一種從發(fā)酵液中分離純化wf11899a的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法，其包含步驟：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的發(fā)酵液0.5～3h后，固液分離；（2）去除液體部分中的醇或酮后，過大孔吸附樹脂，以甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，得濃縮液；（3）將濃縮液通過聚苯乙烯反相色譜柱，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液洗脫，HPLC跟蹤檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液，并減壓濃縮得濃縮液；（4）將步驟（3）所得的濃縮液上樣于聚苯乙烯反相色譜柱，用純水沖洗脫鹽，然后以純甲醇洗脫，所得洗脫液即為含有WF11899A的洗脫液。本發(fā)明方法對WF11899A的提取純度較高，收率高，純化工藝簡單，為從發(fā)酵液中分離純化WF11899A提供了一種高效率低成本的工業(yè)化方法。
【專利說明】—種從發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]WF11899A (FR901379)最初是從腔胞綱菌 Coleophoma sp.F-11899 的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離得到的一種脂肽類活性化合物，其分子式為C51H82N8O21S,經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾改造可得到一種抗真菌抗生素米卡芬凈(Micafungin, MFG, FK463)。但是近年來,在其他近緣種中也逐漸發(fā)現(xiàn)一些菌株可以合成WF11899A及其結(jié)構(gòu)類似物。
[0003]米卡芬凈是日本藤澤公司開發(fā)的一類新型水溶性棘白菌素類抗真菌抗生素，具有良好的醫(yī)用市場前景。其作用機制為通過非競爭性抑制β-α，3)-葡聚糖合成酶的活性來抑制真菌細胞壁合成，且對人體正常細胞影響不大。臨床實驗表明其對由念珠菌屬、曲霉菌屬引起的深度真菌感染有廣譜抗菌作用，對耐氟康唑、依曲康唑的念珠菌亦有作用。
[0004]目前關(guān)于WF11899A的純化方法主要是硅膠柱層析和離心分配色譜。文獻“WF11899A，B and C，novel antifungal lipopeptides.1.Taxonomy, fermentation, isolation and physico-chemical properties，，(((the Journal ofAntibiotics)), 1994, 47 (10):1084-1091)和歐洲專利 EP0431350A1 中都公布了一種從 Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法:發(fā)酵液用等體積的丙酮浸泡2h，過濾后去除丙酮。乙酸乙酯洗滌2次，活性物質(zhì)萃取至正丁醇相，處理后上樣于Si 60硅膠柱，利用CH2C12-甲醇混合液洗脫。濃縮后溶解在50% (體積百分比，下同)甲醇水溶液中，過ODS反相柱，用80%甲醇水溶液洗脫，再利用離心分配色譜進一步純化。包含WF11899A的目標組分液富集后，再上樣于硅膠柱、ODS反相柱，得到WF11899A洗脫液。干燥富集后溶于水，調(diào)pH至7.0，冷凍干燥后制得白色粉末WF11899A。但是這種方法存在以下缺點:1)分離純化步驟較多，操作復雜；
·2)吸附過程中存在不可逆吸附，收率較低。因此，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于WF11899A的分離純化方法均不利于在工業(yè)生產(chǎn)上推廣應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷而提供一種高效率、低成本的從含WF11899A的發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種從發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法，其包括如下步驟:
[0007](I)用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的發(fā)酵液0.5~3h后，將發(fā)酵液進行固液分離，取液體部分；所述的Cl~C4的醇或酮與含WF11899A的發(fā)酵液的體積比為1:
2 ~3: I ；
[0008](2)去除步驟(1)得到的液體部分中的Cl~C4的醇或酮后，過大孔吸附樹脂，以甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，并減壓濃縮，得濃縮液；
[0009](3)將步驟(2)所得的濃縮液通過聚苯乙烯反相色譜柱，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液洗脫，對洗脫過程進行HPLC跟蹤檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液，并減壓濃縮，得濃縮液；在所述的乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液中，乙腈的體積百分比為40%~60%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.4%~0.6% ；
[0010](4)將步驟(3)所得的濃縮液上樣于聚苯乙烯反相色譜柱，用純水沖洗脫鹽，然后以純甲醇洗脫，所得洗脫液即為含有WF11899A的洗脫液。
[0011]本發(fā)明中，步驟(1)所述的含WFl 1899A的發(fā)酵液可以是任何已知的含有WFl 1899A的菌體發(fā)酵液，優(yōu)選Coleophoma sp.F-11899發(fā)酵液。所述的Coleophoma sp.F-11899發(fā)酵液可以通過現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的培養(yǎng)Coleophoma sp.F-11899的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得，較佳地如歐洲專利EP0431350A1中公開的培養(yǎng)基配方，具體包括:斜面、平板培養(yǎng)基配方為(g/L):玉米粉17、KH2PO4 0.3、MgSO4.7H20 0.3、瓊脂20、pH 6.5 ;種子培養(yǎng)基配方為(g/L):蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH2PO4 2、CaCO3 2、pH自然，另加入1%。(v/v)的Tween-80 ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):可溶性淀粉60、葡萄糖10、小麥胚芽粉10、棉籽蛋白粉 5, KH2PO4 20, Na2HPO4.2H20 15, MgSO4.7H20 0.5、ZnSO4.7H20 UpH 自然。
[0012]步驟(1)所述的固液分離的方法可以是已知的任何可以使菌體發(fā)酵液實現(xiàn)固液分離的方法，如離心分離法、過濾法、靜置沉淀法等，本發(fā)明優(yōu)選離心分離法；所述離心分離法為本領(lǐng)域常規(guī)的離心操作；較佳地，所述離心分離法的條件為以2000~6000r/min離心10~40min ;更佳地,所述離心分離法的條件為以4000r/min離心20min。所述Cl~C4的醇或酮可以是本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地選自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一種，優(yōu)選丙酮。所述用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的發(fā)酵液的時間較佳地為1.5~3h，更佳地為2h。
[0013]本發(fā)明步驟(2)中，所述的大孔吸附樹脂可以為非極性、弱極性或中等極性大孔吸附樹脂，優(yōu)選X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一種。所述的甲醇水溶液中甲醇的體積百分比較佳地為60%~100%，更佳的為85~95%。所述的去除步驟(1)得到的液體部分中的Cl~C4的醇或酮的方式可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方式，優(yōu)選減壓去除。
[0014]本發(fā)明步驟(3)中，所述的聚苯乙烯反相色譜柱可以是本領(lǐng)域常規(guī)的聚苯乙烯反相色譜柱，優(yōu)選PS25-300或NMPS-100。在所述的乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液中，乙腈的體積百分比優(yōu)選40~45%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比優(yōu)選0.5%。
[0015]本發(fā)明步驟(4)中，所述的HPLC的檢測條件為本領(lǐng)域常規(guī)的HPLC檢測條件，較佳地為=Agilent XDB-C18柱，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為45%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%)為流動相，流速為1.0ml/min,進樣量20 μ 1，柱溫30°C，檢測波長212nm。在所述脫鹽的處理過程中，純水體積較佳地為柱體積的2~3倍。
[0016]本發(fā)明中，較佳地，在步驟(4)之后還包括步驟(5):將步驟(4)所得的含有WF11899A的洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并進行真空干燥，從而得到白色粉末狀固體，即WF11899A產(chǎn)品。
[0017]在符合本領(lǐng)域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0018]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019]本發(fā)明的積極進步效果在于:根據(jù)本發(fā)明方法可有效地將WF11899A從Coleophoma sp.F-11899發(fā)酵液等含有WF11899A的發(fā)酵液中分離出來，其中WF11899A的純度可達到91%以上，收率可達到70%以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法對WFl 1899A的提取純度較高，收率高，純化工藝簡單，成本較低，為從發(fā)酵液中分離WF11899A提供了一種高效率低成本的工業(yè)化方法。
【具體實施方式】
[0020]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0021]下述實施例中，部分材料和設備的來源如下:
[0022]1.大孔吸附樹脂
[0023](I) X-5:日本三菱化學株式會社產(chǎn)品；
[0024](2 ) XAD-2、XAD-7:美國羅門哈斯產(chǎn)品；
[0025](3)ADS-17:天津南開和成科技有限公司產(chǎn)品。
[0026]2.聚苯乙烯反相樹脂:
[0027]PS25-300、NMPS-100:天津南開和成科技有限公司產(chǎn)品。
[0028]在下述實施例中，含有WF11899A的發(fā)酵液的獲得按如下方式進行。
[0029]菌種:Coleophomasp.F-11899。
[0030]將經(jīng)過生產(chǎn)能力·驗證、生長良好的菌種Coleophoma sp.F-11899,以脫脂牛奶作為保護劑，用真空冷凍的方式保存。使用時將菌種轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)6天，然后分離純化I次，將合格菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)6天，保存于4°C冰箱，7天內(nèi)可隨時作為發(fā)酵培養(yǎng)菌種。發(fā)酵種子培養(yǎng)溫度為28°C,搖瓶培養(yǎng)時間4天，轉(zhuǎn)速為240r/min。種子罐的培養(yǎng)時間隨種子罐的大小而變，以種子質(zhì)量為最終控制標準。在本實施方式中，由于實驗室主要是發(fā)酵小試階段，采用5L或IOL種子罐，裝液量在50%左右，溫度為28°C，轉(zhuǎn)速在220r/min-240r/min，培養(yǎng)時間為4_5天。在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)溫度為28°C，調(diào)控溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)，并補加葡萄糖、氨基酸和水。當發(fā)酵液中的WF11899A的效價不再有明顯的上升趨勢、其他發(fā)酵參數(shù)表現(xiàn)為發(fā)酵已接近終結(jié)階段時就可以放罐，發(fā)酵時間一般為9天左右。
[0031]以上工作中所用培養(yǎng)基引入歐洲專利EP0431350A1中公開的培養(yǎng)基配方，具體如下:斜面、平板培養(yǎng)基配方為(g/L):玉米粉17、KH2PO4 0.3、MgSO4.7H20 0.3、瓊脂20、pH
6.5 ;種子培養(yǎng)基配方為(g/L):蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH2PO4 2、CaCO3 2、pH自然，另加入1%。(v/v)的Tween-80 ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):可溶性淀粉60、葡萄糖 10、小麥胚芽粉 10、棉籽蛋白粉 5、KH2PO4 20、Na2HPO4.2H20 15、MgSO4.7H20 0.5、ZnSO4.7H20 1、pH 自然。
[0032]需要說明的是，通過發(fā)酵產(chǎn)生WF11899A的其他菌株的發(fā)酵液也適用于本發(fā)明的方法。
[0033]實施例1
[0034]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液 500ml,加入 500ml 丙麗，浸泡提取 1.5h, 4000r/min離心20min得上清液，其中WF11899A的濃度為260μ g/ml。上清液減壓去除丙酮后，過ADS-17大孔吸附樹脂，以60%的甲醇水溶液進行洗脫，流速為2BV，收集洗脫液600ml。洗脫液減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為40%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%)進行洗脫，線性流速為lOcm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液300ml，其中WF11899A的濃度為368μ g/ml。減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，先以200ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥得到白色粉末狀固體WF11899A 116mg,純度為91.7%，收率為82.1%。
[0035]實施例2
[0036]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液4.5L,加入 2.25L丙酮，浸泡提取 3h,4000r/min離心20min得上清液，其中WF11899A的濃度為400μ g/ml。上清液減壓去除丙酮后，過XAD-7大孔吸附樹脂，以90%甲醇水溶液進行洗脫，流速為3BV，收集洗脫液600ml。洗脫液減壓濃縮后，過PS25-300反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為45%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.4%)進行洗脫，線性流速為8cm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液530ml，其中WF11899A的濃度為1372 μ g/ml。減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，先以500ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥得到白色粉末狀固體WF11899A 796mg,純度為91.0%，收率為 80.5%ο
[0037]實施例3
[0038]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液 10.0L，加入 30.0L 丙酮，浸泡提取 0.5h,6000r/min離心10min得上清液，其中WF11899A的濃度為78.7 μ g/ml。上清液減壓去除丙酮后，過X-5大孔吸附樹脂，以100%甲醇進行洗脫，流速為2BV，收集洗脫液1200ml。洗脫液減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為60%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.6%)進行洗脫，線性流速為lOcm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收 集WFl 1899A純度大于90%的洗脫液780ml，其中WFl 1899A的濃度為2260 μ g/ml。減壓濃縮后，過PS25-300反相樹脂，先以800ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥后得到白色粉末狀固體WF11899A 1941mg,純度為91.3%，收率為75.1%。
[0039]實施例4
[0040]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液 10.0L，加入 10.0L 甲醇，浸泡提取 2h，2000r/min離心40min得上清液，其中WF11899A的濃度為162 μ g/ml。上清液減壓去除丙酮后，過XAD-2大孔吸附樹脂，以90%甲醇水溶液進行洗脫，流速為2BV，收集洗脫液800ml。洗脫液減壓濃縮后，過PS25-300反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為45%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%)進行洗脫，線性流速為lOcm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收集WFl 1899A純度大于90%的洗脫液530ml，其中WFl 1899A的濃度為2256 μ g/ml。減壓濃縮后，過PS25-300反相樹脂，先以400ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥后得到白色粉末狀固體WF11899A 1236mg,純度為92%，收率為70.2%。
[0041]實施例5
[0042]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液 500ml,加入 500ml 乙醇，浸泡提取 1.5h, 4000r/min離心20min得上清液，其中WF11899A的濃度為200 μ g/ml。上清液減壓去除丙酮后，過ADS-17大孔吸附樹脂，以60%的甲醇水溶液進行洗脫，流速為3BV，收集洗脫液500ml。洗脫液減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為50%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%)進行洗脫，線性流速為lOcm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液300ml，其中WF11899A的濃度為309 μ g/ml。減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，先以300ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥后得到白色粉末狀固體WF11899A 89.7mg,純度為90.3%，收率為81%。
[0043]實施例6
[0044]Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液 5L,加入 5L 正丁醇，浸泡提取 2h, 4000r/min 離心20min得上清液，其中WF11899A的濃度為USμg/ml。上清液減壓去除丙酮后，過ADS-17大孔吸附樹脂，以60%的甲醇水溶液進行洗脫，流速為2BV，收集洗脫液900ml。洗脫液減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液(其中，乙腈的體積百分比為40%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%)進行洗脫，線性流速為lOcm/h，并對洗脫過程進行HPLC檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液500ml，其中WF11899A的濃度為1087μ g/ml。減壓濃縮后，過NMPS-100反相樹脂，先以400ml純水沖洗脫鹽，再以純甲醇沖洗，收集洗脫液，旋蒸得到固體，真空干燥后得到白色粉末狀固體WF11899A 522mg,純度為91%，收率 為76.0%。
【權(quán)利要求】
1.一種從發(fā)酵液中分離純化WF11899A的方法，其特征在于，其包括如下步驟: (1)用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的發(fā)酵液0.5~3h后，將發(fā)酵液進行固液分離，取液體部分；所述的Cl~C4的醇或酮與含WF11899A的發(fā)酵液的體積比為1: 2~3:1; (2)去除步驟(1)得到的液體部分中的Cl~C4的醇或酮后，過大孔吸附樹脂，以甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，并減壓濃縮，得濃縮液； (3)將步驟(2)所得的濃縮液通過聚苯乙烯反相色譜柱，以乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液洗脫，對洗脫過程進行HPLC跟蹤檢測，分段收集WF11899A純度大于90%的洗脫液，并減壓濃縮，得濃縮液；在所述的乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液中，乙腈的體積百分比為40%~60%，磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.4%~0.6% ； (4)將步驟(3)所得的濃縮液上樣于聚苯乙烯反相色譜柱，用純水沖洗脫鹽，然后以純甲醇洗脫，所得洗脫液即為含有WF11899A的洗脫液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的含WF11899A的發(fā)酵液為Coleophoma sp.F-11899 發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的固液分離的方法為離心分離法。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于,所述離心分離法的條件為以2000~6000r/min 離心 10 ~40min。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述Cl~C4的醇或酮選自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一·種。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的發(fā)酵液的時間為1.5~3h。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的大孔吸附樹脂為X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一種；所述的甲醇水溶液中甲醇的體積百分比為60%~100%。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述的聚苯乙烯反相色譜柱為 PS25-300 或 NMPS-100。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中所述的乙腈、磷酸二氫銨和水的混合溶液中，乙腈的體積百分比為40~45%,磷酸二氫銨的質(zhì)量百分比為0.5%。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(4)之后還包括步驟(5):將步驟(4)所得的洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并進行真空干燥，從而得到白色粉末狀固體，即WF11899A女口廣叩ο
【文檔編號】C07K7/56GK103848900SQ201210514096
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月4日
【發(fā)明者】蘆現(xiàn)杰, 胡海峰, 朱寶泉, 張長清 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院