專利名稱：一種cart多肽化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種18F標(biāo)記的多肽化合物18F-A1-NOTA-CART及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄妝(cocaineand amphetamine regulatedtranscript, CART肽)是一種在體內(nèi)分布廣泛的神經(jīng)肽類物質(zhì)。研究證明，CART肽參與成癮、食欲、應(yīng)激、精神焦慮和內(nèi)分泌等生理過程。尤其CART肽在與藥物成癮有關(guān)方面的作用研究使其迅速成為神經(jīng)肽方面的研究熱點(diǎn)。
CART肽首先是由Spiess等人(1981)在羊下丘腦的抽提物中分離出來的，當(dāng)時(shí)認(rèn)為它是一種類似于生長(zhǎng)抑素之類的多肽，并未引起人們的重視。直到1995年Douglass等人發(fā)現(xiàn)，在急性給予精神活性藥物可卡因和苯丙胺后，CART mRNA的水平急劇增加，一些相似的研究也陸續(xù)被報(bào)道，這使得CART肽受到了極大的關(guān)注。隨后的研究發(fā)現(xiàn)CART mRNA的細(xì)胞核群具有CART肽的免疫反應(yīng)性，WesternBlotting也證實(shí)了 CART肽分布廣泛。目前已知大鼠腦垂體、腸道、腎上腺內(nèi)至少有6種不同的CART肽(從4KD到14KD)，包括大分子量的pr印roCART、proCART和小分子量具有生理活性CART55-102和62-102。有研究表明， CART肽可抑制動(dòng)物的攝食行為，降低肥胖大鼠的體重，并受瘦素(Ieptin)的調(diào)節(jié)；大鼠腹側(cè)被蓋區(qū)注射CART肽有精神興奮劑類似的效應(yīng)，可改變大鼠的行為；CART神經(jīng)元與多巴胺能神經(jīng)元共定位，并可調(diào)節(jié)腦內(nèi)多巴胺的代謝；CART肽調(diào)節(jié)下丘腦垂體激素的釋放；CART 肽與藥物依賴相關(guān)等等。
到目前為止，大鼠、小鼠、金魚及人類的CART基因已得以分離并完全測(cè)序，它們都由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。大小鼠的CART基因通過選擇性剪接形成兩種不同的產(chǎn)物，較長(zhǎng)的含有129個(gè)氨基酸，較短的含有116個(gè)氨基酸。人類的CART基因大約2. 5kb，定位于染色體5ql3_ql4 ；CART基因通過選擇性剪接形成兩個(gè)長(zhǎng)度的mRNA，從而產(chǎn)生兩個(gè)不同長(zhǎng)度的前體(propeptide) proCARTl-89和proCARTl_102。有趣的是,這兩個(gè)前體均能在大鼠中找到，而在人類中只存在proCARTl-89。前體中包含幾個(gè)切割位點(diǎn)，經(jīng)過翻譯后加工形成至少兩種有生物活性的CART肽。proCARTl-102會(huì)形成CART55-102和CART62-102 ； proCARTl-89會(huì)形成CART42-89和CART49-89，目前大部分的研究都集中在CART55-102和 CART62-102 上。
CART肽也是目前發(fā)現(xiàn)的少數(shù)幾種可通過血腦屏障(BBB)的肽類物質(zhì)，如果能以 CART肽的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，合成CART肽受體的拮抗劑或阻斷劑，那么這些與CART肽結(jié) 構(gòu)相似的肽類物質(zhì)就能通過BBB，從而抑制嗎啡依賴；另外，也有研究報(bào)道CART肽是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)劑，它可以抑制Αβ (β淀粉樣蛋白)神經(jīng)毒性所致的神經(jīng)損傷，改善認(rèn)知功能，對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)病理過程中的不同祀點(diǎn)均有影響,有望成為治療 AD的新型藥物；Elefteriou等人(Nature434 :514-520(2005))認(rèn)為CART肽在骨吸收中起作用，DeokAh 等人(Endocrinologyl47 (7) :3196-3202(2006))認(rèn)為 CART 信號(hào)傳導(dǎo)是造成骨吸收下降的原因。
因此，闡明CART肽具體的作用機(jī)制，找到CART受體及信號(hào)傳導(dǎo)過程，有利于尋找模仿或者阻斷CART作用，作為醫(yī)療試劑使用的激動(dòng)劑或者受體拮抗劑，從而為藥物篩選搭建平臺(tái)，具有重要意義。許多實(shí)驗(yàn)室都試圖用受體結(jié)合技術(shù)找到CART肽的受體，但是均以失敗而告終，在大腦或切片中都沒有特異性的受體結(jié)合。近年來一系列的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)表明 CART肽可以激活G蛋白信號(hào)通路，極大地支持了 CART肽G蛋白偶聯(lián)受體的存在；但是通過受體結(jié)合技術(shù)來驗(yàn)證這些結(jié)果時(shí)，存在著結(jié)合性低并且易變化等問題，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。
目前主要通過用125I標(biāo)記CART55-102和CART62-102的方法來進(jìn)行CART肽的受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Aleksandra Vicentic et al, CART (cocaine-and amphetamine-regulated transcript)peptide receptors Specificbinding in AtT20 cells, European Journal of Pharmacology, 2005 ；Yiming Lin et al, CART peptide stimulation of G protein-mediatedsignaling in differentiated PC12 Cells identification of PACAP 6-38 asa CART antagonist, Neuropeptides, 2011)。碘化反應(yīng)的基本原理如下通過氧化劑使碘化物(125D氧化成碘分子(125I2),碘分子再與多肽或蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用何種碘標(biāo)記法，標(biāo)記的化合物內(nèi)必須有碘原子可結(jié)合的基團(tuán)，即要含有酪胺基或組織胺殘基。結(jié)構(gòu)中含上述基團(tuán)的蛋白質(zhì)或肽類等抗原可直接用放射性碘進(jìn)行標(biāo)記。如不含上述基團(tuán)的，放射性碘無法標(biāo)記，必須在這些化合物的結(jié)構(gòu)上連接上述基團(tuán)后才能進(jìn)行碘標(biāo)記。因此影響蛋白質(zhì)、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質(zhì)、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)中暴露的程度。鑒于CART肽中所含酪胺基或組織胺殘基較少，會(huì)導(dǎo)致碘化效率的降低；同時(shí)直接標(biāo)記的過程難以控制，還可能造成CART 肽的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)生不可預(yù)料的改變，因此，迫切需要開發(fā)出一種可以高效標(biāo)記CART肽的標(biāo)記方法，以及可以提高PET顯像的靈敏度的示蹤劑，，更好地追蹤C(jī)ART肽在神經(jīng)中樞受體的分布情況，進(jìn)而研究CART肽與其受體的具體作用機(jī)制。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中CART肽的標(biāo)記效率低進(jìn)而影響PET顯像的問題，從而提供一種標(biāo)記效率高，純度高，制備簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好的以18F標(biāo)記的CART多肽化合物及其制備方法；
并進(jìn)一步的提供上述CART多肽化合物用作PET示蹤劑的應(yīng)用，以及其在監(jiān)測(cè)CART 肽在神經(jīng)中樞的受體分布中的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種CART多肽化合物，具有如下所示的結(jié)構(gòu)18F-A1-N0TA-CART，其中，所述CART 肽為來源于人、大鼠、小鼠或金魚的CART肽。
所述CA RT 肽包括 SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 所示的氨基酸序列。
所述CART 肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO 4所示。
所述CART多肽化合物的制備方法包括如下步驟
SOl :通過18O (p，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_，并將其富集在QMA柱上，用KHCO3溶液將18F_洗脫，加入乙腈共沸蒸干，以冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至3. 8-4. 2，得到所需的18F_反應(yīng)液；所述18O (p，n)18F反應(yīng)可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式及設(shè)備進(jìn)行，本發(fā)明各實(shí)施例中選擇回旋加速器進(jìn)行反應(yīng)，所述QMA柱先用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且常用類型即可；
S02 :取含有NOTA的醋酸緩沖液以及選定的CART肽，加入乙腈在40_50°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液；
S03 :向所述步驟SOl中所得的18F_反應(yīng)液中加入AlCl3溶液以及步驟S02中配制的N0TA-CART溶液，并用醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為3. 9-4. 5，保持95_105°C反應(yīng)；
S04 :用反相HPLC柱進(jìn)行純化，得到所述的多肽化合物18F_A1-N0TA_CART。
所述步驟S04中，所述HPLC的條件為選用的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-7K，其比例為55 45，所述流動(dòng)相的流速為O. 8mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，收集出峰時(shí)間為15min時(shí)的產(chǎn)品；本發(fā)明各實(shí)施例中選用C18柱(Agilent, 5um, 4. 6*250mm)進(jìn)行純化處理。
所述步驟S03中，所述N0TA-CART溶液以及所述AlCl3溶液的摩爾比為1.5 I 2 I0
進(jìn)一步的，所述含有N0TA-CART溶液中，所述NOTA與所述CART肽的摩爾比為1. 5 :1 2 :1。
所述含有NOTA的醋酸緩沖液的濃度為8 10mg/mL,本發(fā)明優(yōu)選10mg/mL,配制方法為0. 25mg的NOTA (I, 4，7-三氮環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸，CAS號(hào)56491_86_2，購于華益埃索托普公司(國(guó)內(nèi)))溶于25uL濃度為O.1M的醋酸緩沖溶液；或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選用其他合理的濃度也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
所述步驟SOl中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所選擇設(shè)備的性能選擇合理濃度的洗脫液，本發(fā)明中選用KHCO3作為洗脫液，且所述KHCO3溶液的濃度優(yōu)選為O. 4mol/L。
本發(fā)明還提供根據(jù)上述所述的方法制備得到的CART多肽化合物。
進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種PET示蹤劑，即為所述的CART多肽化合物。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CART肽在神經(jīng)中樞受體分布的技術(shù)，即使用所述的PET 示蹤劑對(duì)神經(jīng)中樞中CART肽受體的分布情況進(jìn)行PET顯像。
分子影像學(xué)(Molecular Imaging)是應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。在臨床前醫(yī)藥研究和臨床疾病診斷、療效評(píng)估、預(yù)后判斷等中已有大量應(yīng)用。特別是基于計(jì)算機(jī)斷層掃描的核醫(yī)學(xué)分子影像是目前分子影像中最具活力和最具前景的影像技術(shù)，它是以體內(nèi)特定分子作為成像對(duì)比度的醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)，能在真實(shí)、完整的人或動(dòng)物體內(nèi)，通過圖像直接顯示細(xì)胞或分子水平的生理和病理過程。它在臨床前分子生物學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)之間架起了相互連接的橋梁，也成為目前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué) (TranslationalMedicine)研究重要的工具之一。
PET全稱為正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emissiontomography, PET), 它是通過將極其微量的正電子核素示蹤劑注射到人體內(nèi)，然后采用特殊的體外測(cè)量?jī)x器 (PET)探測(cè)這些正電子核素在人體全身各臟器的分布情況，通過計(jì)算機(jī)斷層顯像的方法顯示人體全身主要器官的生理代謝功能和結(jié)構(gòu)。PET是Y照相機(jī)之后在核素顯像又一次重大進(jìn)展，代表了核醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)的最新成就，它已成為內(nèi)分泌疾病診斷和研究、藥物血濃度監(jiān)測(cè)、某些腫瘤和傳染病的診斷分型和受體研究的重要手段，應(yīng)用廣泛。
PET技術(shù)的靈敏度和特異性明顯地取決于使用的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)(示蹤劑)及其在體內(nèi)的分布。PET掃描中使用的放射性核素通常是具有短半衰期的正電子發(fā)射同位素，例如 nC(20min)、13N(IOmin)、150(2min)、18F (IlOmin)、131I (8 天)和 124I (4. 2 天)。這些放射性核素并入諸如葡萄糖(或葡萄糖類似物)、水或氨的身體常用的化合物中，或者并入結(jié)合受體或其他藥物作用部位的分子中。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明所述的18F標(biāo)記的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART，是通過雙功能螯合劑 NOTA實(shí)現(xiàn)18F和CART肽的連接的；由于NOTA可與CART肽的N末端通過脫水縮合反應(yīng)進(jìn)行連接，再通過螯合反應(yīng)被放射性核素標(biāo)記，化學(xué)過程相對(duì)簡(jiǎn)單明了，且反應(yīng)產(chǎn)物單一，便于分離純化；相對(duì)于其他標(biāo)記方法需要與某種特定氨基酸結(jié)合導(dǎo)致標(biāo)記范圍受限，本發(fā)明所述的方法有效避免了因?yàn)镃ART肽中酪氨酸殘基含量的多少及其在分子中的暴露程度對(duì)標(biāo)記效率產(chǎn)生影響的問題，從而提高CART肽的放射性標(biāo)記效率，將其作為示蹤劑進(jìn)行PET顯像處理時(shí)，有效提高了 PET顯像的靈敏度，便于對(duì)CART肽受體進(jìn)行進(jìn)一步的研究；
(2)由于氟在常溫下是淡黃色氣體，化學(xué)性質(zhì)活潑，幾乎所有物質(zhì)都能被其氧化成氟化物；且化合物分子中的氫被氟取代后，如果取代部位不是生物活性中心，則不會(huì)影響該化合物的生物活性；并且由于18F的半衰期相對(duì)較長(zhǎng)(IlOmin)，有利于一些較復(fù)雜的合成標(biāo)記；另外，18F標(biāo)記的小分子多肽易穿透組織，且具有生物專一性；因此，本發(fā)明所述的18F標(biāo)記的CART多肽化合物具有與CART相近似的活性，可以有效的顯示CART受體的分布情況；
(3)由于18F分子相對(duì)于小分子多肽的體積較大，常常會(huì)引起分子結(jié)構(gòu)變形，進(jìn)而影響其生物活性，因而本發(fā)明所述的方法采用18F標(biāo)記雙功能螯合劑的方式與Al金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，進(jìn)一步穩(wěn)定了標(biāo)記產(chǎn)物的生物活性，因此本發(fā)明所述的18F標(biāo)記的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART中，18F對(duì)標(biāo)記的多肽生物活性影響較??；因此18F_A1-N0TA_CART 能夠得到與CART肽相同的生物性能；
(4)通過雙功能螯合劑的使用，使得本發(fā)明所述的18F標(biāo)記的多肽化合物 18F-A1-N0TA-CART,其制備過程僅需30min，工藝簡(jiǎn)單易行，且標(biāo)記效率高達(dá)45 %，并且放化純度高，成本低；
(5)利用本發(fā)明所述的CART多肽化合物為示蹤劑，應(yīng)用PET顯像技術(shù)在體內(nèi)外各水平對(duì)CART肽的體內(nèi)過程進(jìn)行研究，考察CART肽在神經(jīng)中樞的受體分布情況及其用于精神活性物質(zhì)依賴靶標(biāo)的作用機(jī)制；
(6)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述的18F標(biāo)記的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART具有良好的生物性能，ICR小鼠各臟器對(duì)18F-A1-N0TA-CART的放射性攝取的SUV值并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明兩者具有相同的生物學(xué)性質(zhì)；且1卞414(7^-041 1'靶/非靶比值達(dá)到了 4倍多，可以滿足 CART肽體內(nèi)和體外作用過程的研究。


為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中，
圖1是實(shí)施例1所制備的18F-A1-N0TA-CART的放射性TLC圖
譜；
圖2是對(duì)ICR小鼠注射實(shí)施例1所制備的18F-Al-N0TA-CART30min后的Micro PET 腦部掃描圖3是對(duì)ICR小鼠注射實(shí)施例5所制備的18F-SFB-CART30min后的Micro PET腦部掃描圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例所制備的具有18F-A1-N0TA-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的CART進(jìn)行18F標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的 CART肽來源于大鼠或小鼠，其制備過程包括如下步驟
SOl :采用回旋加速器，通過18O (p，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_并將其富集在QMA 柱上，用200 μ L濃度為O. 4mol/L的KHCO3溶液將18F_洗脫進(jìn)反應(yīng)管，加入乙腈共沸蒸干兩次，以O(shè). lmol/L的冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至4. 0，得到所需的18F_反應(yīng)液，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為387mCi ；
S02 :取含有NOTA的醋酸緩沖液(ΝΟΤΑ濃度為10mg/mL) 25 μ L以及氨基酸序列如 SEQ ID NO 1所示的CART肽25 μ g,加入25 μ L乙腈在45°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液，其濃度為10mg/ml ；
S03 向所述步驟SOl中所得的18F_反應(yīng)液中加入3 μ L濃度為2mg/mL的AlCl3溶液以及步驟S02中配制的N0TA-CART溶液30 μ L，并用0. lmol/L的醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 為 4.1，100。。反應(yīng) 15min ；
S04 :用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈水=55 45，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，流速為0. 8mL/min的反相HPLC柱進(jìn)行純化，收集15min的產(chǎn)品，即得到所述的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為182mCi。
實(shí)施例2
本實(shí)施例所制備的具有18F-A1-N0TA-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的CART進(jìn)行18F標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的 CART肽來源于大鼠或小鼠，其制備過程包括如下步驟
SOl :采用回旋加速器，通過18O (p，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_，并將其富集在QMA 柱上，用200 μ L濃度為0. 4mol/L的KHCO3溶液將18F_洗脫進(jìn)反應(yīng)管，加入乙腈共沸蒸干，以 0. lmol/L的冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至4. 0，得到所需的18F_反應(yīng)液，采用CRC-15R活度計(jì) (CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為379mCi ；
S02 :取含有NOTA的醋酸緩沖液(Ν0ΤΑ濃度為10mg/mL) 18 μ L以及氨基酸序列如 SEQ ID NO 2所示的CART肽25 μ g,加入乙腈25 μ L在45°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液，其濃度為10mg/ml ；
S03 向所述步驟SOl中所得的18F_反應(yīng)液中加入3 μ L濃度為2mg/mL的AlCl3溶液以及步驟S02中配制的N0TA-CART溶液22 μ L，并用0. lmol/L的醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 為4. 1，保持100°C反應(yīng)15min ；
S04 :用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈水=55 45，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,流速為O. 8mL/min的反相HPLC柱進(jìn)行純化，收集15min的產(chǎn)品，得到所述的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為171mCi。
實(shí)施例3
本實(shí)施例所制備的具有18F-A1-N0TA-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的CART進(jìn)行18F標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的 CART肽來源于人，其制備過程包括如下步驟
SOl :采用回旋加速器，通過18O (p，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_，并將其富集在QMA 柱上，用200 μ L濃度為O. 4mol/L的KHCO3溶液將18F_洗脫進(jìn)反應(yīng)管，加入乙腈共沸蒸干，以 O. lmol/L的冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至3. 8，得到所需的18F_反應(yīng)液，采用CRC-15R活度計(jì) (CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為400mCi ；
S02 :取含有NOTA的醋酸緩沖液(ΝΟΤΑ濃度為10mg/mL) 20 μ L以及氨基酸序列如 SEQ ID NO 3所示的CART肽25 μ g,加入乙腈25 μ L在40°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液，其濃度為10mg/ml ；
S03 向所述步驟SOl中所得的18F_反應(yīng)液中加入3 μ L濃度為2mg/mL的AlCl3溶液以及步驟S02中配制的N0TA-CART溶液25 μ L，并用O. lmol/L的醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 為4. 5，保持95°C反應(yīng)15min ；
S04 :用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈水=55 45，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，流速為0. 8mL/min的反相HPLC柱進(jìn)行純化，收集15min的產(chǎn)品，得到所述的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為172mCi。
實(shí)施例4
本實(shí)施例所制備的具有18F-A1-N0TA-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的CART進(jìn)行18F標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的 CART肽來源于大鼠和小鼠，其制備過程包括如下步驟
SOl :采用回旋加速器，通過18O (p，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_，并將其富集在QMA 柱上，用200 μ L濃度為0. 4mol/L的KHC·O3溶液將18F_洗脫進(jìn)反應(yīng)管，加入乙腈共沸蒸干，以 0. lmol/L的冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至4. 2，得到所需的18F_反應(yīng)液，采用CRC-15R活度計(jì) (CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為390mCi ；
S02 :取含有NOTA的醋酸緩沖液(Ν0ΤΑ濃度為10mg/mL) 22 μ L以及氨基酸序列如 SEQ ID NO 4所示的CART肽25 μ g,加入25 μ L乙腈在50°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液，其濃度為10mg/ml ；
S03 向所述步驟SOl中所得的18F_反應(yīng)液中加入3 μ L濃度為2mg/mL的AlCl3溶液以及步驟S02中配制的N0TA-CART溶液28 μ L，并用0. lmol/L的醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 為3. 9，保持105°C反應(yīng)15min ；
S04 :用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈水=55 45，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，流速為0. 8mL/min的反相HPLC柱進(jìn)行純化，收集15min的產(chǎn)品，得到所述的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為176mCi。
實(shí)施例5
本實(shí)施例所制備的具有18F-SFB-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO 1 所示氨基酸序列的CART進(jìn)行18F標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的CART肽來源于大鼠和小鼠，其制備過程包括如下步驟Sll :采用回旋加速器，由18O (p，n) 18F反應(yīng)生成的無載體18F_富集在QMA柱上，用K2.2.2/K2C03溶液將18F_洗脫進(jìn)反應(yīng)管，加入乙腈共沸蒸干兩次，得到18F_，采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為390mCi ；S12:向所述步驟Sll所得的反應(yīng)液中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸鹽12mg，90°C反應(yīng)lOmin，冷卻IOmin ;加入O. 5M的NaOHO. 5mL，90°C水解5min，得到澄清透明的溶液；冷卻IOmin,加入O.1M的HC17. 5ml和1. 5ml乙腈,再通過一個(gè)活化的Sep-Pak C18柱，用3ml乙腈洗脫，得到4-18F-氟苯甲酸；S13 :向所述步驟Sll所得的反應(yīng)液中加入12mg TSTU (O- (N-琥珀酰亞胺)_1，1,3, 3-四甲基脲四氟硼酸酯)，在90°C下密閉反應(yīng)5min，冷卻lOmin，加入O.1M的HCl溶液5ml，再通過一個(gè)活化的S印-PakC18柱，用2ml乙腈洗脫，得到18F-SFB (N-琥珀酰亞胺-4-18F-氟苯甲酸酯)；S14 :取Img CART加入pH=8. 4的O.1M的碳酸緩沖溶液Iml放入反應(yīng)管，再快速取18F-SFBO. 05ml加入反應(yīng)管中，65°C油浴反應(yīng)30min，得到18F-SFB-CART,采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為3. 5mCi。實(shí)施例6本實(shí)施例所制備的具有1251-CART結(jié)構(gòu)的CART多肽化合物是對(duì)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的CART進(jìn)行I125標(biāo)記，所述具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的CART肽來源于大鼠和小鼠，其制備過程包括如下步驟S21 :將 10 μ I CART 肽(10mg/ml)與 7μ I NaI125 (8. OmCi) ,20 μ 10. 2mol/L PB(ρΗ8· 5)、10μ I 氯胺-T (5mg/ml)，在 15_60°C下渦旋震蕩 30_60s ；S22 :加入20 μ I偏重亞硫酸鈉(10mg/ml )，渦旋振蕩2_5min終止反應(yīng)；S23 :用平衡好的C18固相萃取小柱將反應(yīng)液解析分離純化，先用蒸餾水將游離碘等易放射性雜質(zhì)洗去，1251-CART吸附在C18固相萃取小柱上，再用IOmM鹽酸乙醇將1251-CART從C18柱上洗脫，得到1251-CART,采用CRC-15R活度計(jì)(CAPINTEC)測(cè)定其放射劑量為 2. 8mCi。分別測(cè)定實(shí)施例1-6中所制備得到的CART多肽化合物的標(biāo)記效率及放化純。計(jì)算標(biāo)記效率的公式為18F標(biāo)記CART的標(biāo)記效率=產(chǎn)品的放射劑量(mCi) /洗脫進(jìn)反應(yīng)管中的18F_的放射劑量(mCi) *100% ；125I標(biāo)記CART肽的標(biāo)記效率=產(chǎn)品的放射劑量(mCi) /NaI125的放射劑量(mCi)*100% ;因此，實(shí)施例1 中，18F-A1-N0TA-CART 的標(biāo)記效率=182/387*100% =47% ；實(shí)施例2 中，18F-A1-N0TA-CART 的標(biāo)記效率=171/379*100% =45% ；實(shí)施例3 中，18F-A1-N0TA-CART 的標(biāo)記效率=172/400*100% =43% ；實(shí)施例4 中，18F-A1-N0TA-CART 的標(biāo)記效率=176/390*100% =45% ；實(shí)施例5 中，18F-SFB-CART 的標(biāo)記效率=3. 5*40/390*100% =36% ；實(shí)施例6 中，1251-CART 的標(biāo)記效率=2. 8/8. 0*100% *100% =35%。產(chǎn)品的放化純的檢測(cè)是通過薄層色譜(TLC)法進(jìn)行檢測(cè)，分析系統(tǒng)如下展開劑為V(乙腈)/V(水)=95:5，支持物為硅膠板，通過薄層分析儀檢測(cè)得到產(chǎn)品的放化純。僅以實(shí)施例1為例，實(shí)施例1所制備的18F-A1-N0TA-CART的放射性TLC圖譜如圖1所示，根據(jù)峰面積積分得出產(chǎn)品的放化純?yōu)?8%。上述實(shí)施例1-6中所述各標(biāo)記方法的反應(yīng)性能等情況見下表
權(quán)利要求
1.一種CART多肽化合物，具有如下所示的結(jié)構(gòu)18F-A1-N0TA-CART，其中，所述CART為來源于人、大鼠、小鼠或金魚的CART肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CART多肽化合物，其特征在于，所述CART肽包括SEQID NO: 1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CART多肽化合物，其特征在于，所述CART肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 所示。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一所述CART多肽化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟501:通過18O (P，n) 18F反應(yīng)生成無載體18F_，并將其富集在QMA柱上，用KHCO3溶液將 18F-洗脫，加入乙腈共沸蒸干，以冰醋酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至3. 8-4. 2，得到所需的18F_反應(yīng)液；502:取含有NOTA的醋酸緩沖液以及選定的CART肽混合，加入乙腈在40_50°C下油浴反應(yīng)，得到N0TA-CART溶液；503:向所述步驟SOl中所得的18Γ反應(yīng)液中加入AlCl3溶液以及步驟S02中配制的 N0TA-CART溶液，并用醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為3. 9-4. 5，保持95_105°C反應(yīng)；504:用反相HPLC柱進(jìn)行純化，得到所述的多肽化合物18F-A1-N0TA-CART。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述步驟S04中， 所述HPLC的條件為選用的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-水，其比例為 55 45，所述流動(dòng)相的流速為O. 8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，收集出峰時(shí)間為15min時(shí)的女口廣叩ο
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述步驟S03 中，所述N0TA-CART溶液以及所述AlCl3溶液的摩爾比為1.5 :1 2 :1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備CART多肽化合物的方法，其特征在于，所述含有 N0TA-CART溶液中，所述NOTA與所述CART肽的摩爾比為1. 5 I 2 I。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的方法制備得到的CART多肽化合物。
9.一種PET示蹤劑，其特征在于，為權(quán)利要求1或2或3或8所述的CART多肽化合物。
10.一種檢測(cè)CART肽在神經(jīng)中樞受體分布的技術(shù)，其特征在于，使用權(quán)利要求9所述的 PET示蹤劑進(jìn)行PET顯像。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種18F標(biāo)記的CART多肽化合物18F-Al-NOTA-CART及其制備方法和應(yīng)用，該標(biāo)記方法利用雙功能螯合劑NOTA既能與多肽的非活性序列端共價(jià)結(jié)合，又能與金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物的特性，將18F與CART肽進(jìn)行了連接，形成了多肽化合物18F-Al-NOTA-CART。本發(fā)明所述的18F-Al-NOTA-CART具有與CART肽相同的生物性能，穩(wěn)定性好，標(biāo)記產(chǎn)物純度高，放化純大于90％；同時(shí)其制備方法簡(jiǎn)單，整個(gè)反應(yīng)僅需30min，成本低；18F-Al-NOTA-CART可以作為研究CART肽作用機(jī)制的重要工具，在以CART肽為靶向的新藥開發(fā)中起到重要作用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK103030689SQ20121057925
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者王燕, 唐玲玲, 梁克勇, 李新平, 虞善友, 顏成龍 申請(qǐng)人:無錫江原安迪科分子核醫(yī)學(xué)研究發(fā)展有限公司