專利名稱：豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因及重組巨大芽孢桿菌菌株和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的表達載體，本發(fā)明進一步涉及含有該表達載體的重組巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)菌株以及它們在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途，屬于豬傳染性胃腸炎的防治領域。
背景技術：
豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirusof swine, TGEV)所引起的以嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。TGEV主要存在于空腸和十二指腸，各種日齡的豬均易感。由于仔豬自身抵抗力比較差，易受外界各種刺激因素的影響和病原微生物的侵襲，常會因嚴重脫水而發(fā)生死亡，并以2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率最高，可達100%。隨日齡的增大，雖然其死亡率逐漸下降，但感染該病的豬生產(chǎn)性能下降，飼料報酬率低，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)都帶來嚴重的經(jīng)濟損失。傳染性胃腸炎病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗TGEV感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。常規(guī)的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治該疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，譬如:滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機體排散病毒、病毒毒力可能返強等，另外還必須通過注射途徑免疫。TGEV有三種主要結構蛋白，分別為磷酸化的核衣殼蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纖突蛋白S，其中S糖蛋白攜帶主要的B 淋巴細胞抗原決定族，并且可以介導細胞的吸附、中和抗體的產(chǎn)生等過程，可以提供有效的免疫保護作用。S蛋白含有A、B、C、D四個主要抗原位點，其中A、D位點能產(chǎn)生中和性抗體。TGEV感染具有明顯的嗜腸性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結合是感染發(fā)生的首要條件，粘膜免疫是本病特異性免疫應答的主要特征，腸道粘膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發(fā)生和疾病嚴重程度。針對豬傳染性胃腸炎發(fā)病的幾個特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑?？诜庖咄怀龅膬?yōu)點是可有效地刺激腸道局部免疫細胞產(chǎn)生分泌型IgA，這尤其適應于腸道粘膜傳染病，但口服免疫需要克服免疫原在到達小腸粘膜之前被降解或滅活的可能。使用細菌病毒等活載體來傳遞完整無損的抗原成分解決了這個問題，目前有使用減毒細菌作為疫苗抗原的載體的報道，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙門氏菌作為載體傳遞DNA疫苗可能存在毒力返強的危險，質(zhì)粒DNA也可能會整合到宿主細胞基因組，引起調(diào)控細胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達失控、體細胞癌變、細胞轉(zhuǎn)型等一系列問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因及其編碼的蛋白；本發(fā)明的目的之二是提供含有上述豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因的重組表達載體；本發(fā)明的目的之三提供含有上述重組表達載體的重組宿主菌株。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)連接在一起后得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。本發(fā)明將TGEV S蛋白中A、D抗原位點(Sad)和化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)(以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個氨基酸為細胞壁錨定序列)連接起來，考慮到巨大芽孢桿菌使用密碼子的偏嗜情況，為了提高異源基因在宿主菌中的表達，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子蘇氨酸(ACC)和異亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等進行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對TGEV S蛋白A抗原位點上的3個甲基化位點(AAC-AAT, ATC-ATT, ACA-ACT)進行點突變。通過兩個柔性的 Linker ((GGGGS) 3)將 TGEV 的 A、D抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(順序為D-Linker-A-Linker-CWAM6)，本發(fā)明把該序列命名為MLS (SEQ ID N0.1)。其中，在MLS的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點和SphI酶切位點。本發(fā)明的另一 方面是提供由SEQ ID N0.1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的重組表達載體，譬如，將本發(fā)明的SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因與表達載體pHIS1525進行連接，得到可以在巨大芽孢桿菌細菌的外表面表達抗原融合基因的分泌表達載體。由此，本發(fā)明的再一方面是提供一株表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組巨大芽孢桿菌，能夠用其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明將SEQ ID N0.1所示融合基因與分泌表達載體pHIS1525進行雙酶切、連接并經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) WH320細胞，獲得含有重組質(zhì)粒的巨大芽孢桿菌命名為WH320-pHIS1525-MLS，其微生物保藏號是:CCTCCNo:M2011429 ;分類命名是:巨大芽孢桿菌 WH320-pHIS1525_MLS(Bacillus megateriumWH320-pHIS1525-MLS);保藏時間是:2011年11月27日；保藏單位是:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是:中國武漢武漢大學。進一步的，本發(fā)明將重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-MLS用木糖進行誘導，使重組蛋白在巨大芽孢桿菌細胞壁表面進行表達(表達約26KDa的重組蛋白)；免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明構建了 WH320-pHIS1525-MLS表達載體系統(tǒng)，表達了含有TGEV蛋白A/D位點和化膿鏈球菌細胞壁錨定序列CWAM6連接序列MLS，目的蛋白約26kDa;免疫印跡試驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性。間接免疫熒光檢測也證實表達蛋白存在于菌體上，誘導表達后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質(zhì)有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗體水平奠定了重要的物質(zhì)基礎。本發(fā)明針對TGEV發(fā)生和免疫的幾個特點，在實驗設計上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無毒的巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)細胞內(nèi)毒素，不產(chǎn)胞外堿性蛋白酶，有利于所表達蛋白的穩(wěn)定積累，質(zhì)粒穩(wěn)定，可以穩(wěn)定高效地表達蛋白，比較適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。同時芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環(huán)境，可減少需氧菌對腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內(nèi)的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。為了檢驗本發(fā)明重組巨大芽孢桿菌或該重組巨大芽孢桿菌所表達的融合蛋白MLS作為防治豬傳染性胃腸炎口服疫苗的可行性，本發(fā)明將構建的重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-MLS 口服免疫小鼠，不同時間測定腸道糞便中特異性抗體slgA的水平；試驗結果發(fā)現(xiàn)，重組巨大芽孢桿菌在連續(xù)3次免疫后誘導小鼠產(chǎn)生了明顯的抗TGEV-S蛋白的分泌性slgA抗體反應。重組菌組后期采樣抗體一直上升，各時間點采樣抗體水平均明顯高于免疫之初及對照菌(免疫空載體轉(zhuǎn)化菌WH320-pHIS1525)和PBS組(p〈0.05)，重組菌組38d時抗體水平達到頂峰(p〈0.05)之后下降，至60d時抗體水平仍明顯高于對照組(p〈0.05)。試驗結果表明，本發(fā)明所構建的重組巨大芽孢桿菌或所表達的融合蛋白MLS能有效的刺激小鼠腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應答，能將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的口服疫苗。本發(fā)明所涉及到的術語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術語“重組宿主菌株”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸 可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術語“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ;Rossolini 等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP，針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。


圖1PCR產(chǎn)物電泳結果。圖2表達質(zhì)粒pHIS1525的酶切鑒定結果。圖3重組質(zhì)粒pHIS1525-MLS的酶切和PCR鑒定結果。圖4表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；M:蛋白質(zhì)分子量標準；1_3、重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-MLS誘導后的蛋白質(zhì)；4、重組巨大芽孢桿菌WH320_pHIS1525誘導后的蛋白質(zhì)。圖5表達產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(X40) ;A:WH320-pHIS1525_MLS重組菌的IFA試驗結果，菌體細胞散發(fā)了強烈的黃綠色熒光；B:WH320-pHIS1525重組菌的IFA試驗結果，沒有熒光，菌體呈紅色。圖6重組巨大芽孢桿菌免疫小鼠后不同時間點測定小鼠腸道糞便中抗體slgA的結果。圖7重組巨大芽孢桿菌免疫小鼠后不同時間點測定小鼠腸道糞便中抗體slgA的結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1MLS基因巨大芽孢桿菌分泌表達載體的構建及鑒定1.序列的設計與合成豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白含有A、B、C、D共4個抗原位點，其中A (536— 593殘基區(qū))和D (376— 392殘基區(qū))抗原位點在誘導產(chǎn)生中和抗體中起重要作用，并且A抗原位點是一個主要的B細胞抗原表位，并且以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個氨基酸為細胞壁錨定序列(CWAM6)，將Sad和CWAm6連接，使Sad能在巨大芽孢桿菌WH320細胞壁表達。通過兩個柔性的Linker ((GGGGS) 3)將TGEV的A、D抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(順序為D-Linker-A-Linker-CWAM6)，并把該序列命名為MLS。對稀有密碼子蘇氨酸(ACC)和異亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等進行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對A抗原位點上的3個甲基化位點(AAC — AAT，ATC — ATT，ACA — ACT)進行點突變，但不改變其所編碼的氨基酸，具體序列見SEQ ID N0.2。在MLS的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點和SphI酶切位點。將設計好的MLS序列(SEQ IDN0.1)進行人工合成，構建了重組質(zhì)粒 PMD18-MLS ;pMD18-T Simple Vector 購自 TaKaRa (大連)公司，pMD18_MLS 的具體構建過程如下:PCR擴增目的基因在PCR反應管中加入下列試劑和溶液:表IMLS的PCR反應體系
權利要求
1.豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因，其特征在于:其多核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。
2.由權利要求1所述融合基因編碼的蛋白，其特征在于:其氨基酸序列為SEQID N0.2所示。
3.含有權利要求1所述融合基因的重組表達載體。
4.含有權利要求3所述重組表達載體的重組宿主株。
5.按照權利要求4所述的重組宿主株，其特征在于:所述的重組宿主株是重組巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)菌株，其微生物保藏號是:CCTCC No:M2011429。
6.權利要求1所述的融合基因在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
7.權利要求2所述的蛋白在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
8.權利要求3所述的重組表達載體在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
9.權利要求4或5所述的重組宿主株在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途。
10.按照權利要求6 -9所述的用途，其特征在于:所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因及重組巨大芽孢桿菌菌株和應用。本發(fā)明提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列連接在一起后得到的抗原融合基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明進一步提供了含有該抗原融合基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組巨大芽孢桿菌菌株。將本發(fā)明的重組巨大芽孢桿菌菌株用木糖進行誘導，抗原融合基因可以在該細菌細胞壁的表面進行表達。免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應，表明本發(fā)明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，可將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文檔編號C07K19/00GK103194470SQ201210521320
公開日2013年7月10日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月16日
發(fā)明者張金林, 胡曉芬 申請人:武漢華揚動物藥業(yè)有限責任公司