專利名稱：牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛干擾素-τ技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法。
背景技術(shù)：
牛干擾素τ (bIFN- τ )是由早期胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠阻止子宮內(nèi)膜上溶黃體分子機制的發(fā)生，促進(jìn)黃體的發(fā)育，從而啟動妊娠過程。大量的研究表明，bIFN-τ除了對妊娠識別過程起決定性的作用外，還在調(diào)節(jié)妊娠識別向胚胎植入轉(zhuǎn)變過程中，發(fā)揮重要作用。
現(xiàn)有技術(shù)中一、原核表達(dá)體系1990年Klemann在大腸桿菌中表達(dá)的bIFN-τ的(Spencer TE，2004)，Li (Spencer TE, 2004)和 Ealy(Bazer FW，1996)在大腸桿菌中表達(dá)的bIFN-τ ;國內(nèi)呂麗艷(2006)在大腸桿菌中表達(dá)的人干擾素τ。二、真核表達(dá)體系Roberts和Ott (1991)用酵母表達(dá)的oIFN τ , 1993年Johnson在畢赤酵母中表達(dá)的 bIFN- τ (Ryan AM, et al, 1993) ；Nagaya(2004)在家蠶體內(nèi)表達(dá)的 bIFN- τ ；Takahashi (2003)在ΤΝ-5昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)的bIFN- τ。三、純化方法主要用葡聚糖分子篩層析結(jié)合離子交換層析，純度在91%左右，獲得的bIFN-τ抗病毒活性達(dá)到108IU/mg。其上所述的方法存在以下缺點一、純化過程復(fù)雜分子篩層析結(jié)合離子交換層析純化條件探索復(fù)雜，而且純化后純度不高；二、難以實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)早期的大腸桿菌員和表達(dá)體系采用的大腸桿菌不屬于工程菌；酵母真核表達(dá)和昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系復(fù)雜，難以實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)和表達(dá)；三、抗病毒生物活性鑒定方法復(fù)雜牛干擾素-τ的抗病毒活性本身較低，采用病毒活性檢測方法復(fù)雜，檢測的可靠性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，它采用大腸桿菌工程菌株作為表達(dá)體系，可實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；但對bIFN-τ基因進(jìn)行改造，在表達(dá)產(chǎn)物中加入His6-Tag,實現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物的快速高純度純化；在活性鑒定上，模擬bIFN- τ在體作用的靶細(xì)胞-子宮內(nèi)膜細(xì)胞，對其進(jìn)行活性分析，避免了復(fù)雜的抗病毒活性分析方法。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案它的克隆和重組載體構(gòu)建為通過生物信息學(xué)分析，獲取牛IFN- τ成熟蛋白的CDS序列，以pMD18_T為載體，在E. coli JM109菌株中進(jìn)行IFN-τ成熟蛋白⑶S區(qū)的分子克隆，并測其序列；以pET28a+作為表達(dá)載體，在E. coli BL21工程菌株中進(jìn)行bIFN- τ組氨酸標(biāo)簽蛋白的融合表達(dá)；運用蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具，對表達(dá)產(chǎn)物的基本性質(zhì)、糖基化位點、磷酸化位點、激酶作用位點、疏水性、二硫鍵位置、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，初步分析了bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白的差異；采用蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)，對bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用等電聚焦和肽指紋技術(shù)對純度進(jìn)行鑒定，建立了一套完整的bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物純化方法；最后以牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為研究模型，模擬在體水平的激素濃度，研究了 bIFN- τ對牛子宮內(nèi)膜上妊娠識別相關(guān)基因表達(dá)的影響來進(jìn)行生物活性鑒定。所述的采用特異引物進(jìn)行PCR擴增獲得了 bIFN-τ成熟蛋白的CDS，并構(gòu)建了bIFN- τ成熟蛋白的⑶S的克隆載體，其步驟為(I)、采用通用的酚-氯仿法從牛全血中提取基因組DNA ；(2)、采用特異的引物對牛bIFN-τ成熟蛋白CDS進(jìn)行擴增，并在擴增同時在引物上設(shè)計Nde I和BamH I酶切位點。引物為Forward :5’ -CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC-3’ Reverse :5’ -GGA TCC TTA TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC-3’PCR 擴增體系為2XTaq PCR MasterMi s 25. O μ L，上下游引物各 2 μ L，DNA 模版2 μ L，加水至50 μ Lo擴增條件為95°C預(yù)變性2min, 94°C變性Imin，58°C退火Imin，72。。延伸Imin, 35個循環(huán),最后延伸lOmin。(3)克隆載體構(gòu)建和測序PCR產(chǎn)物為534bp，通過離心柱型DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，將PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T載體鏈接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG瓊脂糖平板篩選陽性克隆。白色的陽性菌落再次在LB中培養(yǎng)后，通過酶切、PCR擴增和測序方法對陽性克隆載體進(jìn)行鑒定，獲得pMD18-bIFN_ τ克隆質(zhì)粒。所述的bIFN- τ表達(dá)載體構(gòu)建和誘導(dǎo)條件為(I)用質(zhì)粒提取試劑從陽性Ε. coli JM109菌中提取克隆質(zhì)粒pMD18_bIFN_ τ，然后分別用Nde I和BamH I對pMD18_bIFN_ τ、PET_28a(+)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳后回收目的產(chǎn)物。然后利用T4DNA連接酶在16°C下20h，進(jìn)行目的基因與表達(dá)載體間的連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21 (DE3)，用Kan/LB瓊脂糖平板篩選白色重組體菌落，將白色菌斑采用PCR擴增、酶切和測序進(jìn)行陽性鑒定。(2)、將鑒定的陽性重組菌接種于3ml Kan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)過夜；吸取菌液按1: 100的比例接種于50mlKan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)至OD600 = O. 6 1. O ;加入IPTG，使終濃度為1. OmmoI/L,于37°C，250r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，可獲得最大表達(dá)量的重組蛋白。所述的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的純化和生物活性鑒定為(l)blFN- τ的純化誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體；包涵體用8Μ脲變性緩沖液溶解后，用HisTrap HP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。用400mM的咪唑洗，在該條件下bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26.36%。柱上復(fù)性用1.5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrapDesalting脫鹽后，bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm降低到4mS/cm。(2)生物活性鑒定將純化的bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物，以中濃度100ng/mL的濃度添加到無血清培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，與未添加bIFN- τ的對照組相比，如果添WbIFN-T的子宮內(nèi)膜細(xì)胞上0XTR、ER-a和ER-β的表達(dá)水平顯著降低，表明bIFN-τ抑制了 0XTR、ER-a和ER-β的表達(dá)，這與bIFN-τ在體的生物學(xué)功能一致，反映重組表達(dá)獲得的bIFN-τ具有生物活性。本發(fā)明采用大腸桿菌工程菌株作為表達(dá)體系，可實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；但對bIFN- τ基因進(jìn)行改造，在表達(dá)產(chǎn)物中加入His6_Tag，實現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物的快速高純度純化。

圖1為本發(fā)明中克隆載體與重組載體構(gòu)建示意圖，圖2為本發(fā)明中基因和內(nèi)參基因引物序列表。
具體實施例方式參看圖1-圖2，本具體實施方式
采用如下技術(shù)方案它的克隆和重組載體構(gòu)建為通過生物信息學(xué)分析，獲取牛IFN- τ成熟蛋白的⑶S序列，以pMD18-T為載體，在E. coliJM109菌株中進(jìn)行IFN- τ成熟蛋白⑶S區(qū)的分子克隆，并測其序列；以pET28a+作為表達(dá)載體，在E. coli BL21工程菌株中進(jìn)行b IFN-τ組氨酸標(biāo)簽蛋白的融合表達(dá)。通過分子遺傳進(jìn)化分析方法，分析了不同亞型bIFN-τ、不同物種IFN-τ和牛IFN家族的同源性、遺傳距離和分子進(jìn)化關(guān)系；運用蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具，對表達(dá)產(chǎn)物的基本性質(zhì)、糖基化位點、磷酸化位點、激酶作用位點、疏水性、二硫鍵位置、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，初步分析了 bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白的差異；采用蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)，對bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化；建立了一套完整的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物純化方法，最后以牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為研究模型，模擬在體水平的激素濃度，研究了 bIFN-τ、孕酮、孕酮結(jié)合bIFN- τ作用下，對牛子宮內(nèi)膜上妊娠識別和胚胎植入相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下從來自不同個體的4個克隆中鑒別出2條不同的DNA序列。測序結(jié)果表明，中國荷斯坦奶牛bIFN- τ成熟蛋白的完整⑶S序列為519bp，為含單一外顯子的完整ORF區(qū)，此ORF編碼含有172個氨基酸的bIFN- τ成熟蛋白。將這2條DNA序列提交到GenBank，獲得登錄號為 DQ680846 和 DQ680847。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a_bIFN-τ經(jīng)測序證實，目的基因插入方向和讀碼框正確。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具表明，bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白相比，糖基化位點、二硫鍵位置、三級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域均無差異；表達(dá)產(chǎn)物的親水能力增強、等電點升高、半衰期延長、穩(wěn)定性增加；激酶潛在作用位點之間的差異很??；表達(dá)產(chǎn)物在Ν-19位增加了一個Ser磷酸化位點，N-端增加了組氨酸標(biāo)簽的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。用1. 0mmoI/L IPTG誘導(dǎo)，以37°C，誘導(dǎo)4h的優(yōu)化條件培養(yǎng)大腸桿菌后，融合蛋白的表達(dá)量提高到占菌體總蛋白的28. 84%。誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體。純化后菌液中包涵體的產(chǎn)量達(dá)到2.6983±0. 1967g/L。包涵體用8M脲變性緩沖液溶解后，用HisTrap HP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。用400mM的咪唑洗，在該條件下bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26. 36%。柱上復(fù)性研究表明1. 5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrap Desalting脫鹽后，bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm降低到4mS/cm。將純化后的bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行等電聚焦測定等電點和用IBA裂解獲得肽指紋圖譜進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明親和層析獲得了高純度的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。
子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)表明原代的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞能在O. 2nME2+100IU/mLPen. +100 μ g/mL Str+2 μ mol/mL Glu+DMEM-Ham’ sF12的帶血清中良好生長，然后將傳代的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系中，其細(xì)胞類型主要為來自子宮內(nèi)膜上皮的上皮細(xì)胞和來自子宮內(nèi)膜基質(zhì)的成纖維細(xì)胞。在傳代的無血清培養(yǎng)體系中添加終濃度lOOng/mL的重組表達(dá)bIFN-τ純化產(chǎn)物繼續(xù)培養(yǎng)24h，同時設(shè)置不添加bIFN-τ的空白對照。通過熒光定量PCR分析bIFN- τ對牛子宮內(nèi)膜上妊娠識別基因表達(dá)的研究結(jié)果表明bIFN_ τ能夠顯著地抑制牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞上ER-α , ER- β , OXTR的表達(dá)水平。證實重組表達(dá)的bIFN- τ蛋白具有生物活性。所述的從基因組中擴增bIFN- τ及其克隆載體和表達(dá)載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)、純化和生物活性鑒定方法的具體步驟如下1、牛基因組DNA抽提取牛150 μ I全血加入450 μ I STE緩沖液、70 μ I SDS和20 μ I規(guī)格為10mg/ml蛋白酶K ;充分混勻后置56°C水浴鍋中消化過夜，每隔30min輕輕搖勻一次，至澄清；加入等 體積的Tris飽和酹,緩慢混勻30min, 12000r/min離心IOmin,上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的1. 5mlEP管中；加入等體積的Tris飽和酚氯仿異戊醇=25 24 I的混合液緩慢混勻抽提30min, 12000r/min離心IOmin,上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的EP管中；再加入等體積的氯仿異戊醇為24 1，緩慢混勻抽提20min，12000r/min離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的EP管中；加入等體積的異丙醇，_20°C沉淀2小時以上，12000r/min離心IOmin后，棄上清；用預(yù)先冷卻的70%乙醇溶液洗滌沉淀1-2次，棄上清；DNA樣品自然干燥10-20min左右；根據(jù)沉淀的量加入50-200 μ1、ρΗ8. O為TE緩沖液溶解，置4°C冰箱溶解過夜；將DNA樣品放入68°C水浴20min，滅活DNA酶，防止DNA降解；用1. O %的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA ;將模板DNA放置于4°C冰箱待用或_20°C保存。2、bIFN_ τ 特異擴增采用特異的引物對牛bIFN-τ成熟蛋白CDS進(jìn)行擴增，并在擴增同時在引物上設(shè)計Nde I和BamH I酶切位點。引物為Forward :5，-CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC-3，Reverse :5’ -GGA TCC TTA TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC-3’PCR 擴增體系為2XTaq PCR MasterMi s 25. O μ L，上下游引物各 2 μ L，DNA 模版2 μ L，加水至50 μ Lo擴增條件為95°C預(yù)變性2min, 94°C變性Imin，58°C退火Imin，72。。延伸lmin，35個循環(huán)，最后延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物為534bp。3、克隆載體構(gòu)建和表達(dá)載體構(gòu)建克隆載體構(gòu)建PCR產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳后用離心柱型DNA回收試劑盒對其進(jìn)行回收和純化，將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T載體鏈接后轉(zhuǎn)化到E. coli感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG瓊脂糖平板篩選陽性克隆。白色的陽性菌落再次在LB中培養(yǎng)后，通過酶切、PCR擴增和測序方法對陽性克隆載體進(jìn)行鑒定，獲得pMD18-bIFN_ τ克隆質(zhì)粒。表達(dá)載體構(gòu)建用質(zhì)粒提取試劑從陽性Ε. coli JM109菌中提取克隆質(zhì)粒pMD18-bIFN- τ，然后分別用 Nde I 和 BamH I 對 pMD18_bIFN_ τ、pET_28a(+)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳后回收目的產(chǎn)物。然后利用T4DNA連接酶在16°C下20h，進(jìn)行目的基因與表達(dá)載體間的連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的BL21(DE3)大腸桿菌，用Kan/LB瓊脂糖平板篩選白色重組體菌落，將白色菌斑采用PCR擴增、酶切和測序進(jìn)行陽性鑒定。4、bIFN_ τ的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定的陽性重組菌接種于3ml Kan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)過夜；吸取菌液按1: 100的比例接種于50mlKan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)至 OD600 = O. 6 1. 0(約 3 4h);加入 IPTG，使終濃度為1. Ommol/L，于 37°C，250r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)4h ;吸取Iml誘導(dǎo)菌液，4°C 8000r/min離心5min,收集菌體,進(jìn)行15%SDS-PAGE 分析。5、bIFN_T 純化方法
純化與復(fù)性誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體。純化后包涵體的產(chǎn)量達(dá)到2. 6983±0. 1967g/L ;包涵體用8M脲變性緩沖液溶解后，用HisTrap HP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。用400mM的咪唑洗脫，在該條件下bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26. 36%。柱上復(fù)性研究表明1. 5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrap Desalting脫鹽后，bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm 降低到 4mS/cm。純度鑒定將純化后的bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行等電聚焦測定等電點和用IBA裂解獲得肽指紋圖譜進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明親和層析獲得了高純度的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物。6、bIFN_T表達(dá)產(chǎn)物生物活性鑒定子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)原代的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞在O. 2nM E2+100IU/mL Pen. +100 μ g/mL Str+2 μ mol/mL Glu+DMEM-Ham’ s F12的帶血清中培養(yǎng)，然后將傳代的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，其細(xì)胞類型主要為來自子宮內(nèi)膜上皮的上皮細(xì)胞和來自子宮內(nèi)膜基質(zhì)的成纖維細(xì)胞。在傳代的無血清培養(yǎng)體系中添加終濃度100ng/mL的重組表達(dá)bIFN-τ純化產(chǎn)物繼續(xù)培養(yǎng)24h，同時設(shè)置不添加bIFN-τ的空白對照?；虮磉_(dá)水平分析通過熒光定量PCR分析bIFN-τ對牛子宮內(nèi)膜上ER-a、ER-β、OXTR的表達(dá)水平進(jìn)行分析，其具體過程為①子宮內(nèi)膜細(xì)胞收集培養(yǎng)24h后吸盡培養(yǎng)液，立即用用預(yù)冷到4°C的PBS 0. 1%DEPC水配制清洗一次。在培養(yǎng)皿中加入Iml TRIzol，混勻靜置2-3min后，使用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，使其脫落；②總RNA提取收集細(xì)胞混合液于EP管中；往收集了細(xì)胞混合液的EP管中加入0. 2ml氯仿，劇烈震蕩15S，靜置5min ;2_8°C，12000rmp離心15min ;將上層水相轉(zhuǎn)移至經(jīng)DEPC處理過的聚丙烯管中，加入0. 5ml異丙醇，混勻后靜置IOmin ;在2_8°C，12000rmp離心lOmin，棄上清，加75%乙醇1ml，充分震蕩混勻；在2_8°C，7500rmp離心5min ;將RNA沉淀物涼至微干(約5-10min)，溶解于20 μ I DEPC水；用DNase I去除總RNA中可能含有的基因組DNA。③cDNA第一條鏈合成(RT):按照下列組分配制RT反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于它的克隆和重組載體構(gòu)建為通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計的引物，通過PCR擴增獲得牛IFN-τ成熟蛋白的⑶S，以pMD18-T為克隆載體，在Ε. coli JM109菌株中進(jìn)行其⑶S的分子克隆，并測序；以pET28a+作為表達(dá)載體，在Ε. coli BL21(DE3)工程菌株中進(jìn)行帶組氨酸標(biāo)簽的bIFN-τ蛋白的融合表達(dá)；運用蛋白質(zhì)組學(xué)分析工具，對表達(dá)產(chǎn)物的基本性質(zhì)、糖基化位點、磷酸化位點、激酶作用位點、疏水性、二硫鍵位置、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，初步分析了 bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物與bIFN-τ成熟蛋白的差異；采用固相金屬離子親和層析技術(shù)，對bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，建立了一套完整的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物純化方法；最后以牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為研究模型，模擬在體水平的激素濃度，研究了 bIFN-τ作用下，對牛子宮內(nèi)膜上妊娠識別相關(guān)基因表達(dá)的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的采用特異引物進(jìn)行PCR擴增獲得了 bIFN-τ成熟蛋白的CDS，并構(gòu)建了bIFN- τ成熟蛋白的⑶S的克隆載體，其步驟為 (1)、采用通用的酚-氯仿法從牛全血中提取基因組DNA； (2)、采用特異的引物對牛bIFN-τ成熟蛋白CDS進(jìn)行擴增，并在擴增同時在引物上設(shè)計Nde I和BamH I酶切位點，引物為Forward :5’ -CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC-3’Reverse :5’ -GGA TCC TTA TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC-3’ PCR擴增體系為2XTaq PCR MasterMis 25. O μ L，上下游引物各2 μ L，DNA模版2 μ L，加水至50yL ;擴增條件為:95°C預(yù)變性2min，94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸Imin, 35個循環(huán),最后延伸IOmin ； (3)、克隆載體構(gòu)建和測序PCR產(chǎn)物為534bp，通過離心柱型DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，將PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T載體鏈接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG瓊脂糖平板篩選陽性克隆。白色的陽性菌落再次在LB中培養(yǎng)后，通過酶切、PCR擴增和測序方法對陽性克隆載體進(jìn)行鑒定，獲得pMD18-bIFN_ τ克隆質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的bIFN- τ表達(dá)載體構(gòu)建和誘導(dǎo)條件為 (1)用質(zhì)粒提取試劑從陽性Ε.coli JM109菌中提取克隆質(zhì)粒pMD18-bIFN_ τ，然后分別用Nde I和BamH I對pMD18_bIFN_ τ、PET_28a(+)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳后回收目的產(chǎn)物；然后利用T4DNA連接酶在16°C下20h，進(jìn)行目的基因與表達(dá)載體間的連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E. coli BL21 (DE3)，用Kan/LB瓊脂糖平板篩選白色重組體菌落，將白色菌斑采用PCR擴增、酶切和測序進(jìn)行陽性鑒定。
(2)、將鑒定的陽性重組菌接種于3mlKan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)過夜；吸取菌液按1: 100的比例接種于50mlKan/LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖菌培養(yǎng)至OD600 = O. 6 1. O ;加入IPTG，使終濃度為1. OmmoI/L,于37°C，250r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，可獲得最大表達(dá)量的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，其特征在于所述的bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的純化和生物活性鑒定為(DbIFN- τ的純化誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌經(jīng)洗滌、超聲波破碎、離心獲得包涵體；包涵體用8Μ脲變性緩沖液溶解后，用HisTrap HP親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物。用400mM的咪唑洗，在該條件下bIFN-τ表達(dá)產(chǎn)物的得率最高，占上柱總蛋白的26. 36%。柱上復(fù)性用1.5M脲的洗脫緩沖液能夠獲得bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物用HisTrapDesalting脫鹽后，bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物溶液的電導(dǎo)性從50mS/cm降低到4mS/cm。 (2)生物活性鑒定將純化的bIFN- τ表達(dá)產(chǎn)物，以中濃度lOOng/mL的濃度添加到無血清培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，與未添加bIFN- τ的對照組相比，如果添加bIFN-τ的子宮內(nèi)膜細(xì)胞上0XTR、ER_a和ER-β的表達(dá)水平顯著降低，表明bIFN-τ抑制了 0XTR、ER_a和ER-β的表達(dá)，這與bIFN-τ在體的生物學(xué)功能一致，反映重組表達(dá)獲得的bIFN-τ具有生物活性。
全文摘要
牛干擾素-τ原核表達(dá)及產(chǎn)物的純化與生物活性鑒定方法，它涉及牛干擾素-τ技術(shù)領(lǐng)域。它的克隆和重組載體構(gòu)建為通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計的引物，通過PCR擴增獲得牛IFN-τ成熟蛋白的CDS，以pMD18-T為克隆載體，在E.coli JM109菌株中進(jìn)行其CDS的分子克隆，并測序；以pET28a+作為表達(dá)載體，在E.coli BL21(DE3)工程菌株中進(jìn)行帶組氨酸標(biāo)簽的bIFN-τ蛋白的融合表達(dá)。它采用大腸桿菌工程菌株作為表達(dá)體系，可實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；但對bIFN-τ基因進(jìn)行改造，在表達(dá)產(chǎn)物中加入His6-Tag，實現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物的快速高純度純化。
文檔編號C07K1/22GK103014049SQ201210554970
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者張明, 賴松家 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)