專利名稱：一種防治自然流產(chǎn)的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種防治自然流產(chǎn)的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自然流產(chǎn)是妊娠早期常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率約占全部妊娠的15-20%。近年來(lái)，自然流產(chǎn)率在全球呈現(xiàn)了逐年上升的變化趨勢(shì)，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的深切關(guān)注。由于我國(guó)的人口基數(shù)大，其中育齡夫婦的數(shù)量尤為可觀，以2007年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為例，育齡婦女的人數(shù)約為
3.61億，而在妊娠早期發(fā)生自然流產(chǎn)者遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)100萬(wàn)。因此深入研究女性自然流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制開(kāi)始成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。近年來(lái)研究顯示細(xì)胞凋亡在胚胎著床、胎盤(pán)的發(fā)育老化以及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用。各種原因所致的自然流產(chǎn)最終是以細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。目前，細(xì)胞凋亡在妊娠中的作用日益受到重視，越來(lái)越多的研究表明正常妊娠過(guò)程中胎盤(pán)、蛻膜的凋亡和增殖處于一種平衡狀態(tài)，一旦發(fā)生異常凋亡，平衡狀態(tài)被打破就可能導(dǎo)致病理妊娠，引發(fā)自然流產(chǎn)的發(fā)生。`gClqR是補(bǔ)體Clq受體，由于日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)gClqR可介導(dǎo)單核細(xì)胞的凋亡，且能夠錨定在線粒體上影響單核細(xì)胞的功能，在多種細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Clq-gClqR復(fù)合體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的正常通訊中起抑制作用的觀點(diǎn)是近年來(lái)提出的新理論。近年來(lái)，單克隆抗體在疾病的診斷和治療預(yù)防方面特異性強(qiáng)，靈敏度高，顯示了非常明顯的優(yōu)越特性。但是，目前尚沒(méi)有g(shù)ClqR單克隆抗體對(duì)自然流產(chǎn)有何種影響的報(bào)道，也沒(méi)有利用gClqR單克隆抗體制備防治自然流產(chǎn)的藥物上市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題提供一種防治自然流產(chǎn)的單克隆抗體。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述單克隆抗體在制備防治自然流產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的—種抗自然流產(chǎn)的單克隆抗體,該單克隆抗體為gClqR單克隆抗體。優(yōu)選該gClqR單克隆抗體為美國(guó)Millipore公司貨號(hào)為AB2991的產(chǎn)品。gClqR單克隆抗體在制備防治自然流產(chǎn)藥物中的應(yīng)用。gClqR單克隆抗體在制備抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證明了 gClqR單克隆抗體具有防治自然流產(chǎn)的功能，可用于制備防治自然流產(chǎn)的藥物。以下是更為詳細(xì)的說(shuō)明。在我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示自然流產(chǎn)患者其蛻膜組織中滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡明顯，且電鏡下有凋亡小體形成，而細(xì)胞膜、細(xì)胞器卻相對(duì)完整，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征(見(jiàn)圖1、2)。我們采用Western blot技術(shù)對(duì)自然流產(chǎn)者蛻膜組織中g(shù)ClqR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其gClqR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(見(jiàn)圖3)。據(jù)此，我們提出科學(xué)問(wèn)題自然流產(chǎn)的機(jī)制由Clq-gClqR復(fù)合體致線粒體功能損傷的機(jī)制介導(dǎo)，gClqR基因在自然流產(chǎn)患者體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)可通過(guò)線粒體功能障礙的機(jī)制，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，最終引發(fā)流產(chǎn)。應(yīng)用gClqR 單克隆抗體(gClqR monoclonal antibody, gClqR mAb)封閉 gClqR,使 Clq 和 gClqR 的結(jié)合受阻，從而抑制了 Clq-gClqR復(fù)合體致線粒體功能損傷，減少了滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，有效降低自然流產(chǎn)的發(fā)生率。我們以體外培養(yǎng)的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo為研究工具，探索gClqR mAb對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)①gClqR mAb干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞后，滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡顯著減少(見(jiàn)圖4)-’②GFP-gClqR vector干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞后，電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少，嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀；熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體拷貝數(shù)顯著減少，突光探針H2DCFDA (2’，7’ -Dichlorofluoresceindiacetate, 2'，7’ - 二氯熒光黃雙乙酸鹽)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS含量顯著升高(見(jiàn)圖5A-5C)，而gClqR mAb組，上述滋養(yǎng)層細(xì)胞線粒體形態(tài)、數(shù)量、功能無(wú)顯著改變。分析上述結(jié)果可見(jiàn)①GFP-gClqR vector干預(yù)下發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo中g(shù)ClqR蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)的同時(shí)也獲得了線粒體形態(tài)、數(shù)量、功能變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；②gClqR單克隆抗體干預(yù)不·但抑制了滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo的凋亡，而且線粒體功能受損顯著減少，進(jìn)一步為gClqR單克隆抗體防治自然流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制提供了支持依據(jù)。因此我們得出結(jié)論gClqR引發(fā)自然流產(chǎn)，主要由Clq-gClqR復(fù)合體致線粒體功能損傷的機(jī)制介導(dǎo)，通過(guò)線粒體功能障礙的機(jī)制，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，最終引發(fā)自然流產(chǎn)。故由gClqR蛋白引發(fā)自然流產(chǎn)防治的環(huán)節(jié)可立于線粒體功能改善的層面,而且也可在gClqR作為干預(yù)靶標(biāo)的層面。本發(fā)明有益效果本發(fā)明研究證明了 gClqR單克隆抗體具有防治自然流產(chǎn)的作用，可用于制備防治自然流產(chǎn)的藥物，為防治自然流產(chǎn)提供了更多選擇。


圖1為流產(chǎn)患者蛻膜組織滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡情況。圖2為流產(chǎn)患者蛻膜組織滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡小體。圖3為蛻膜組織中g(shù)ClqR蛋白的表達(dá)水平。圖1、2、3中A :人工流產(chǎn)蛻膜組織，B 自然流產(chǎn)蛻膜組織。圖4滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的凋亡情況。圖5A滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的線粒體形態(tài)。圖5B滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo中線粒體拷貝數(shù)。圖5C滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo內(nèi)活性氧ROS的影響。圖 4、5A、5B、5C 中 A:GFP_gClqR vector 組，B gClqR mAb 組。具體實(shí)施方法以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1一、實(shí)驗(yàn)材料與方法(一)材料
1、研究對(duì)象收集2008年I月2010年12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院行自然流產(chǎn)患者50例，以頻數(shù)匹配法選擇正常妊娠行人工流產(chǎn)50例作為對(duì)照，且患者和其家屬知情同意。手術(shù)取材后立即置于_80°C凍存?zhèn)溆谩?、細(xì)胞株滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo購(gòu)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。3、儀器與試劑MEM (minimal essential medium,最低必須培養(yǎng)基)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。青霉素、鏈霉素來(lái)源于上海生工生物技術(shù)公司?？剐∈蠖辜癊CL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)610_4312)。Annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate,異硫氰酸突光素)/PI (propidiu-m iodide,碘化丙碇)流式細(xì)胞儀檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。小鼠抗大鼠 gClqR單克隆抗體(gClqR monoclonal antibody, gClqR mAb)購(gòu)自 Millipore 公司(貨號(hào)AB2991)，小鼠抗actin 單克隆抗體，購(gòu)自Millipore公司(貨號(hào)AB3265)。胰蛋白酶、DMSO (二甲基亞諷)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Trizol來(lái)源于Invitrogen公司。Oligo (dT) 15、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶M_MLV、Taq DNA酶及dNTPs購(gòu)自美國(guó)Promega公司。DEPC(二乙基焦碳酸乙酯)來(lái)源于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。Western blot試劑高分子量蛋白質(zhì)Marker (KD)購(gòu)于武漢博士德公司。硝酸纖維素膜來(lái)源于上海博亞生物技術(shù)有限公司。乙腈(分析純)，氯化鈉(分析純)，丙酮(色譜純)。(二)試驗(yàn)方法1、滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo的培養(yǎng)將細(xì)胞接種于完全營(yíng)養(yǎng)液中，每25m2培養(yǎng)瓶中，每瓶含5mL完全營(yíng)養(yǎng)液(含15%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，非必需氨基酸10ml/L及MEM，pH7. 2)，置于5%C02、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，于3d后換液,去非貼壁細(xì)胞,此后每3d換液I次,并在倒置顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察細(xì)胞形態(tài)。2、滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo的傳代培養(yǎng)IOd左右，貼壁細(xì)胞70_80%融合時(shí)，用無(wú)Ca2+、Mg2+的Hanks液沖洗培養(yǎng)瓶?jī)纱?每25m2培養(yǎng)瓶中加入O. 5%胰蛋白酶/0. 53mmol/LEDTA1. 5mL,于37°C孵箱中孵育消化5min后，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞變圓時(shí)立即加入完全營(yíng)養(yǎng)液終止反應(yīng)，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫落形成細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液于離心管1000r/min，離心5min。吸去上清，用完全營(yíng)養(yǎng)液稀釋至所需濃度轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(按1:2的比例接種傳代)，置于5%C02、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3-4d)可繼續(xù)傳代。3、電鏡將滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo接種于25m2培養(yǎng)瓶，接種后第二天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下，離心，沉淀的細(xì)胞團(tuán)用2. 5%戊二醛及1%鋨酸雙固定，Epon812包埋，超薄切片、染色，在JEM-1010透射電鏡下觀察細(xì)胞(凋亡、壞死)超微結(jié)構(gòu)的病理改變。4、重組載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank上gClqR cDNA序列，由杭州赫貝科技有限公司設(shè)計(jì)合成 2 條引物gl:5' -GCC AAG CTT AAT GGC AGA TGA TTT-3'，g2:5/ -GTG CGCGCC AGT CTT CGA AGT AG-3'。在引物中分別加入Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)。取O. 5 μ LcDNA模板，以gl/g2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序94°C預(yù)變性lmin，94°C變性lmin，58°C退火45s，72 °C延伸1. 5min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用天為時(shí)代的PCR純化試劑盒(型號(hào)D6492)進(jìn)行回收純化。用Xho I和BamH I雙酶切PCR純化回收產(chǎn)物及載體pcDNA_3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)。在O. 5mL離心管內(nèi)依次加入T4DNA連接酶緩沖液I μ L、T4DNA連接酶(lOU/i! L) 0. L、載體pcDNA3.1 (酶切純化產(chǎn)物)lOOng、目的基因(PCR酶切純化產(chǎn)物)10ng、加入ddH20使得總體積10 u L，室溫連接2h，構(gòu)建pcDNA3. 1-gClqR。參照分子克隆方法，轉(zhuǎn)化DH5ci大腸埃希菌，篩選3-5個(gè)陽(yáng)性克隆、擴(kuò)增。抽提陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒，進(jìn)行Xho I和BamH I雙酶切，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，重組子插入片段的序列測(cè)定由上海博亞公司協(xié)助完成。5、免疫印跡提取流產(chǎn)患者蛻膜組織的胞漿蛋白，每個(gè)樣本取IOOy g總蛋白上樣，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝纖膜置于封閉液中室溫封閉l_2h后放進(jìn)含抗gClqR單克隆抗體(Temecula, CA，USA)釋液中，37°C孵育2h，TBST洗滌15minX3次。將膜放進(jìn)含抗大鼠IgG 二抗(中國(guó)北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)稀釋液中，在搖床上室溫孵育lh，TBST洗滌15minX3次。加入顯色液，避光反應(yīng)5min，在暗室中剪適合大小的膠片壓在膜上20s，將膠片放入顯影液中反應(yīng)lmin，取出滴干液體放入水中沖洗，然后放入定影液中定影5s，蒸餾水沖洗。6、蛻膜組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)將冰凍組織切片置10%的中性甲醛中，于室溫固定IOmin后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇乙酸(體積比2 :1)的溶液中，于-20°C處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。色缸中加入含2%過(guò)氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上加2滴TdT酶緩沖液(Trlzma堿3. 63g用0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至7. 2，加ddH20定容到IOOOmL ;再加入二甲砷酸鈉29. 96g和氯化鈷0. 238g)，置室溫l_5min。用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上滴加54 ii LTdT酶反應(yīng)液(TdT酶32 ii L ；TdT酶緩沖液76 u L)，置濕盒中于37V反應(yīng)lh，(注意陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的反應(yīng)液)。將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37°C的洗滌于終止反應(yīng)緩沖液，于37°C保溫30min,每IOmin將載玻片輕輕提起和放下一次,使液體輕微攪動(dòng)。用PBS洗漆3次，每次5min后，直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。PBS洗滌4次，每次5min。在切片上直接滴加新鮮配置的0. 05%DAB溶液，室溫顯色3-6min ;蒸餾水洗滌4次，前3次每次lmin，最后I次5min ;于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染IOmin0蒸餾水洗滌3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后一次靜置30s。依同樣的方法用100%正丁醇洗三次。用 二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7、滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo凋亡檢測(cè)流式細(xì)胞技術(shù)0. 25%胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，梭形細(xì)胞大部分變圓后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞脫離，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞直接收集到IOmL的離心管中，500-1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷，4°C無(wú)菌的PBS充分洗滌細(xì)胞兩次，用250 ii L結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為lX106/mL。取IOOii L的細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5 ii L Annexin V-FITC和10 u L20 u g/mL的PI溶液，混勻后室溫下避光孵育10_15min。孵育后加入400uL結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析(實(shí)驗(yàn)必須在一小時(shí)內(nèi)完成)。流式細(xì)胞儀分析流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488nm,用一波長(zhǎng)為515nm的帶通濾器(band pass filter)檢測(cè)FITC突光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI。8、滋養(yǎng)層細(xì)胞株 HTR-8/SVneo 內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, R0S)產(chǎn)生的突光測(cè)定應(yīng)用突光染料分子探針H2DCFDA (2’ , 7’ -Dichlorofluorescein diacetate,2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽)。具體實(shí)驗(yàn)步驟為將滋養(yǎng)層細(xì)胞濃度調(diào)整至I X106/mL，接種至6孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)如上述分組，滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)至指定時(shí)間，加入10 μ M H2DCFDA孵育20min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，以相對(duì)對(duì)照組的熒光強(qiáng)度作為細(xì)胞內(nèi)ROS水平。激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為488nm和530nm，進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)10次。9、細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的測(cè)定應(yīng)用新型突光探針JC-1 (tetrechloro-tetraethylb-enzimidazo-1 carbocyanine iodide,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物)標(biāo)記線粒體，檢測(cè)線粒體膜電位變化；具體實(shí)驗(yàn)步驟為將滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo濃度調(diào)整至I X 106/mL,接種至6孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)如上述分組，滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)至指定時(shí)間，在培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ M的JC-1，37°C穩(wěn)定培養(yǎng)20min ;熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光變化，檢測(cè)JC-1單體時(shí)(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)，以相對(duì)對(duì)照組的熒光強(qiáng)度作為細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位。二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS16. O統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±^ )表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(AN0VA)，方差分析顯著時(shí)進(jìn)行多重比較，方差齊性采用LSD法，方差不齊者采用Games-Howell法。以P〈0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1、流產(chǎn)患者蛻膜組織中滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡檢測(cè)本研究在于確定流產(chǎn)患者蛻膜組織中滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡檢測(cè)，Tunel技術(shù)原位觀察顯示，自然流產(chǎn)蛻膜組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于正常妊娠人工流產(chǎn)蛻膜組織(圖1)。2、自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中滋養(yǎng)層細(xì)胞在電鏡下有凋亡小體形成，而細(xì)胞膜、細(xì)胞器卻相對(duì)完整，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征(圖2)。3、采用Western blot技術(shù)對(duì)自然流產(chǎn)者脫膜組織中g(shù)ClqR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其gClqR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖3)。

4、體外培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡檢測(cè)本研究在于確定體外培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞施加不同因素后凋亡檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，GFP-gClqR vector組，細(xì)胞凋亡明顯高于gClqRmAb組(圖4)5、GFP_gClqR vector干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞后，電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少，嵴斷裂、減少、消失，部分線粒體腫脹，甚至呈空泡狀(圖5A);熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中線粒體拷貝數(shù)顯著減少(圖5B);熒光探針DCFDA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS含量顯著升高(圖5C)，而gClqRmAb組，上述滋養(yǎng)層細(xì)胞線粒體基本特性無(wú)顯著改變。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究系列觀察了 gClqR mAb對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞線粒體功能的保護(hù)作用，闡明了gClqR基因致線粒體損傷的證據(jù)；評(píng)估線粒體功能變化在gClqR基因致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中的作用，論證gClqR基因致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡引發(fā)自然流產(chǎn)的線粒體機(jī)制。gClqR基因的研發(fā)將為自然流產(chǎn)的機(jī)制提供新理論，gClqR mAb為自然流產(chǎn)的早期防治提供新線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)，可用于制備防治自然流產(chǎn)的藥物或者制備抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的藥物。
_序歹丨j 表_
<110>南京市婦幼保健院<120〉一種防治自然流產(chǎn)的單克隆抗體及其應(yīng)用<160〉 2
<210〉 I<211〉 24<212〉 DNA〈213〉人工序列<220〉
<223〉上游引物<400〉 I
gccaagctta atggcagatg attt 24
<210〉 2<211〉 23<212〉 DNA
<213〉人工序列<220〉
〈223〉下游引物<400〉 2
gtgcgcgcca gtcttcgaag tag 2權(quán)利要求
1.一種抗自然流產(chǎn)的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體為gClqR單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于該gClqR單克隆抗體為美國(guó)Millipore公司貨號(hào)為AB2991的產(chǎn)品。
3.gClqR單克隆抗體在制備防治自然流產(chǎn)藥物中的應(yīng)用。
4.gClqR單克隆抗體在制備抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，公開(kāi)了一種防治自然流產(chǎn)的單克隆抗體及其應(yīng)用。該單克隆抗體為gC1qR單克隆抗體。該單克隆抗體具有抗自然流產(chǎn)功能，可用于制備防治自然流產(chǎn)藥物。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103044551SQ20121052110
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者高玲娟, 顧平清, 宮輝, 呂康泰, 李秀玲 申請(qǐng)人:南京市婦幼保健院