊真空包裝的ELISA板，ELISA板含有可拆卸的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔X 12條或8條X 12孔；
(2)陽性抗原核桃蛋白IOML；
(3)—抗抗核桃蛋白多克隆抗體ImL ；
(4)酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液ImL；
(5)陰性血清免疫前兔血清50ML；
(6)底物顯色液一瓶，IOmL；
(7)終止液2M的硫酸溶液IOmL；
(8)洗滌液1MpH7. 4 PBST 溶液 30mL ；
(9)采用含5%脫脂牛奶的PBST25mL,作為封閉液、血清稀釋液和抗體稀釋液；
(10)包被緩沖液pH9. 6,0. 05M碳酸鹽緩沖液IOmL0
本發(fā)明中利用常規(guī)等電點(diǎn)法、透析法、濾膜過濾法制備陽性抗原核桃蛋白，具體操作如下
1)按每克磨好的核桃粉添加5 10ml的石油醚的比例，用石油醚對核桃粉進(jìn)行脫脂2 3次后，自然風(fēng)干，得脫脂核桃粉；
2)將石油醚脫脂核桃粉溶解于核桃粉質(zhì)量5 10倍水中，調(diào)節(jié)溶液pH至1(T12，然后在55飛(TC水浴攪拌提取f 3h，再調(diào)節(jié)溶液pH值至6. 5^7. 5進(jìn)行沉淀；
3)然后溶液3000r/min離心20min,取上清液放入5Kd透析袋透析24 72h,收集透析袋內(nèi)溶液，經(jīng)0. 45Mm和0. 22Mm濾膜依次過濾，濾液即為核桃蛋白抗原溶液，然后測定蛋白濃度，調(diào)整至6 10mg/mL，分裝，_20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明中所述抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下
1)將純化的核桃蛋白抗原與弗氏完全佐劑以質(zhì)量(g):體積(ml)^ 0. OOOl的比例混合乳化15飛0分鐘，乳化完全后于新西蘭大白兔后頸背部皮下多點(diǎn)注射，此為基礎(chǔ)免疫；
2)之后每隔兩周抗原與弗氏不完全佐劑以質(zhì)量(g):體積(ml)^ 0. 00005混合、乳化，進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫；第二次加強(qiáng)免疫前，采集血清2mL，ELISA法檢測效價(達(dá)到IO6左右)；兩周后靜脈注射純抗原，沖刺免疫一次；
3)最后一次免疫7天后，按公知的血清制備方法采血，采血IOOmL/只，置于37°C恒溫箱中2h，4°C過夜；第二天，4°C IOOOOg離心10分鐘，收集上清即得抗核桃蛋白多克隆抗體，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明中所述用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒的檢測方法，具體操作如下
1)包被將標(biāo)準(zhǔn)核桃蛋白和樣品核桃制品用稀釋液分別稀釋成為不同的濃度，并加入酶標(biāo)板，100ML/孔、37°C孵育2h，4°C過夜；
2)洗滌棄包被液，在吸水紙上拍干，加洗滌液300ML/孔，微震3min/次，洗滌3次；
3)封閉用含5%脫脂牛奶的PBST封閉液封閉，200ML/孔，37°C孵育2h；
4)洗滌同步驟2);
5)加一抗加稀釋過的一抗，一抗溶液的最終效價23以上，IOOML/孔，以免疫前兔血清為陰性對照，空白只加血清稀釋液，37°C孵育Ih ；
6)洗滌同步驟2);
7)加酶標(biāo)二抗稀釋2000倍的二抗，IOOML/孔，37°C孵育Ih；
8)洗滌同步驟2);
9)加底物顯色液100ML/孔，室溫避光孵育5-10min；
10)加終止液:100ML/孔；
11)檢測OD值酶標(biāo)儀測定OD450值；
12)根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD■，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程；
13)用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃制品溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD■中有線性關(guān)系的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出核桃制品中核桃蛋白的含量，從而可以分析出樣品中核桃蛋白的濃度，再根據(jù)核桃制品凱氏定氮法測定得到總蛋白含量，即可計(jì)算出核桃制品中是否摻有非核桃蛋白以及摻入程度。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下
1)本發(fā)明首次公開一種核桃蛋白定量檢測的間接ELISA試劑盒及其檢測方法，可以定量定性分析樣品中核桃蛋白，適合工廠化生產(chǎn)，也適合公司廠家對核桃類產(chǎn)品的嚴(yán)格監(jiān)控；
2)本發(fā)明試劑盒所有試劑均為已配制好的工作液，可以簡便、快速、靈敏的檢測核桃類產(chǎn)品(粉、露、奶、乳等)中核桃蛋白含量；并且本試劑盒樣本用量少，試劑保存時間長，對操作者無毒性，對環(huán)境無污染；因此，本發(fā)明建立制備的核桃蛋白定量檢測的間接ELISA試劑盒具有廣闊的市場前景和重大的社會意義；
3)使用本發(fā)明試劑盒檢測準(zhǔn)確、過程簡單快速、靈敏度高、成本低，可滿足相關(guān)企業(yè)單位批量檢測核桃及相關(guān)產(chǎn)品中核桃蛋白含量和摻假檢驗(yàn)的需要。4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測范圍在800ng/ml-25ng/ml，回收率范圍均在85% 115%之 間；且特異性較好，與其他植物堅(jiān)果如，花生、大豆、芝麻均無交叉反應(yīng)。


圖I為本發(fā)明對核桃蛋白定量檢測的間接ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例I :用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，包括如下組分
(1)陽性抗原核桃蛋白10ML,蛋白濃度9mg/ml；
(2)一抗抗核桃蛋白多克隆抗體10ML，效價IO3 ；
其它為ELISA試劑盒公知的組分
1)ELISA 96孔酶標(biāo)板每個試劑盒裝有兩塊真空包裝的ELISA板，每塊ELISA板含有可拆卸的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔X 12條；
2)酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液IOML；
3)陰性血清免疫前兔血清原液50ML；
4)底物顯色液:0.I %。TMB，30mL ；
5)終止液2M的硫酸溶液50mL；
6)洗滌劑:0.IM pH7. 4 PBST 溶液 150mL ；
7)含5%脫脂牛奶的PBST50mL,作為封閉液、血清稀釋液和抗體稀釋液。本實(shí)施例中陽性抗原核桃蛋白的制備方法如下
1)按每克磨好的核桃粉添加IOml的石油醚的比例，用石油醚對核桃粉進(jìn)行脫脂2次后，自然風(fēng)干，得脫脂核桃粉；
2)石油醚脫脂核桃粉溶解于脫脂核桃粉質(zhì)量10倍水中，調(diào)節(jié)溶液pH至12，然后在60°C水浴攪拌提取3h，再調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 5進(jìn)行沉淀；
3)然后溶液3000r/min離心20min,取上清液放入5Kd透析袋透析24h,收集透析袋內(nèi)溶液，經(jīng)0. 45Mm和0. 22Mm濾膜依次過濾，濾液即為核桃蛋白抗原溶液，然后測定蛋白濃度，調(diào)整至9mg/mL，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 本實(shí)施例中抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下
1)適應(yīng)性飼養(yǎng)新西蘭大白兔一周雌兔兩只，2.5kg/只，每天喂養(yǎng)兔子飼料一次，200g/次/只，喂水兩次；每兩天打掃兔籠衛(wèi)生，使兔子生活環(huán)境保持清潔；
2)陰性血清制備免疫前，輕輕的將兔子放在特制兔盒中，處于放松狀態(tài)的兔子采血會較容易，按壓兔子耳根部并用酒精棉球擦拭直至血管突出，然后將針頭插入耳部血管的中上部，觀察到進(jìn)針后小心抽出活塞收集血液2mL;結(jié)束收集后，退出針頭并按壓傷處以制止血流，再用乙醇消毒；取收集的血液在37°C恒溫箱中放置2h以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng)，再將試管在4°C放置過夜使血液凝固；用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，IOOOOg離心20分鐘，收集上清液，4°C保存； 3)初次免疫將純化的核桃蛋白Img與4mL弗氏完全佐劑混合，漩渦震蕩乳化半小時，乳化完全后頸背部皮下多點(diǎn)注射新西蘭大白兔，2mL/只；
4)加強(qiáng)免疫兩周后取核桃蛋白250M<g與4mL弗氏不完全佐劑的混合液，乳化后頸背部皮下注射新西蘭大白兔，2mL/只；
5)二次加強(qiáng)免疫方法同步驟4)；
6)陽性血清制備兩周后采集兔血2mL/只，方法同步驟2)；
7)檢測效價利用ELISA法檢測陽性血清中多克隆抗體的效價，檢測結(jié)果二次加強(qiáng)免疫后達(dá)到IO5 ；
8)再過兩周后核桃蛋白抗原不加佐劑進(jìn)行靜脈注射沖刺免疫一次；
9)陽性血清制備7天后頸動脈分離采血采血IOOmL/只，置于37°C恒溫箱中2h，4°C過夜；次日4°C，IOOOOg離心IOmin后收集上清，分裝，于_20°C保存?zhèn)溆?。本?shí)施例制備的核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒的檢測方法，具體操作如下
以某品牌核桃乳為例
1)樣品核桃乳；
2)包被將標(biāo)準(zhǔn)核桃蛋白溶液，按照2倍連續(xù)稀釋依次稀釋成8個不同的濃度，將不同稀釋度的陽性抗原核桃蛋白和一定稀釋度樣品溶液分別加到酶標(biāo)板中，IOOML/孔，37°C孵育2h，4°C過夜；
3)洗滌棄包被液，在吸水紙上拍干，加洗滌液300ML/孔，微震3min/次，洗滌3次；
4)封閉用含5%脫脂牛奶的PBST封閉液封閉，200ML/孔，37°C孵育2h；
5)洗滌同步驟3);
6)加一抗加100X稀釋的一抗溶液(最終效價23)，100ML/孔，以正常兔血清為陰性對照，空白只加血清稀釋液，37°C孵育Ih ；
7)洗滌同步驟3);
8)加酶標(biāo)二抗稀釋2000倍的二抗，IOOML/孔，37°C孵育Ih；
9)洗滌同步驟3);
10)加底物顯色液100ML/孔，室溫避光孵育IOmin；
11)加終止液:100ML/孔；
12)檢測OD值酶標(biāo)儀測定OD450值；
13)用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD45tl，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程 Y=O. 0024x+0. 2715，R2=O. 9828 ；
14)用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃乳溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD■中有線性關(guān)系的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出核桃乳中核桃蛋白的含量，從而可以分析出核桃粉中核桃蛋白的濃度，再根據(jù)核桃乳凱氏定氮總蛋白含量計(jì)算出核桃粉中其它蛋白的摻入程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品OD值，算出核桃乳中核桃蛋白含量為1%，標(biāo)簽上注明的蛋白含量0. 7%比較，可以認(rèn)為該核桃乳為合格產(chǎn)品，即并未摻入其它大豆蛋白等非核桃蛋白。
實(shí)施例2 :用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，包括如下組分
(1)陽性抗原核桃蛋白10ML,蛋白濃度6mg/ml；
(2)一抗抗核桃蛋白多克隆抗體10ML，效價IO5 ；
其它為ELISA試劑盒公知的組分
1)ELISA 96孔酶標(biāo)板每個試劑盒裝有兩塊真空包裝的ELISA板，每塊ELISA板含有可拆卸的ELISA微孔板條，規(guī)格為8條X 12孔；
2)酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液IOML；
3)陰性血清免疫前兔血清原液50ML；
4)底物顯色液:0.I %。TMB，30mL ；
5)終止液2M的硫酸溶液50mL；
6)洗滌劑:0.IM pH7. 4 PBST 溶液 150mL ；
7)含5%脫脂牛奶的PBST50mL,作為封閉液、血清稀釋液和抗體稀釋液。本實(shí)施例中陽性抗原核桃蛋白的制備方法如下
1)按每克磨好的核桃粉添加5ml的石油醚的比例,用石油醚對核桃粉進(jìn)行脫脂3次后，自然風(fēng)干，得脫脂核桃粉；
2)石油醚脫脂核桃粉溶解于核桃粉質(zhì)量5倍水中，調(diào)節(jié)溶液pH至11，然后在55°C水浴攪拌提取2h，再調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 0進(jìn)行沉淀；
3)然后溶液3000r/min離心20min,取上清液放入5Kd透析袋透析48h,收集透析袋內(nèi)溶液，經(jīng)0. 45Mm和0. 22Mm濾膜依次過濾，濾液即為核桃蛋白抗原溶液，然后測定蛋白濃度，調(diào)整至6mg/mL，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩１緦?shí)施例中抗核桃蛋白多克隆抗體的制備方法如下
1)適應(yīng)性飼養(yǎng)新西蘭大白兔一周雌兔兩只，2.5kg/只，每天喂養(yǎng)兔子飼料一次，200g/次/只，喂水兩次；每兩天打掃兔籠衛(wèi)生，使兔子生活環(huán)境保持清潔；
2)陰性血清制備免疫前，輕輕的將兔子放在特制兔盒中，處于放松狀態(tài)的兔子采血會較容易，按壓兔子耳根部并用酒精棉球擦拭直至血管突出，然后將針頭插入耳部血管的中上部，觀察到進(jìn)針后小心抽出活塞收集血液2mL;結(jié)束收集后，退出針頭并按壓傷處以制止血流，再用乙醇消毒；取收集的血液在37°C恒溫箱中放置2h以防止激活補(bǔ)體系統(tǒng)，再將試管在4°C放置過夜使血液凝固；用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，IOOOOg離心20分鐘，收集上清液，4°C保存；
3)初次免疫將純化的核桃蛋白Img與2mL弗氏完全佐劑混合，漩渦震蕩乳化半小時，乳化完全后頸背部皮下注射新西蘭大白兔，2mL/只；4)加強(qiáng)免疫兩周后取核桃蛋白250M<g與4mL弗氏不完全佐劑的混合液，乳化后頸背部皮下注射新西蘭大白兔，2mL/只；
5)二次加強(qiáng)免疫方法同步驟4)；
6)陽性血清制備兩周后采集兔血2mL/只，方法同步驟2)；
7)檢測效價利用ELISA法檢測陽性血清中多克隆抗體的效價，檢測結(jié)果二次加強(qiáng)免疫后達(dá)到IO6 ；
8)再過兩周后蛋白不加佐劑進(jìn)行靜脈注射沖刺免疫一次；
9)陽性血清制備7天后頸動脈分離采血，37°C靜止2h，于4°C過夜，次日4°C，IOOOOg 離心IOmin后收集上清，分裝于-20°C保存。本實(shí)施例制備的核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒的檢測方法，具體操作如下
以某品牌核桃粉為例
I)樣品前處理首先將提取緩沖液預(yù)熱至60°C，再以料液比為I:10 (W/V)將樣品與提取緩沖液充分混合，室溫震蕩15min，最后10000g、常溫條件下離心IOmin ;得到的上清進(jìn)行適當(dāng)稀釋即可。2)包被將標(biāo)準(zhǔn)核桃蛋白液和樣品核桃粉懸浮乳液用稀釋液分別以2倍連續(xù)稀釋成為12個不同的濃度，將不同稀釋度的陽性抗原核桃蛋白和樣品溶液分別加到酶標(biāo)板中，100ML/ 孔，37°C孵育 2h，4°C過夜；
3)洗滌棄包被液，在吸水紙上拍干，加洗滌液300ML/孔，微震3min/次，洗滌3次；
4)封閉用含5%脫脂牛奶的PBST封閉液封閉，200ML/孔，37°C孵育2h；
5)洗滌同步驟3);
6)加一抗加100X稀釋的一抗溶液(最終效價25)，100ML/孔，以正常兔血清為陰性對照，空白只加血清稀釋液，37°C孵育Ih ；
7)洗滌同步驟3);
8)加酶標(biāo)二抗稀釋2000倍的二抗，IOOML/孔，37°C孵育Ih；
9)洗滌同步驟3);
10)加底物顯色液100ML/孔，室溫避光孵育5min；
II)加終止液:100ML/孔；
12)檢測OD值酶標(biāo)儀測定OD450值；
13)用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD45tl,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Y=O. 0024x+0. 2715，R2=O. 9828 ；
14)用不同稀釋度(即不同濃度)的核桃粉溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD■中有線性關(guān)系的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出核桃粉中核桃蛋白的含量，從而可以分析出樣品中核桃蛋白的濃度，再根據(jù)核桃乳凱氏定氮總蛋白含量計(jì)算出核桃粉中其它蛋白的摻入程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品OD值，算出核桃該品牌核桃粉中核桃蛋白含量為3. 1%，凱氏定氮法測得的蛋白含量> 6. 3%比較，表明該核桃粉有一半以上的蛋白來自其它原料或標(biāo)簽上注明的大豆蛋白。實(shí)施例3 :通過ELISA實(shí)驗(yàn)確定回收率范圍均在85% 115%之間本實(shí)施例的具體實(shí)施方法為選擇如下濃度的核桃蛋白溶液800ng/ml、600ng/ml、400ng/ml、300ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、50ng/ml (即為真實(shí)值)，利用間接 ELISA 法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測得出相應(yīng)核桃蛋白濃度(即為測定值)，通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)、計(jì)算得到回收率見表I。_ 表I :核桃蛋白回收率檢測結(jié)果
其月望值(ng/mL) 測定值(ng/mL) 回收率(％) S_CV (%)
權(quán)利要求
1.一種用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，包括陽性抗原、一抗、ELISA酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、稀釋液、封閉液、底物顯色液、終止液、洗滌液、包被緩沖液，陰性血清，其特征在于陽性抗原為核桃蛋白，一抗為抗核桃蛋白多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，其特征在于陽性抗原核桃蛋白制備方法如下 1)將石油醚脫脂核桃粉溶解于脫脂核桃粉質(zhì)量5 10倍的水中，調(diào)節(jié)溶液pH至1(Γ12，然后在55飛(TC水浴攪拌提取f 3h，調(diào)節(jié)溶液pH值至6. 5^7. 5進(jìn)行沉淀； 2)沉淀后溶液進(jìn)行離心、透析，透析液濾膜過濾，濾液即為核桃蛋白抗原溶液，然后測定蛋白濃度，調(diào)整至6 10mg/mL，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒，其特征在于抗核桃 蛋白多克隆抗體的制備方法如下 O將純化的核桃蛋白抗原與弗氏完全佐劑以質(zhì)量體積> O. OOOl的比例混合乳化15^60分鐘，乳化完全后免疫動物，此為基礎(chǔ)免疫； 2)之后每隔兩周抗原與弗氏不完全佐劑以質(zhì)量體積>O. 00005混合、乳化，進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫；第二次加強(qiáng)免疫前，采集血清2mL，ELISA法檢測效價；兩周后靜脈注射純抗原，沖刺免疫一次； 3)最后一次免疫7天后，按公知的血清制備方法采血，置于37°C恒溫箱中2h，4°C過夜，4°C IOOOOg離心，收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗體，分裝，于_20°C以下保存?zhèn)溆谩?br> 4.權(quán)利要求I所述用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒的檢測方法，其特征在于按如下檢測步驟進(jìn)行 1)包被將標(biāo)準(zhǔn)核桃蛋白和樣品核桃制品用稀釋液分別稀釋成為不同的濃度，并加入酶標(biāo)板，ΙΟΟμ /孔，37°C孵育2h，4°C過夜； 2)洗滌棄包被液，在吸水紙上拍干，加洗滌液300μ 7孔，微震蕩3min/次，洗滌3次； 3)封閉用含5%脫脂牛奶的PBST封閉液封閉，200μ 7孔，37°C孵育2h； 4)洗滌同步驟2); 5)加一抗加稀釋過的一抗溶液，一抗溶液的最終效價23以上，ΙΟΟμ /孔，以正常兔血清為陰性對照，空白只加血清稀釋液，37°C孵育Ih ； 6)之后采用公知的洗滌 加酶標(biāo)二抗 洗滌 加底物顯色液 加終止液diOD值檢測等ELISA常規(guī)方法進(jìn)行； 7)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同稀釋度的核桃蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD45tl，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程； 8)用不同稀釋度的核桃制品溶液經(jīng)上述步驟測定得到的OD45tl中有線性關(guān)系的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出核桃制品中核桃蛋白的含量，從而可以分析出樣品中核桃蛋白的濃度，再根據(jù)核桃制品凱氏定氮法測定得到總蛋白含量，即可計(jì)算出核桃制品中是否摻有非核桃蛋白以及摻入程度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于核桃蛋白定性定量檢測的ELISA試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括陽性抗原核桃蛋白、一抗——抗核桃蛋白多克隆抗體、陰性血清、ELISA酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、稀釋液、封閉液、底物顯色液、終止液、洗滌液，包被緩沖液，本發(fā)明是用等電點(diǎn)沉淀和透析等方法純化的核桃蛋白作為抗原，免疫動物，獲得抗核桃蛋白的多克隆抗體，將其用作間接ELISA法對核桃蛋白定量檢測及摻假檢驗(yàn)；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使用本發(fā)明試劑盒檢測準(zhǔn)確、過程簡單快速、靈敏度高，可滿足相關(guān)企業(yè)單位批量檢測核桃及相關(guān)產(chǎn)品中核桃蛋白含量和摻假檢驗(yàn)的需要。
文檔編號C07K16/16GK102967712SQ201210493990
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者陳朝銀, 方娟, 葛鋒, 劉迪秋, 熊向峰, 韓本勇, 趙聲蘭 申請人:昆明理工大學(xué)