專利名稱：一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以牡蠣殼為原料制備抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
牡販殼為牡販科動物長牡販(Ostrea gigas Thunberg)、大連灣牡販 (Ostreatalienwhanensis Crosse)或近江牡販(Ostrea rivularis Gould)的貝殼，是歷版 《中國藥典》收載的中醫(yī)臨床常用藥。味咸，微寒，歸肝、膽、腎經(jīng)。生牡蠣重鎮(zhèn)安神，潛陽補(bǔ)陰，軟堅(jiān)散結(jié)?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用集中于治療癲癇，治療失眠，治療更年期綜合癥，治療消化性潰瘍，治療多汗癥等。
近年來，隨著牡蠣養(yǎng)殖技術(shù)的推廣和市場需求的擴(kuò)大，牡蠣的養(yǎng)殖規(guī)模和生產(chǎn)加工能力得到大幅提高。但是，牡蠣生產(chǎn)加工過程中殘留的大量牡蠣殼，若不能得到有效利用和妥善處理，將會嚴(yán)重污染鄉(xiāng)村環(huán)境。牡蠣殼的主要成分是碳酸鈣，并含有少量的磷酸鈣、 硫酸鈣、氧化鐵、鋁、鎂和硅等微量元素，是一種寶貴的無機(jī)鹽資源。其資源化利用，古來有之，從先秦的煅制工藝，到后來道家的“煉丹術(shù)”和洛陽橋的“種蠣固基”，無不與之相關(guān)。目前，國內(nèi)外已成功開發(fā)出一系列以牡蠣殼為原料的產(chǎn)品，包括作為藥品原料的活性鈣粉、作為化工產(chǎn)品的填充料碳酸鈣粉或作為養(yǎng)殖業(yè)飼料添加劑鈣粉等。但是對牡蠣殼有機(jī)質(zhì)的研究鮮見報道，這無疑阻礙了牡蠣殼資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用。因此，為了能夠更好的應(yīng)用牡蠣動物藥資源，闡明其藥效的化學(xué)依據(jù)，有必要對其肽類化學(xué)成分和活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
生物體內(nèi)正常有氧代謝過程中會形成許多活性氧物質(zhì)，包括超氧陰離子自由基、 羥基自由基等；另外，生物體也可經(jīng)過傳染、離子輻射、空氣污染等外源性侵入而產(chǎn)生活性氧。體內(nèi)活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信號傳導(dǎo)過程。但過多的活性氧自由基就會有破壞行為。大量研究已經(jīng)證明，老化以及老化相關(guān)的疾病如癌癥、心血管、自身免疫性疾病以及關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系。因此充分利用牡蠣殼資源，制成具有抗氧化活性且易于人體吸收的肽及附加產(chǎn)品具有重要意義。
目前已有從牡蠣肉中分離提取肽類物質(zhì)的相關(guān)報道，由于牡蠣殼中含有較多碳酸鈣成分，從牡蠣殼中提取純度較高的抗氧化肽未見報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種以牡蠣殼為原料的抗氧化肽的制備方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，它包括如下步驟
(I)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過6(Γ100目篩，加入8 10倍重量的水 9(T10(TC回流加熱提取I小時，過濾，濾液濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，再經(jīng)凍干，得牡蠣殼肽凍干粉；
(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進(jìn)行離子交換層析，進(jìn)樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，S0URCE15Q強(qiáng)陰離子交換柱，檢測波長為 214nm,上樣完畢后繼續(xù)進(jìn)100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/ V) %緩沖液A與50 (v/v) %緩沖液B洗脫30min，流速為lmL/min，收集主要峰，然后濃縮，凍干，得到初步純化產(chǎn)物；
其中，
緩沖液A為pH8. O的50mM Tris-HCl ;配制方法將500mL的O. lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液A ；
緩沖液B 為 ρΗ8· O 的 50mM Tris-HCl+lmol/LNaCl ;配制方法將 500mL 的 O.1mol/ L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加NaC158. 44g，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液B ；
(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產(chǎn)物加入8 10倍重量的水溶解，利用反向C8柱進(jìn)行柱層析,檢測波長為214nm,設(shè)置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B走基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調(diào)節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在 8mL/min,收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產(chǎn)物；
其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
步驟(I)、( 2 )和(3 )中的濃縮條件為60 V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。
按照上述制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
按照上述制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽在抗氧化產(chǎn)品中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
其中，所述的抗氧化產(chǎn)品為抗氧化藥品、抗氧化保健品、抗氧化食品或抗氧化化妝品O
其中，本發(fā)明的牡蠣殼抗氧化肽，可以和藥學(xué)上可接受的載體混合制備成各種劑型。
有益效果本發(fā)明方法制備得到的牡蠣殼肽，具有很好的抗氧化活性；本發(fā)明提供的牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，所得工藝各參數(shù)設(shè)計(jì)合理，能夠充分利用牡蠣殼豐富資源；本發(fā)明提供的牡蠣殼抗氧化肽可以用于制備成抗氧化抗衰老藥品、 保健品或食品，應(yīng)用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。


圖1為離子交換層析分離譜圖。
圖2為反向C8柱層析分離譜圖。
具體實(shí)施方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1:牡蠣殼抗氧化肽的制備。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
AKTA 蛋白純化系統(tǒng)，Amersham Biosciences,瑞典；反向 C8 柱，Hamilton HxSil, 瑞士 ；Sourcel5Q強(qiáng)陰離子交換柱，Amersham Biosciences,瑞典；RE_52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FD-1000凍干機(jī)，東京理化株式會社；SHZ-1II型循環(huán)水真空泵；上海亞榮生化儀器廠。
實(shí)驗(yàn)過程
(I)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過80目篩，加入9倍重量的水100°C回流加熱提取I小時，過濾，濾液60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，得牡蠣殼肽提取物凍干粉；
(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進(jìn)行離子交換層析，進(jìn)樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，S0URCE15Q強(qiáng)陰離子交換柱，檢測波長為 214nm,上樣完畢后繼續(xù)進(jìn)100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/ v)%緩沖液A與50 (v/v)%緩沖液B洗脫30min,流速為lmL/min,層析譜圖見圖1,收集主要峰，然后60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，得到初步純化產(chǎn)物；
其中，
緩沖液A為pH8. O的50mM Tris-HCl ;配制方法將500mL的O. lmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液A ；
緩沖液B 為 ρΗ8· O 的 50mM Tris-HCl+lmol/LNaCl ;配制方法將 500mL 的 O.1mol/ L的三羥 甲基氨基甲烷(Tris)溶液與292mL的O. lmol/L的鹽酸混勻后，加NaC158. 44g，加水稀釋至1L，過濾，即為緩沖液B ；
(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產(chǎn)物加入8 10倍重量的水溶解，利用反向C8柱進(jìn)行柱層析，檢測波長為214nm，設(shè)置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B走基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調(diào)節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在8mL/ min，收集主要峰，層析譜圖見圖2，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產(chǎn)物；
其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
實(shí)施例2 :抗氧化實(shí)驗(yàn)。
1.材料及設(shè)備
實(shí)施例1制備得到的牡販殼肽；Pierce BCA蛋白定量試劑盒美國Thermo公司；二苯代苦味酰肼(DPPH) Alfa公司。BP211D電子天平德國Sartorious公司； SpectraMaxl90酶標(biāo)儀美國AD公司；恒溫透視水槽，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；UV_1700分光光度儀，日本Shimadzu公司。
2.方法
2.1供試溶液制備
取上述實(shí)施例1制備的牡蠣殼肽，精密稱量，加蒸餾水配制成100 μ g/mL的供試溶液。
2. 2DPPH自由基清除能力測定
取供試品溶液ImL分別加入到干凈的IOmL具塞試管中，每管中再加入0. 6mmol/LDPPH甲醇溶液O. 5mL,然后以甲醇補(bǔ)充體積至5mL，30分鐘室溫避光反應(yīng)后于517nm處測定吸光值A(chǔ)，空白組以等體積甲醇溶液代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和甲醇混合液空白調(diào)零。按下式計(jì)算
清除率SA(% ) = [1-(A1-Aj)/A0] X 100%
式中Aq為對照組吸光度，Ai為樣品組吸光度，Aj為空白組吸光度。
2. 3超氧陰離子自由基清除能力測定
采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測定。量取50mmol/L、pH=8. 20的Tris-HCl緩沖液 4. 7mL,加入O.1mL的供試品溶液，置于25°C水浴保溫20分鐘，然后加入25°C預(yù)溫的3mmol/ L的鄰苯三酹溶液(用10mmol/LHCl配制)0. 2mL,迅速搖勻后倒入比色皿中，在319nm下每隔I分鐘測定吸光值一次，共反應(yīng)9分鐘，用lOmmol/L HCl溶液為空白調(diào)零，對照組以等體積去離子水代替供試樣品。作吸光度隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計(jì)算樣品對超氧陰離子的清除率。
清除率SA(% ) = [1-V1/V0] X 100%
式中V1為樣品組的吸光度隨時間的變化率，VO為空白對照組組吸光度隨時間的變化率。
2. 4羥自由基清除能力測定·
采用不同酶解液對Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基清除率的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定。 取O. 2mL的FeS04-EDTA混合液(10. OmmoI/L)于試管中，加人O. 5mL的2-脫氧核糖溶液 (10. OmmoI/L)和O. 6mL供試品溶液，用磷酸緩沖液(pH=7. 4,0. lmol/L)定容至1. 8mL，再加人0. 2mLH202 (10. OmoI/L)，混勻后置于37°C恒溫水浴中反應(yīng)lh。然后加入2. 8%(w/w)三氯乙酸(TCA)溶液1. OmL，在4000rpm下離心20分鐘，取上清液2. OmL于另一支試管中，加入1.0% (w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1. OmL,混勻后置沸水浴反應(yīng)15分鐘,冷卻后稀釋5倍， 在532nm波長處測吸光度值。酶解液對羥自由基的清除效果用清除率(SA/% )表示，按下式計(jì)算
清除率SA(%) = [(Ac-As)/(Ac-A0)] X 100%
式中Ac為不加清除劑的吸光度，As為加入供試品后的吸光度，A0為空白的吸光度。
3、結(jié)果與討論
3.1具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示
表I牡販殼肽的抗氧化能力(濃度100 μ g/mL, χ土SD，n=3)
權(quán)利要求
1.一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟(1)牡蠣殼肽的提取牡蠣殼粉碎，過6(Γ100目篩，加入8^10倍重量的水9(Γ100 回流加熱提取I小時，過濾，濾液濃縮，O. 45 μ m水膜濾過，再經(jīng)凍干，得牡蠣殼肽凍干粉；(2)離子交換層析分離將步驟(I)得到的牡蠣殼肽凍干粉溶于緩沖液A中進(jìn)行離子交換層析，進(jìn)樣量為O. 5mL，流速為lmL/min，SOURCE 15Q強(qiáng)陰離子交換柱，檢測波長為214nm， 上樣完畢后繼續(xù)進(jìn)100 (v/v) %緩沖液A2到3個柱床體積，洗至基線平穩(wěn)，再用50 (v/v) %緩沖液A與50 (v/v) %緩沖液B洗脫30min,流速為lmL/min,收集主要峰,然后濃縮,凍干,得到初步純化產(chǎn)物；其中，緩沖液 A 為 pH8. O 的 50mM Tris-HCl ;緩沖液 B 為 pH8. O 的 50mMTris-HCl+lmol/ LNaCl ；(3)反向CS柱層析分離將步驟(2)得到的初步純化產(chǎn)物加入8 10倍重量的水溶解， 利用反向C8柱進(jìn)行柱層析，檢測波長為214nm，設(shè)置96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相 B走基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣量為2mL，96 (v/v) %流動相A和4 (v/v) %流動相B洗脫4min，然后調(diào)節(jié)流動相B的比例從4 (v/V) %至60 (v/V) %線性梯度洗脫IOmin,洗脫流速一直保持在8mL/ min，收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽產(chǎn)物；其中，流動相A為I (v/v) %。CF3COOH水溶液，流動相B為CH30H。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)、(2)和(3)中的濃縮條件為60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。
3.權(quán)利要求1或2的制備方法所制得的牡蠣殼抗氧化肽。
4.權(quán)利要求3所述的牡蠣殼抗氧化肽在抗氧化產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗氧化產(chǎn)品為抗氧化藥品、抗氧化保健品、抗氧化食品或抗氧化化妝品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡蠣殼抗氧化肽的制備方法，包括如下步驟(1)牡蠣殼肽的提取以牡蠣殼粉為原料，回流加熱提取后濾過，濃縮，凍干得牡蠣殼肽凍干粉；(2)離子交換層析分離將肽提取物通過SOURCE15Q強(qiáng)陰離子交換層析，收集主要峰，濃縮，凍干，得到初步純化產(chǎn)物；(3)反向柱層析分離將初步純化產(chǎn)物經(jīng)反向C8柱層析分離，收集主要峰，濃縮，凍干，得到牡蠣殼抗氧化肽。本發(fā)明所得的抗氧化肽具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，應(yīng)用廣泛，具有顯著的社會和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C07K1/18GK102993268SQ20121056669
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者邵江娟, 陳建偉, 王昱灃, 姚忠, 吳昊, 陳韜 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)