用于癌癥的基因療法的nts-多聚復(fù)合納米顆粒系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了能夠在體外和體內(nèi)特異性地內(nèi)化至癌細(xì)胞例如與乳腺癌有關(guān)的癌細(xì)胞中的基因載體納米顆粒系統(tǒng)。所描述的系統(tǒng)通過該系統(tǒng)經(jīng)由NSTR1受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使治療基因特異性地引入靶細(xì)胞中，從而可以通過例如全身給藥、靜脈給藥或原位給藥來提供此類病癥的治療。
【專利說明】用于癌癥的基因療法的NTS-多聚復(fù)合納米顆粒系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗腫瘤基因療法的領(lǐng)域，其包括功能性基因向癌細(xì)胞類型中的特異性導(dǎo)入。更具體地，本發(fā)明涉及通過使用納米顆粒來在體內(nèi)發(fā)動(dòng)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移的策略，其中該納米顆粒攜帶一種響應(yīng)于治療目的而表達(dá)的基因，并在例如乳腺癌細(xì)胞中內(nèi)化以防止疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是全球女性死亡的首要原因。據(jù)估計(jì)，在活到85歲的女性中，有九分之一會(huì)在其一生中的一段時(shí)間罹患此病。乳腺癌在發(fā)達(dá)國家中表現(xiàn)出更高的比率，盡管發(fā)展中國家的乳腺癌發(fā)生率也在上升，使得這種差異正在縮小。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，美國、法國、冰島、大不列顛、加拿大、歐洲其他國家和澳大利亞顯示出最高的浸潤性乳腺癌發(fā)生率；而在不發(fā)達(dá)國家，發(fā)生率可能被低估。在美國，預(yù)計(jì)八分之一的女性將在其一生中的一段時(shí)間患上浸潤性乳腺癌。疾病發(fā)生率已急劇增長；例如，據(jù)估計(jì)，在2010年，僅在美國就有約40，000女性將因此而死亡。如果女性有家族史，則癌癥風(fēng)險(xiǎn)翻倍。5-10%的乳腺癌與BCRAl和BCRA2基因關(guān)聯(lián)，因?yàn)閹в羞@些基因的女性具有80%的遭受該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。然而，70-80%的乳腺癌在沒有家族史的情況下發(fā)生，這意味著，病因除了年齡以外還有環(huán)境因素(http:// www.wh0.1nt)。
[0003]乳腺癌的治療種類已增加，包括:芳香酶抑制劑的使用，該酶阻斷參與在雌激素和孕酮的合成中的酶；單克隆抗體的使用，防止細(xì)胞受體如HER2和IGF-1的活化；激酶抑制劑的使用，抑制經(jīng)由受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；疫苗的使用，其刺激腫瘤蛋白特異性抗體的產(chǎn)生，并且可以針對(duì)細(xì)胞或肽；以及其他治療，包括不同蛋白的抑制劑以及改變細(xì)胞蛋白的產(chǎn)生的基因療法。基因療法著重于使用ElA (腺病毒ElA區(qū)域的表達(dá)除使癌細(xì)胞對(duì)化療劑敏感外，還起到腫瘤基因抑制劑的作用，引起細(xì)胞分化和對(duì)癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；使用溶瘤腺病毒)和Ad5CMV-p53，其中Ad 5CMV-p53是編碼原生基因p53的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0004]惡性間皮瘤是始于間皮的罕見癌癥形式，間皮即為覆蓋并保護(hù)大多數(shù)內(nèi)臟的膜。間皮由兩層形成，一層包圍其自身器官，另一層在其周圍形成上皮囊。胸膜間皮瘤形成于稱為胸膜的肺內(nèi)襯中，并由兩層的間皮細(xì)胞構(gòu)成，即壁層和臟層。通常，在這兩層之間產(chǎn)生少量的液體，潤滑所保護(hù)器官的移動(dòng)。當(dāng)正常間皮細(xì)胞失去控制并快速分裂時(shí)，出現(xiàn)間皮瘤。間皮瘤的最常見形式為“胸膜”間皮瘤；其他形式為影響腹腔內(nèi)襯的“腹膜”間皮瘤和影響心臟內(nèi)襯的“心包”間皮瘤。預(yù)計(jì)西歐間皮瘤的發(fā)生率在2010和2020年之間達(dá)到頂峰。直接與石棉或石棉產(chǎn)品接觸的那些人具有更高的間皮瘤患病風(fēng)險(xiǎn)；然而，在極少暴露至此產(chǎn)品的人群中也有間皮瘤病例(Pass，1.等人，2005)。
[0005]任何形式的間皮瘤均是極其具有侵略性的，且經(jīng)常耐受于治療。此外，早期診斷極為罕見，因而間皮瘤治療通常不能達(dá)到完全的治愈。但是隨著新型藥物和早期檢測技術(shù)的發(fā)展，前景正在改善，希望至少實(shí)現(xiàn)患者的存活。患有胸膜間皮瘤的患者有三個(gè)選擇:手術(shù)、化療和放療。通常，患者接受兩種以上這些類型的聯(lián)合治療(Pass，1.等人，2005)。
[0006]胸膜間皮瘤和乳腺癌的早期檢測極大地改善患者的預(yù)后，并且這些患者有更寬范圍的治療選擇。如果疾病診斷及時(shí)，手術(shù)去除腫瘤，接以化療或放療來消除殘余的癌細(xì)胞會(huì)是成功的治療。缺乏早期診斷的患者的選擇較少，并且這些選擇主要局限于緩和護(hù)理，緩解疼痛與其他的疾病癥狀，并改善生活質(zhì)量。因此，必須要有更有效的用于治療任何階段(包括難治愈階段和轉(zhuǎn)移階段)癌癥的替代選擇。
[0007]基因療法是一種新的治療多種嚴(yán)重病癥例如腫瘤疾病的醫(yī)療策略。在基因療法中，已開發(fā)出病毒載體及非病毒方法和細(xì)菌方法(PatyarS.，等人，2010)，以在體內(nèi)和先體外后體內(nèi)地轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)。病毒方法和細(xì)菌方法高效，但對(duì)患者有風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，非病毒方法例如合成聚合物、脂質(zhì)體和電穿孔通常轉(zhuǎn)染效率較低，但卻是更安全的療法。
[0008]本發(fā)明涉及更安全且更高效的用于基因療法的非病毒性策略。該策略基于由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的天然細(xì)胞過程，通過該過程，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移特異性地靶向目的細(xì)胞(靶細(xì)胞)，其中配體對(duì)其受體的結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞表面上，產(chǎn)生內(nèi)吞作用。此處，配體被化學(xué)修飾，形成攜帶有共價(jià)連接至聚陽離子(例如polysinas或魚精蛋白)的DNA的復(fù)合物；或者，基因融合肽(如血清素HA2)和親核肽(如SV40的Vpl)可以與之結(jié)合。一旦發(fā)生內(nèi)吞，復(fù)合物到達(dá)內(nèi)體小室，由此遺傳物質(zhì)自身引入細(xì)胞核內(nèi)。更具體地,本發(fā)明涉及一種基因療法策略，以消除與乳腺癌及胸膜間皮瘤有關(guān)的細(xì)胞，本發(fā)明也涉及基因的靶向遞送，利用在感染細(xì)胞(或靶細(xì)胞)中被直接且排他性地內(nèi)化的分子復(fù)合物。分子復(fù)合物起到基因載體的作用，并且是被稱為神經(jīng)降壓素多聚復(fù)合物(polyplex)或NTS-多聚復(fù)合物的生物復(fù)合物，是將治療基因或自殺基因轉(zhuǎn)移至對(duì)具有NTS高親和性的受體I (NTSR1或NTS1，其已被Martinez-Fong等人描述過)進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞群中的生物可降解性納米顆粒系統(tǒng)(專利 MX264932B, 2001 ；Molecular Brain Research, 2002 ；Biochemica et BiophysicaAct,2006)。
[0009]在現(xiàn)有技術(shù)中，用于靶向基因遞送的技術(shù)是基于由如下體外和體內(nèi)檢定出的細(xì)胞表面中受體所介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的自然過程:
[0010]專利EP0587738B1記載了以定向方式運(yùn)送對(duì)分泌蛋白進(jìn)行編碼的基因的可溶性分子復(fù)合物。這些分子復(fù)合物由其在胞內(nèi)條件下釋放基因的能力所界定，并且其組成為:由使DNA縮合的聚合物構(gòu)成的基因結(jié)合劑、以及細(xì)胞特異性結(jié)合劑。其例示了包括聚賴氨酸的聚陽離子作為基因結(jié)合劑，并提到細(xì)胞結(jié)合劑可以是表面受體，表明脫唾液酸糖蛋白經(jīng)脫唾液酸糖蛋白受體的介導(dǎo)基因進(jìn)入肝細(xì)胞。還描述了白蛋白基因在白蛋白表達(dá)缺失大鼠的臨床前模型中轉(zhuǎn)染至肝細(xì)胞中。在此專利中記載的系統(tǒng)表現(xiàn)出低轉(zhuǎn)染效率，因?yàn)獒槍?duì)脫唾液酸糖蛋白的內(nèi)體以結(jié)合溶酶體來降解其內(nèi)容物為目的。
[0011]專利US5830852記載了使DNA到達(dá)特異性攜帶胰島素受體的細(xì)胞中的基因遞送系統(tǒng)，該基因遞送系統(tǒng)包含與胰島素或胰島素衍生物連接并與編碼具有治療益處的序列的縮合核酸相關(guān)聯(lián)的核酸結(jié)合肽H2N-Thr-Lys18-(S-乙酰亞氨基甲基-Cys)_C00H。體外檢定使用肝細(xì)胞的細(xì)胞系來例示。然而，有證據(jù)表明，使用該受體的轉(zhuǎn)染水平無法勝過常規(guī)轉(zhuǎn)染方法。因此，所描述的策略似乎并不適合于藥物應(yīng)用。
[0012]ChenJ.和col.(1994)記載了利用由表皮生長因子(EGF)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的基因遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含結(jié)合物，該結(jié)合物包含連接至單克隆抗體的多聚-L-賴氨酸，該系統(tǒng)特異性地與EGF受體結(jié)合以轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。結(jié)合物與帶有目的基因的DNA質(zhì)粒類似。所呈現(xiàn)的測試為體外的細(xì)胞檢定和報(bào)告基因的表達(dá)證實(shí)。
[0013]乳糖化多聚-L-賴氨酸和半乳糖化組蛋白也已被用于DNA的胞內(nèi)遞送(Midoux，P.等人，1993; Chen J.等人，1994)。
[0014]然而，為使上述的分子復(fù)合物高效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中，須向系統(tǒng)中添加破壞內(nèi)體的膜的藥理學(xué)藥劑例如氯喹。因此，這些系統(tǒng)不適合在體內(nèi)使用。
[0015]NTS-多聚復(fù)合物已經(jīng)被用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因，這與其在基因療法中的應(yīng)用相似。Rubio-Zapata和col.(2009)記載了 N1E-115細(xì)胞在Nu/Nu裸小鼠中的皮下移植(2.5X IO6細(xì)胞/200 μ L)，產(chǎn)生成神經(jīng)細(xì)胞瘤模型，以確定腫瘤生長的時(shí)間進(jìn)程、宏觀參數(shù)和組織病理特征。共聚焦顯微分析顯示出用碘化丙啶標(biāo)記的NTS-多聚復(fù)合物在細(xì)胞系GFP-NTSR1-N1E-115中的體內(nèi)、原位和體內(nèi)內(nèi)化，該細(xì)胞系表達(dá)與綠色熒光蛋白融合的NTSRl受體。同時(shí)示出，NTS-多聚復(fù)合物能夠?qū)SV-Tk自殺基因轉(zhuǎn)染到異源的成神經(jīng)細(xì)胞瘤移植體中，并創(chuàng)建出所期望的抗腫瘤療效。結(jié)果，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(即缺乏HSV-TK基因的空質(zhì)粒)的對(duì)照組相比，更昔洛韋(GCV)對(duì)Nu/Nu裸小鼠的額外施用(75mg/kg體重/天)顯著地降低經(jīng)局部轉(zhuǎn)染或靜脈轉(zhuǎn)染的小鼠中的腫瘤進(jìn)展(Rubio-Zapata, H.A.等人，2009)。
[0016]此外，Martinez-Fong and col.(2006)記載了在黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元中存在受體NTSRl的情況下，可能可以使用NTS-多聚復(fù)合物來治療帕金森氏病中的神經(jīng)元退行性病變。
[0017]這些數(shù)據(jù)有力地支持原位接種時(shí)NTS-多聚復(fù)合物的轉(zhuǎn)染特異性，從而在確定其生物可利用性和生物安全性之后，NTS-多聚復(fù)合物能夠在哺乳動(dòng)物包括人類的基因治療方案中進(jìn)行使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0018]本發(fā)明的重點(diǎn)在于，自殺基因經(jīng)由受體NTSRl內(nèi)吞作用的特異性轉(zhuǎn)移。典型的化療通過延遲多種類型腫瘤的進(jìn)展而被確立為用于癌癥患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。然而，化療并不特異性地靶向惡性細(xì)胞，且其毒性也影響健康細(xì)胞。相比之下，使用分子化療方案中的NTS-多聚復(fù)合納米顆粒系統(tǒng)，例如本發(fā)明中描述的系統(tǒng)，因其對(duì)表達(dá)NSTRl受體的腫瘤細(xì)胞的高度特異性而提供更多的優(yōu)勢。
[0019]本發(fā)明基于高度親和性的神經(jīng)降壓素(NTS)受體(NTSRl)的表達(dá)，該受體表達(dá)在乳腺浸潤性管腺癌(即在全球具有最高發(fā)生率和死亡率的癌癥)中被誘導(dǎo)。本發(fā)明涉及對(duì)于用在表達(dá)NTSRl的細(xì)胞中的新型抗腫瘤療法的開發(fā)，其中使用被稱為NTS-多聚復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
[0020]本發(fā)明的一個(gè)目的涉及，確定乳腺管腺癌MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞系在體外被NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染的能力，以作為抗腫瘤療法的第一估算值，以及涉及本發(fā)明系統(tǒng)將異種植入的MDA-MB-231轉(zhuǎn)染至免疫缺陷型裸小鼠并隨后使腫瘤進(jìn)展顯著降低的效力。
[0021]本發(fā)明的主要技術(shù)貢獻(xiàn)涉及，基于特別設(shè)計(jì)為治療乳腺癌或胸膜間皮瘤的被稱為NTS-多聚復(fù)合物的納米分子復(fù)合物，將基因轉(zhuǎn)移到乳腺腫瘤樣癌細(xì)胞以摧毀這些細(xì)胞的策略。NTS-多聚復(fù)合物的特點(diǎn)在于，具有與親核肽(PK)靜電連接并還靜電連接至與神經(jīng)降壓素(NTS )及基因融合肽(PF )結(jié)合的多聚-L-賴氨酸(PLL )的質(zhì)粒(pDNA )，其中pDNA具有治療基因的編碼序列。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及具有用于治療乳腺癌的特定基因的上述NTS-多聚復(fù)合物。
[0023]本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及使用對(duì)編碼自殺基因的pDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)移的NTS-多聚復(fù)合物，PDNA的表達(dá)造成對(duì)癌細(xì)胞的破壞，可用于治療乳腺癌，包括浸潤性或高度浸潤性乳腺癌，其中治療包括以腸胃外或靜脈注射方式進(jìn)行復(fù)合物的全身給藥，其中在對(duì)形成乳腺致癌組織的惡性細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞、或者靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染之后，發(fā)生全身性的細(xì)胞破壞，且PDNA也可以攜帶特定組織的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
[0024]本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及在乳腺癌的分子化療試驗(yàn)中使用NTS-多聚復(fù)合物，由通過轉(zhuǎn)染對(duì)無活性前藥起作用的酶(前藥通過所述酶的作用而活化)而進(jìn)行的針對(duì)靶向療法的自殺基因轉(zhuǎn)染 所構(gòu)成；自殺基因可以是所提及的HSV-Tk。然而，存在許多可以通過(自殺基因)所編碼的酶的作用而轉(zhuǎn)化的前藥，且系統(tǒng)的選擇可以取決于腫瘤的類型。當(dāng)使用HSV-Tk時(shí)，治療還包括在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以持續(xù)的治療有效量的方案施用更昔洛韋(GCV)0有毒基因的轉(zhuǎn)染其自身就是本發(fā)明的實(shí)施方式。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，NTS-多聚復(fù)合物可以攜帶自身無毒性但對(duì)所轉(zhuǎn)化細(xì)胞有毒的基因，從而策略的特異性變得更窄，并局限于腫瘤細(xì)胞。
[0025]Salmons, B.和col.(2010)回顧了截止當(dāng)時(shí)已有過記載的28個(gè)自殺基因-前藥系統(tǒng)。這些自殺基因和和前藥中有一些已經(jīng)經(jīng)由病毒載體或微囊化細(xì)胞而用于I期臨床試驗(yàn)，例如HSV-Tk/更昔洛韋、胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶、細(xì)胞色素P450/環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺。NTS-多聚復(fù)合物，如同Tk/更昔洛韋自殺基因療法，呈現(xiàn)為用于遞送所提及自殺基因和前藥的可行替代方案。
[0026]本發(fā)明的特定目的是使用NTS-多聚復(fù)合物來預(yù)防浸潤性癌癥的進(jìn)展，其中pDNA遞送并轉(zhuǎn)染任一種以下遺傳物質(zhì):重獲丟失基因的腫瘤抑制基因(TSG);抗致癌基因；破壞所擴(kuò)增致癌基因的表達(dá)的核苷酸序列；促凋亡基因或免疫調(diào)芐基因；并且pDNA也可以遞送組織特異性的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
[0027]同時(shí)，本發(fā)明的另一實(shí)施方式是使用NTS-多聚復(fù)合物，其中包括自殺基因的治療基因可以經(jīng)β -連鎖蛋白(beta-catenin)的合成啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)(Lipinski, 2004)。
[0028]本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及使用復(fù)合物來治療乳腺癌的可能性，其中治療包括原位施用此復(fù)合物。
[0029]本發(fā)明的基因療法策略的另一實(shí)施方式涉及本發(fā)明治療與常規(guī)化療或放療的組合，其能夠加強(qiáng)或確定所期望的結(jié)果。
[0030]本發(fā)明的另一目的是提供NTS-多聚復(fù)合物，以通過基因療法來治療惡性乳腺癌，其中該癌癥的特征在于對(duì)常規(guī)治療不敏感。
[0031]本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物也可以用來誘導(dǎo)特異性細(xì)胞凋亡；例如，經(jīng)由p53、與凋亡相關(guān)的TNF誘導(dǎo)配體(TRAIL/Apo2L)、Bax/Bcl2或Bac/Bcl2的共表達(dá)等等。本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物也可以用來促進(jìn)引發(fā)有效免疫應(yīng)答的超抗原的表達(dá)，或者尖端技術(shù)例如剪接體介導(dǎo)的pre-RNA反式剪接(SMART?)的應(yīng)用。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及使用NTS-多聚復(fù)合物來評(píng)估轉(zhuǎn)基因表達(dá)在乳腺癌中的生理效應(yīng)的可能性，包括藥代動(dòng)力學(xué)、生物可利用性和生物安全性的研究，還包括使用乳腺來源的癌細(xì)胞系例如MDA-MB231細(xì)胞系(其可以移植到裸小鼠(Nu/Nu)中作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?的可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】[0033]圖1示出透射電鏡的顯微圖，顯示出處于其松散形式(A)和壓縮成直徑IOOnm的納米顆粒(即稱為NTS-多聚復(fù)合物(B))的DNA質(zhì)粒。
[0034]圖2示出處于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒 pEGFP-Nl (4.7Kpb) (Clontech, Palo Alto, CA, USA)。
[0035]圖3示出處于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制下的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒pTracer-EF/V5-His(5.93Kpb)。該質(zhì)粒還具有EF-α啟動(dòng)子，其提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的高水平表達(dá)并控制目的基因的表達(dá)(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。
[0036]圖4示出編碼熒光素酶(Luc)的質(zhì)粒pORF-LUc (4.896Kpb)，其通過在表達(dá)載體pORF的Ncol-Nhel中以正義方向克隆Luc cDNA (1.656Kpb)而得到。Luc cDNA在之前使用 Ncol 和 Xbal 酶從 pGL3_Basic 載體(Promega Corporation, Madison, WI)得到。
[0037]圖5示出編碼HSV胸苷激酶(TK)的質(zhì)粒pORF-HSVTK (4.373Kpb)，其處于由延伸因子-1a啟動(dòng)子與人T細(xì)胞白血病病毒的5’非翻譯區(qū)構(gòu)成的雜合啟動(dòng)子的控制下(InvivoGen, San Diego, CA, USA)。
[0038]圖6示出RT-PCR分析，顯示MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞系中NTSRlmRNA的存在。NIE-115細(xì)胞是陽性對(duì)照，L929細(xì)胞是陰性對(duì)照。
[0039]圖7示出對(duì)NTSRl的免疫熒光，顯示出其存在于用Hoechst復(fù)染的細(xì)胞系MDA-MB-231 和 MCF7 中。校準(zhǔn)條=25 μ m。
[0040]圖8示出MDA-MB-231細(xì)胞中NSTRl通過NTS-多聚復(fù)合物進(jìn)行特異性基因轉(zhuǎn)移的功能。觀察NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)化(參見A-D)，經(jīng)I μ M神經(jīng)降壓素(NTS)阻斷的內(nèi)化(參見E-H)，經(jīng)500nM SR48692阻斷的內(nèi)化(參見I-L)或經(jīng)0.45M蔗糖阻斷的內(nèi)化(參見M-P)。校準(zhǔn)條=20 μ m。
[0041]圖9示出MCF7細(xì)胞中NTSRl通過NTS-多聚復(fù)合物進(jìn)行特異性基因轉(zhuǎn)移的功能。觀察NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)化(參見A-D)，經(jīng)ΙμΜ神經(jīng)降壓素(NTS)阻斷的內(nèi)化(參見E-H)，經(jīng)500nM SR48692阻斷的內(nèi)化(參見I-L)或經(jīng)0.45M蔗糖阻斷的內(nèi)化(參見M-P)。校準(zhǔn)條=20 μ m。
[0042]圖10示出在使用NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl質(zhì)粒的細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF7中綠色熒光蛋白(EGFP-Nl)的表達(dá)。校準(zhǔn)條=20 μ m。
[0043]圖11示出在使用NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染pORF-HSVTK質(zhì)粒的細(xì)胞系MDA-MB-231中的早期細(xì)胞凋亡的檢測。
[0044]圖12示出使用NT-復(fù)合物轉(zhuǎn)染pORF-HSVTK質(zhì)粒在不同細(xì)胞系中的可行性作用。CP=人乳腺健康組織的原代培養(yǎng)。GCV=更昔洛韋輔助治療。均值土S.E.M由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到。*與對(duì)照相比，為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。P〈0.005, Dunnett檢驗(yàn)。[0045]圖13示出NTSRl活化阻斷劑對(duì)NTS-多聚復(fù)合物在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的毒性抑制。從轉(zhuǎn)染后第3個(gè)小時(shí)開始，存在GCV (10 μ g/mL)。對(duì)照=具有NTS-多聚復(fù)合物pORF-HSVTK而沒有被阻斷的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。中位數(shù)土S.E.M由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到。*與對(duì)照相t匕，為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。P〈0.005, Dunnett檢驗(yàn)。
[0046]圖14示出乳腺癌的動(dòng)物模型。腫瘤(箭頭示出)通過在無胸腺的4周齡雌性Nu/Nu小鼠的右側(cè)腹皮下層中異種移植三百萬個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞而產(chǎn)生。
[0047]圖15示出通過在無胸腺的4周齡雌性Nu/Nu小鼠的右側(cè)腹皮下層中異種移植MDA-MB-231細(xì)胞而產(chǎn)生的腫瘤的生長曲線。
[0048]圖16是示出標(biāo)記有碘化丙啶的NTS-多聚復(fù)合物在表達(dá)NTSR1-GFP的MCA-MB-231細(xì)胞中的內(nèi)化的共聚焦顯微圖。NTS-多聚復(fù)合物為瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染。
[0049]圖17是示出MDA-MB-231細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)的共聚焦顯微圖。NTS-多聚復(fù)合物為瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染。
[0050]圖18是示出MDA-MB-231細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)的共聚焦顯微圖。NTS-多聚復(fù)合物經(jīng)血液轉(zhuǎn)染。
[0051]圖19示出經(jīng)由NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染HSVTK自殺基因以及更昔洛韋(GCV)治療所引起的腫瘤生長降低。每三天進(jìn)行轉(zhuǎn)染(箭頭)且GCV (100mg/kg體重,1.p.)每天施用。示出不經(jīng)處理(對(duì)照)或經(jīng)瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染和全身轉(zhuǎn)染(A ;上板塊)處理的動(dòng)物的代表性圖片，以及示出從這些動(dòng)物解剖的腫瘤的圖片(A，下板塊)。腫瘤生長速率(B)和研究結(jié)束時(shí)的腫瘤重量(C)的圖片。校準(zhǔn)條=lcm。n=3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0052]本發(fā)明的技術(shù)貢獻(xiàn)是指，使用特別設(shè)計(jì)為將合適基因引導(dǎo)至變化的靶細(xì)胞中的分子復(fù)合物，以在遺傳上修飾乳腺癌細(xì)胞的可`能性。該可能性源自于將基因載體或攜載體的設(shè)計(jì)與靶細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的特性相結(jié)合的途徑和策略發(fā)展。本發(fā)明涉及對(duì)經(jīng)由受體NTSRl內(nèi)化的定向基因進(jìn)行遞送的證實(shí)。存在于特定細(xì)胞中的受體NTSRl的內(nèi)化由NTS激活，最有用的是作為報(bào)告基因和治療基因到達(dá)表達(dá)該受體的被疾病感染的細(xì)胞群中的體內(nèi)轉(zhuǎn)移路徑。
[0053]本發(fā)明提出使用復(fù)合物NTS-多聚復(fù)合物的可能性；例如，用于基因療法方案以治療乳腺癌或胸膜間皮瘤。該策略是增強(qiáng)NTS-多聚復(fù)合物的預(yù)期特性的元素總和。在此提出的治療策略以受體NTSRl在兩種乳腺癌起源的細(xì)胞系中的存在為基礎(chǔ)，因?yàn)槭荏wNTSRl會(huì)進(jìn)行內(nèi)吞作用。策略具有比常規(guī)治療更佳的成功率。然而，可以同時(shí)使用兩種療法。從這個(gè)意義而言，腫瘤醫(yī)生將能夠研發(fā)出表明應(yīng)該如何根據(jù)患者的情況和需求而使治療多元化的治療安排。此外，給藥的劑量和優(yōu)選給藥途徑可以由專家設(shè)定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，不論給藥途徑如何，所包含的治療基因?qū)邢虬┘?xì)胞，特別是靶向以高度浸潤性為特征的那些，而不影響健康細(xì)胞。下面描述是對(duì)這種高度特異性的確鑿證據(jù)。
[0054]本發(fā)明中使用的基因載體或攜載體被稱為NTS-多聚復(fù)合物，其是包含生物可降解分子的環(huán)形、平均直徑為IOOnm的復(fù)合物，并設(shè)定為在表達(dá)神經(jīng)降壓素的高親和性受體(NTSRl)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)染)實(shí)驗(yàn)用途或治療性基因(圖1)。這些納米顆粒通過將質(zhì)粒(pDNA)靜電附著至親核肽(PK)并且靜電附著至結(jié)合神經(jīng)降壓素(NTS)和基因融合肽(PF)的多聚-L-賴氨酸(PLL)而形成。結(jié)合物被稱為NTS攜載體。靜電結(jié)合的出現(xiàn)是因?yàn)閜DNA是聚陰離子，而PK和PLL均是聚陽離子。Martinez-Fong研究小組近來通過結(jié)合血凝素的HA2肽的基因融合結(jié)構(gòu)域(PF)以及VplSV40肽的親核結(jié)構(gòu)域PK而提高了 NTS-多聚復(fù)合物的效率；PF和PK的細(xì)胞功能是，將NTS-多聚復(fù)合物從酸性內(nèi)體中救出并使質(zhì)粒運(yùn)送至細(xì)胞核，這可以解釋轉(zhuǎn)染的高效率(Martinez-Fong,等人，2006)。
[0055]攜載體中的NTS是負(fù)責(zé)對(duì)受體NTSRl的內(nèi)吞作用進(jìn)行激活的分子，而多聚_L_賴氨酸(聚陽離子)將靜電結(jié)合質(zhì)粒(聚陰離子)并將其壓縮成環(huán)形納米顆粒以被內(nèi)吞而不影響其特異性。
[0056]在NTS-多聚復(fù)合物中包含真核組成型啟動(dòng)子例如α?延伸因子啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子如多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)啟動(dòng)子，已經(jīng)引起轉(zhuǎn)染基因在體內(nèi)的延長表達(dá)(Martinez-Fong, D.等人，2002; 2006)。
[0057]NTS-多聚復(fù)合物的各組成部分在基因轉(zhuǎn)移過程中起著特定功能。PLL負(fù)責(zé)將pDNA縮合成IOOnm的納米顆粒，而NTS到達(dá)NTSRl受體并與之結(jié)合以誘導(dǎo)NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)吞作用。PF在被內(nèi)體的酸性活化時(shí)，通過將NTS-多聚復(fù)合物從溶酶體降解中救出而支持其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。一旦進(jìn)入細(xì)胞區(qū)室，PK發(fā)揮作用將pDNA運(yùn)輸入細(xì)胞核，以轉(zhuǎn)錄目的基因的編碼序列，接著在核糖體中將其翻譯成功能蛋白。為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染特異性，向PDNA添加組織特異性啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)僅在具有激活啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄元件的那些細(xì)胞中介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。總而言之，所有這些細(xì)胞指令都在NTS-多復(fù)合物組成部分中指定，且僅有轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞才能夠?qū)χ平庖员磉_(dá)實(shí)驗(yàn)性或治療性目的蛋白。NTS-多聚復(fù)合物中僅僅一個(gè)組成部分的化學(xué)組成上發(fā)生的小誤差均使NTS-縮聚復(fù)合物的編程無效。
[0058]源于乳腺管腺癌的細(xì)胞系MDA-MB-231在體外被NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染的能力是這種癌癥類型的抗腫瘤基因療法的第一途徑(圖2和3)。Forgez等人(2002)發(fā)現(xiàn)，稱為MCF7的乳腺癌細(xì)胞系(來自乳腺癌，如MDA-MB-231)具有與NTS連接且Kd為2nM的NTSRl和NTS3。細(xì)胞系MDA-MB-231是極其浸潤性的癌。圖4示出體外條件下EGFP報(bào)告基因在MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞系中的高效轉(zhuǎn)染的結(jié)果，而圖11和12示出體內(nèi)條件下的結(jié)果。
[0059]理論上而言，NTS-多 聚復(fù)合物應(yīng)當(dāng)對(duì)受體NTSRl發(fā)揮激動(dòng)劑效應(yīng)，不僅實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞過程而且引起信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。Forgez和col.(2002)報(bào)道，NTS具有刺激NTSRl的抗凋亡作用，因此預(yù)期此現(xiàn)象會(huì)消減由NTS-多聚復(fù)合物介導(dǎo)的抗腫瘤策略的效力。由于使用NTS-多聚復(fù)合物的基因療法誘導(dǎo)高效的抗腫瘤效應(yīng)，推斷由于整合入活性更昔洛韋(磷酸化形式)由錯(cuò)誤DNA鏈引起的促凋亡效應(yīng)相對(duì)于NTSRl活化引起的抗凋亡效應(yīng)是占優(yōu)的。顯然，整合到惡性細(xì)胞的DNA鏈中的許多錯(cuò)誤堿基(活性更昔洛韋)首先會(huì)產(chǎn)生不能夠?qū)盒赃z傳特性傳遞給子細(xì)胞的缺陷基因組，其次，引起大量功能低效的錯(cuò)誤蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。自殺療法的這些結(jié)果與癌細(xì)胞壽命不相配，并且相對(duì)于由受體NTSRl的活化而誘導(dǎo)的抗凋亡效應(yīng)占優(yōu)勢。
[0060]Carraway和Plona (2006)記載了 NTS受體的存在，發(fā)生百分比如下:Ewing’ s肉瘤中為65%,腦膜瘤中為52%,星形細(xì)胞瘤中為43%,甲狀腺癌中為29%,小細(xì)胞肺癌中為25%,乳腺癌中為5%，結(jié)腸癌中為4%，盡管未出現(xiàn)在肝癌、卵巢癌或前列腺癌中，但在胰腺癌中以75%的百分比發(fā)生。Carraway和Plona (2006)還記載到，細(xì)胞系比相應(yīng)的原發(fā)腫瘤具有更高的NTSl受體發(fā)生率，且由于組織肽酶的作用，配體NTS存在一定程度的不穩(wěn)定性。在本發(fā)明展開中記載的體內(nèi)檢定消除了對(duì)于NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)化表現(xiàn)以及其轉(zhuǎn)染例如乳腺腫瘤細(xì)胞的能力的任何疑慮。
[0061]重要的是，表達(dá)NTSRl受體的轉(zhuǎn)移乳腺癌并不全都響應(yīng)于化療和放療；同樣，由于缺乏特異性，這些治療還產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，本文記載的使用本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物來轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)是極佳的治療替代選擇。
[0062]關(guān)于使用基因療法來治療乳腺癌的可能性，我們能夠提出預(yù)防可能性，例如:
[0063]a)對(duì)腫瘤抑制基因(TSG)中發(fā)生的突變的恢復(fù)，突變?yōu)槔缬捎诖嬖诘任换虻耐耆珌G失和/或存在功能異常的等位基因，TSG是基因BRCA-1和BRCA-2(引起約80-90%的遺傳性乳腺癌)、P53基因(存在于多于20-30%的自發(fā)乳腺癌病例中)，和/或pRb (存在于30%的乳腺癌病例中)，
[0064]b)對(duì)擴(kuò)增的致癌基因的抑制；
[0065]c)促調(diào)亡基因療法；
[0066]d)免疫增強(qiáng)或遺傳調(diào)節(jié)(Khalili，Curiel, 2006)。
[0067]迄今為止，乳腺癌中最經(jīng)常擴(kuò)增的基因，稱為主要致癌基因，包括表皮生長因子c-erbB-2/HER-2 受體(neu)和 c_myc 核轉(zhuǎn)錄因子(Bland, KI, 1995)。
[0068]NTS-多聚復(fù)合物在分子化療方案中的用途，例如本文中記載的一種，是靶向乳腺癌和間皮瘤，并包括通過轉(zhuǎn)染對(duì)前藥活化起作用(通過酶的作用)的酶而在靶向療法中轉(zhuǎn)染自殺基因。自殺基因可以是HSV-Tk，因此治療也涉及更昔洛韋(GCV)的施用，更昔洛韋(GCV)的施用可以于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以持續(xù)的治療有效劑量方案開始。伴隨著此策略，預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)染的酶濃度高于其產(chǎn)生的組織中的濃度，因此，僅在此處發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。根據(jù)本發(fā)明，圖5和6示出在體外條件下自殺基因在細(xì)胞系MDA-MB-221中的高效轉(zhuǎn)染的結(jié)果。
[0069]本發(fā)明的可能性延伸至在表達(dá)細(xì)胞中起特定或?qū)ｉT作用的基因的轉(zhuǎn)染，由此療法可以以高得多的準(zhǔn)確度靶向腫瘤；可以預(yù)期，即使沒有轉(zhuǎn)染至各個(gè)細(xì)胞，所有腫瘤也會(huì)消失。因此，即使在低血管化的 腫瘤中(阻礙NTS-多聚復(fù)合物的接近)，所述的策略也非常有效。
[0070]建議將本發(fā)明的主要途徑作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，其涉及自殺基因的轉(zhuǎn)染。這是在消除轉(zhuǎn)移性細(xì)胞方面具有最佳成功率的分子化療，是不需要使自殺基因整合到基因組中以表達(dá)治療基因的轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明展開的過程中，鼠科模型被用來解決NTS-多聚復(fù)合物在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染自殺基因的能力問題，模型由在無胸腺小鼠中異種移植乳腺癌細(xì)胞構(gòu)成，留下惡性腫瘤的異位位點(diǎn)，因此，其是癌癥轉(zhuǎn)移模型。使用此策略，完成腫瘤的去除而不使有機(jī)體暴露至常規(guī)化療的典型毒性中，因?yàn)樽饔檬窃坏摹?br> [0071]對(duì)轉(zhuǎn)染有HSV-TK基因的小鼠進(jìn)行更昔洛韋(GCV)處理，給藥在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以持續(xù)的治療有效劑量方案起始。圖9中的結(jié)果是本發(fā)明系統(tǒng)有效性的證據(jù)。
[0072]本發(fā)明結(jié)合多個(gè)技術(shù)方面，呈現(xiàn)為特別設(shè)計(jì)成通過殺死癌細(xì)胞并降低轉(zhuǎn)移發(fā)生可能性來治療乳腺癌的策略，其中癌細(xì)胞包括高度增殖的細(xì)胞。
[0073]現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀已報(bào)道，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式是良好用于基因療法目的的機(jī)制。即使NTS-多聚復(fù)合納米顆粒系統(tǒng)復(fù)合物能夠應(yīng)用于針對(duì)所提及乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、間皮瘤、Ewing’ s肉瘤、星形細(xì)胞瘤等的基因療法中，然而，在DNA能夠運(yùn)送至細(xì)胞核并在各個(gè)這些病例中表達(dá)之前，有必要解決一些特別的困難以獲得成功表達(dá)。在本發(fā)明的展開中，得到的結(jié)果顯示出報(bào)告基因甚至治療基因在暴露于NTS-多聚復(fù)合物的研究細(xì)胞系(MFC7、MDA-MB-231)中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)有效性。
[0074]關(guān)于NTSRl受體在人癌細(xì)胞中的表達(dá)，在健康個(gè)體中，NTSRl在他/她體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中并不表達(dá)，且僅在非常特定的細(xì)胞和在解剖上有限的細(xì)胞群中有過發(fā)現(xiàn)，例如在神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的一些細(xì)胞核和神經(jīng)節(jié)中。作為癌癥的標(biāo)志物，NTSRl在生理上具有該受體表達(dá)的細(xì)胞中過表達(dá)或者在缺乏其表達(dá)的細(xì)胞中重新開始表達(dá)。在外周組織中，NTS以高密度位于胃腸道中，相比之下，受體NTSRl以低水平表達(dá)。在健康的人體中，NTSRl受體不在乳腺、結(jié)腸、肺和胰腺的上皮細(xì)胞中表達(dá)；但當(dāng)這些上皮組織在實(shí)體瘤中轉(zhuǎn)化時(shí)，編碼NTSRl受體的基因被誘導(dǎo)至高水平的表達(dá)。因此，使用NTS-多聚復(fù)合物的轉(zhuǎn)染在腫瘤細(xì)胞中更有效，因?yàn)樗鼈兙哂斜热梭w健康細(xì)胞更高密度的NTSRl受體。
[0075]通過血流接種的NTS-多聚復(fù)合物可以轉(zhuǎn)染胃腸道的腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞，因?yàn)镹TSRl存在于這些細(xì)胞中，盡管密度不同。相比于癌細(xì)胞中的高密度，NTSRl受體在健康個(gè)體的細(xì)胞中以極低水平表達(dá)。因此，腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染顯著高于胃腸道細(xì)胞中的感染。由于NTS不能穿過血腦屏障，在通過血流給藥后，NTSRl密度最高的器官即大腦并不被NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染。NTS-多聚復(fù)合物在抗腫瘤基因療法方案中進(jìn)行全身施用的優(yōu)勢超出了中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受自殺基因轉(zhuǎn)染的事實(shí)(Martinez-Fong等人，2008)。
[0076]NTS-多聚復(fù)合物具有的優(yōu)點(diǎn)為，當(dāng)使用組織特異性啟動(dòng)子例如hDAT啟動(dòng)子時(shí)，提供附加的特異性，并將轉(zhuǎn)基因表達(dá)局限于轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Martinez-Fong等人，2006)。可以使用針對(duì)癌細(xì)胞的特異啟動(dòng)子來保護(hù)外周組織中表達(dá)NTSRl受體的健康細(xì)胞免受轉(zhuǎn)基因表達(dá)的不良作用；例如，β_連鎖蛋白基因的啟動(dòng)子，通過該啟動(dòng)子，將表達(dá)僅限于惡性細(xì)胞。
[0077]本發(fā)明的展開部分涉及，證實(shí)NTSRl受體和NTS在高度浸潤性乳腺癌類型例如人細(xì)胞系MDA-MB-231中的共表達(dá)，其中共表達(dá)表明該受體的功能。此功能可以外推至原發(fā)腫瘤組織，并且在現(xiàn)有技術(shù)中沒有先例。
[0078]也作為本發(fā)明的展開部分，已在體外證實(shí)，NTSRl受體的活化增加此癌癥類型的一些轉(zhuǎn)化株的功能，從而支持NTS經(jīng)由NTSRl受體參與腫瘤進(jìn)展的事實(shí)。如同所預(yù)期的，在具有MDA-MB-231細(xì)胞異種移植物的裸小鼠中使用RNA干擾技術(shù)或藥理學(xué)阻斷，NTSRl受體的表達(dá)破壞會(huì)降低腫瘤進(jìn)程。
[0079]本發(fā)明的展開部分包括`對(duì)參與癌癥中的NTSRl受體活化的分子機(jī)制的研究，使用人結(jié)腸的腺癌細(xì)胞來證實(shí)Tcf/β-連鎖蛋白途徑與NTSRl受體的啟動(dòng)子激活之間的直接關(guān)聯(lián)(B0ssard，C.等人，2007)。該機(jī)制與使用β _連鎖蛋白合成啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)控制相關(guān)，其中該啟動(dòng)子在有絲分裂指數(shù)高的細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞中較為活躍。因此，使用此啟動(dòng)子是本發(fā)明實(shí)施方式之一的一部分。然而，還可以包含其他真核組成型啟動(dòng)子例如α?延伸因子啟動(dòng)子。
[0080]在導(dǎo)管型乳腺癌的研究中，發(fā)明人顯示，NTSRl受體的高表達(dá)與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的數(shù)量以及患者死亡率相關(guān)。進(jìn)行中的研究首次顯示，NTSRl受體在80%的間皮瘤患者和65%的非小細(xì)胞肺癌患者中表達(dá)。因此，這些類型的瘤形成和乳腺癌呈現(xiàn)為對(duì)于使用NTS-多聚復(fù)合物經(jīng)由NTSRl受體的內(nèi)化而進(jìn)行的治療性基因轉(zhuǎn)移的特定靶標(biāo)。
[0081]使用NTS-多聚復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效力取決于多種因素，包括細(xì)胞類型、受體應(yīng)答和所設(shè)計(jì)的信號(hào)通路的類型，盡管存在有用于神經(jīng)元和成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)染效力的先例。隨著在體外和臨床前模型的細(xì)胞檢定中使用NTS-多聚復(fù)合物，結(jié)果是，一旦NTS-多聚復(fù)合物被內(nèi)體內(nèi)化，就避開溶酶體的降解，遺傳物質(zhì)完整地到達(dá)細(xì)胞核并表達(dá)目的基因。可以研究受體是否返回到細(xì)胞膜(循環(huán))以促進(jìn)更多的內(nèi)吞事件，并由此提高轉(zhuǎn)染幾率。
[0082]理論上而言，一旦復(fù)合物被內(nèi)化，預(yù)計(jì)其留在內(nèi)體小泡內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中15-30分鐘；然而，所有與內(nèi)化相關(guān)的后續(xù)事件取決于細(xì)胞類型、NTS劑量、拮抗劑或激動(dòng)劑的類型以及暴露時(shí)間。
[0083]例如，在Cos-7細(xì)胞中，在暴露至激動(dòng)劑45min后觀察到NTSRl內(nèi)體與溶酶體的共區(qū)域化，因此必然有后續(xù)的降解。成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的研究和神經(jīng)元的原代培養(yǎng)證實(shí)，細(xì)胞失去對(duì)NTS的敏感性并在一段時(shí)間后敏感化，一旦發(fā)生內(nèi)化受體的降解,則重新合成。根據(jù)其任意異構(gòu)型對(duì)β -抑制蛋白(β -arrestine)的親和性,在受體的去磷酸化中出現(xiàn)延遲，并使細(xì)胞的再敏化變慢，促進(jìn)受體進(jìn)入降解通路。
[0084]對(duì)暴露至高濃度的NTSRl激動(dòng)劑的細(xì)胞脫敏現(xiàn)象可能影響基因療法過程中NTS-多聚復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。然而，這種現(xiàn)象在體內(nèi)應(yīng)用無法達(dá)到的高濃度激動(dòng)劑下才出現(xiàn)，并且是可逆的過程。體外研究顯示，所有NTSRl受體在持續(xù)暴露至高濃度激動(dòng)劑的24小時(shí)內(nèi)復(fù)位。出于這個(gè)原因，以單劑量完成NTS-多聚復(fù)合物的瘤內(nèi)施用或血液施用，每48小時(shí)重復(fù)一次。包含在內(nèi)地，NTS-多聚復(fù)合物可以以每24小時(shí)單劑量施用，24小時(shí)是所有NTSRl受體回復(fù)至細(xì)胞膜上的時(shí)間。
[0085]盡管NTSRl受體的表達(dá)在乳腺浸潤性導(dǎo)管腺癌中被誘導(dǎo)，本發(fā)明復(fù)合物的用途并不限于乳腺癌轉(zhuǎn)移階段的治療。其也可以用于某些病例中以原位治療乳腺癌，不管是乳腺小葉癌還是乳腺導(dǎo)管癌，更具體地，可以用于導(dǎo)管癌中作為即將發(fā)生的浸潤性癌癥的預(yù)示物。
[0086]NTS-多聚復(fù)合物可以用來治療源自乳腺的浸潤性導(dǎo)管癌，并且可以擴(kuò)散至乳腺的淋巴管或血管以通往身體其他部分。這是乳腺癌中最常見的腫瘤類型，且本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物可以用于治療髓樣癌，據(jù)估計(jì)髓樣癌造成所有乳腺癌病例中的5%。在髓樣癌中，癌細(xì)胞聚集并且在腫瘤邊界存在攻擊并破壞異常細(xì)胞和其他外來物例如細(xì)菌或病毒的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物可以用于治療由粘液產(chǎn)生細(xì)胞形成的膠樣癌。這種類型的導(dǎo)管癌是低浸潤性的且具有可取的預(yù)后，相比浸潤性導(dǎo)管癌或浸潤性小葉癌更不容易擴(kuò)散。
[0087]在藥物的納米【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)，本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物被視為對(duì)臨床使用為生物安全的系統(tǒng)，由于更加特異性而具有較低的連帶效應(yīng)，因此對(duì)于治療表達(dá)NTSRl受體的癌癥更加有效，特別側(cè)重于間皮瘤的治療和乳腺癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防。
[0088]本發(fā)明涉及靜脈施用被稱為NTS-多聚復(fù)合物的分子復(fù)合物以在高度浸潤性乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染自殺基因的能力。
[0089]在本發(fā)明的展開中，我們進(jìn)行報(bào)告基因pEGFP-Nl和pORF-Luc的內(nèi)化和表達(dá)的體外試驗(yàn)，并結(jié)合有使用神經(jīng)降壓素、特異拮抗劑SR48692或蔗糖的阻斷研究。對(duì)于功能性研究，我們使用自殺系統(tǒng)pORF-HSVTK-更昔洛韋(GCV)。還評(píng)估了細(xì)胞毒性。RT-PCR和免疫熒光研究已證實(shí)NTSRl在測試細(xì)胞系中的存在，這些測試細(xì)胞能夠特異性地內(nèi)化并表達(dá)報(bào)告基因。細(xì)胞系MDA-MB-231比MCF7更加有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但MDA-MB-231細(xì)胞的存活力在轉(zhuǎn)染過程中降低60%。
[0090]對(duì)于自殺基因，它們是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的一部分。在MDA-MB-231細(xì)胞的體外檢定中，質(zhì)粒pORF-HSVTK的轉(zhuǎn)染使得細(xì)胞存活力降低50%，不管是否用GCV進(jìn)行激活。阻斷檢定表明，細(xì)胞毒性效應(yīng)是由NSTl介導(dǎo)的NTS-多聚復(fù)合物的有效內(nèi)吞所引起的?？傊?，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)于NTS-多聚復(fù)合物的轉(zhuǎn)染最易感，這對(duì)細(xì)胞系是有細(xì)胞毒性的。由于它們是高度浸潤性的細(xì)胞，此效應(yīng)可以呈現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)更好乳腺癌抗腫瘤治療的額外優(yōu)勢。
[0091]使用由在無胸腺Nu/Nu小鼠中進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231的異種移植而構(gòu)成的鼠科模型，我們通過原發(fā)腫瘤異位位點(diǎn)(腫瘤轉(zhuǎn)移)的存在而具有處于與浸潤性癌癥可比較狀態(tài)的動(dòng)物模型。這種高度浸潤性乳腺癌類型的轉(zhuǎn)移治療是腫瘤學(xué)的主要挑戰(zhàn)，因?yàn)樵l(fā)腫瘤可以通過手術(shù)聯(lián)合放療或化療進(jìn)行治療。
[0092]一些最相關(guān)的結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡是介導(dǎo)GCV在轉(zhuǎn)染有HSV-TK自殺基因的腫瘤中的細(xì)胞毒性效應(yīng)的細(xì)胞死亡類型。相比之下，對(duì)照腫瘤顯示出大面積的壞死(腫瘤上的深色)，可能是因?yàn)檠汗?yīng)不能滿足腫瘤生長的代謝需求。
[0093]本發(fā)明方法中NTS-多聚復(fù)合物給藥的優(yōu)選形式是全身法，因?yàn)槠潴w現(xiàn)出總體策略的優(yōu)勢并且能夠用于治療難以觸及的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。然而，對(duì)于某些病例也可以考慮原位給藥。
[0094]以下實(shí)施例代表本發(fā)明的獲得、評(píng)價(jià)和應(yīng)用。結(jié)果完全支持NTS-多聚復(fù)合物在治療說明書中具體列出的癌癥中的臨床和實(shí)驗(yàn)用途。因?yàn)檫@些實(shí)施例僅包含在內(nèi)以用來說明本發(fā)明，因此并不意在限制本發(fā)明的范圍。
[0095]實(shí)施例1.NTS-載體:NTS_ (PF)-SPDP-PLL 的合成
[0096]為合成NTS-載體，我們使用以下肽:NTS (序列為ELYENKPRRPHL)，純度 >90%，l，672Da 分子量(MM) (Sigma, St.Louis MO, USA)；以及 PF (序列GLFEAIAEFIEGGffEGLIEGSAKKK),純度 96%，2，695Da MM (Synpep Corp., Dubli η, CA, USA)0兩種肽同時(shí)結(jié)合至MM為25,600-47，900 (平均為36，750Da)的PLL (Sigma, St.LouisMO, USA)。這樣就具有251個(gè)潛在的反應(yīng)性氨基。作為生物功能性交聯(lián)劑，我們使用N-琥珀酰亞胺基6-3 [3-(2-吡啶基 二硫代)丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP ；MM452.52 ；Cat.21651 ；Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA)。
[0097]NTS-載體合成是包括在室溫下進(jìn)行的五個(gè)連續(xù)步驟的過程:1) PLL-SPDP結(jié)合物的形成；2)PLL-SroP-SH結(jié)合物的形成；3)NTS-SPDP結(jié)合物的形成；4)PFSPDP的形成；以及5)由事先使用SPDP獲得的結(jié)合物形成NTS-載體[NTS-(PF)-SroP-PLL]。PLL(多聚-L-賴氨酸)可以具有不同的分子量且處于其L或D異構(gòu)形式。
[0098]實(shí)施例2.PLL-SPDP-SH結(jié)合物的形成
[0099]將25mg PLL 溶于 2mL 磷酸鹽緩沖液(PBS: 17.42mM, deNa2HP04, 2.58mM KH2HPO4,150mM NaCl, ImM EDTA，pH7.2)中。將其與事先溶于30 μ L二甲亞砜(DMSO)的 7.5mg LC-SPDP混合。在連續(xù)攪拌下，將PLL與LC-SroP的混合物孵育30分鐘。這段時(shí)間后，在用PBS平衡的 Econo-PaclODG 柱(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)上純化所得結(jié)合物(PLL-SH)P)。我們收集了 ImL的級(jí)分。從各個(gè)級(jí)分取3 μ I等分物，并在NanoDrop分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies ND_1000)中對(duì)其讀數(shù)以測定在215和280nm下的吸光度。
[0100]Econo-PaclODG柱使得〈6，OOODa的分子被洗脫；因此，在第一個(gè)峰(3-7mL)獲得PLL-SPDP結(jié)合物(52，043Da)，而在第二個(gè)峰(8-13mL)釋放出作為反應(yīng)產(chǎn)物洗脫液的游離SPDP (425.5Da)和N-羥基琥珀酰亞胺(114Da)。因此，收集對(duì)應(yīng)于第一個(gè)峰的級(jí)分，并使用真空濃縮器(Heto)將其濃縮至ImL的體積。為產(chǎn)生高反應(yīng)性的結(jié)合物，將PLL-SPDP-SH和24mg 二硫蘇糖醇(DTT)溶于0.5mL PBS中，并添加到ImL PLL-SPDP溶液中。
[0101]在連續(xù)攪拌下，孵育混合物30分鐘。然后在用PBS平衡的EconoCAPlODG柱中純化PLL-SPDP-SH結(jié)合物，收集Iml的級(jí)分。從各級(jí)分收集3 μ L等分物并在NanoDrop中讀數(shù)以測定其在215nm的吸光度?？紤]此柱的分離等級(jí)，PLL-SPDP-SH結(jié)合物(50，613Da)在第一個(gè)峰體積(3-6mL)中洗脫,且卩比唳-2-硫酮(IlODa)在第二個(gè)峰(9-16mL)洗脫。收集第一個(gè)峰的級(jí)分，并濃縮為1ml。
[0102]實(shí)施例3.NT-SPDP結(jié)合物的形成
[0103]將IOmg NTS溶于2mL PBS中，并與事先溶于30 μ L DMSO中的5mg LC-SPDP混合。在持續(xù)攪拌下，反應(yīng)混合物孵育30分鐘。在孵育后，在用PBS平衡的S印hadex G-1O柱(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden)上純化 NTS-SPDP 結(jié)合物。收集 0.1mL級(jí)分；在NanoDrop上對(duì)各級(jí)分的3 μ I等分物進(jìn)行讀數(shù)以測定其在215和280nm的吸光度。Sephadex G-1O具有避開<700Da的能力；因此，NTS-SPDP結(jié)合物(2，419Da)在第一個(gè)峰體積(3.5-8.4mL)中洗脫。收集與第一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的級(jí)分，并濃縮為lmL。
[0104]實(shí)施例4.PF-SPDP結(jié)合物的形成
[0105]稱量9.2mg PF,稀釋在2mL PBS中，并與事先溶于30 μ L DMSO中的2.5mg LC-SPDP混合。在持續(xù)攪拌下，混合物孵育30分鐘。在這段時(shí)間后，在用PBS平衡的S印hadex G_15柱(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden)上純化 PF-SPDP 結(jié)合物。我們收集
0.1mL的級(jí)分,并在NanoDrop中對(duì)各個(gè)級(jí)分的3 μ I等分物進(jìn)行讀數(shù)以測定其在280nm的吸光度。S印hadex G-15的色譜層析能力為<l，500Da;因此，PF-SPDP結(jié)合物(3，317Da)在第一個(gè)峰體積(3.7-7mL)中洗脫，而游離的SPDP (425.0Ta)和N-羥基琥珀酰亞胺(114Da)在第二個(gè)峰(18-31mL)洗脫。收集與第一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的級(jí)分，并濃縮為lmL。
_6] 實(shí)施例5.從先前的結(jié)合物形成NTS-載體
[0107]將三種事先得到的具有SPDP的結(jié)合物進(jìn)行混合，并在持續(xù)攪拌下孵育8小時(shí)。最后，使用2M胍于IOmM HEPES中的緩沖液(pH7.4)作為流動(dòng)相，在Biogel Al.5m柱(Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA, USA)上純化 NTS-(PF)-SPDP-PLL。我們收集ImL的級(jí)分，并用胍將各級(jí)分的等分物以1:3稀釋，以測定在215、280和343nm的吸光度。收集與低分子量結(jié)合物對(duì)應(yīng)的等分物(體積45-65mL),并使用氮氛的濃縮器(AmiconCorporation, Lexington, MA, USA)將其減少至ImL的終體積。在濃縮過程結(jié)束時(shí)，使用PBS(8.1mM Na2HPO4U.2mMKH2P04U38mM NaCl,2.7Mm KCl, ρΗ7.4)將 NTS-載體或 NTS 攜載體進(jìn)行連續(xù)細(xì)胞透析，并通過過濾(0.22mM的親水膜)滅菌。使用PLL執(zhí)行校準(zhǔn)曲線，以量化NTS-載體，并以小等分物于70°C保存。
[0108]實(shí)施例6.NTS-多聚復(fù)合物的形成
[0109]組裝NTS-多聚復(fù)合物，保持以下比例:三份pDNA (包含報(bào)告基因或治療基因的質(zhì)粒構(gòu)建體)、一份PK和兩份NTS-載體。第一步是形成pDNA復(fù)合物。通過SynPep (SynPepCorp.，Dublin, CA, USA)合成得自病毒 SV40 的突變蛋白 PK (MAPTKRKGSCPGAAPNKPK),純度為90%。PK具有正的凈電荷，使得其靜電結(jié)合至PDNA (聚陰離子)，形成pDNA-PK-復(fù)合物。我們使用恒定濃度的pDNA (6nM)和PK (5 μ M用于pEGFP-Nl且6 μ M用于pORF-HSVTK)。
[0110]向pDNA溶液逐滴加入PK溶液；在900印111下溫和攪拌混合物30分鐘。第二步包括向pDNA-PK溶液快速添加1%胎牛血清(FBS)，最后逐滴添加到含有NTS載體(90nM至270nM的遞增濃度)的溶液中并在恒定攪拌(900rpm)下孵育30分鐘。pDNA、PK和NTS-載體(結(jié)合有NTS-(PF)-SroP-聚賴氨酸)分別溶于無血清的Dulbelcco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco, Invitrogene C0., Grand Island, NY, USA)中。所有步驟在室溫下進(jìn)行。
[0111]NTS-載體必須能夠?qū)①|(zhì)粒DNA縮合成直徑為50-150nm的納米顆粒(圖1)，使得可以進(jìn)行內(nèi)體的內(nèi)化。在合成復(fù)合物的過程中，考慮獲得精確比例的DNA，保持固定量的DNA并提升結(jié)合復(fù)合物的濃度，以確保獲得相對(duì)于DNA的適當(dāng)比例。復(fù)合物的分子量可以不同。
[0112]實(shí)施例7.質(zhì)粒
[0113]NTS-多聚復(fù)合物能夠?qū)⒉煌|(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。因此，在不同實(shí)驗(yàn)中，我們使用限制性酶切圖譜示于圖2-圖5中的質(zhì)粒；質(zhì)粒pEGFP-Nl (4.7Kbp)編碼綠色熒光蛋白(GFP)，并處于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV) (Clontech, Palo Alto, CA，USA)的控制下。編碼GFP的質(zhì)粒pTracer-EF/V5-His (5.93Kbp)處于CMV啟動(dòng)子的控制下；其還具有提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中高水平表達(dá)并控制目的基因表達(dá)的EF-α啟動(dòng)子(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。
[0114]通過pORF表達(dá)載體的正義方向Ncol-Nhel上克隆cDNA Luc ( L 656Kpb)，得到編碼突光素酶(Luc)的質(zhì)粒pORF-LUc (4.896Kpb);使用Ncol和Xbal酶事先從pGL3_Basic載體(Promega Corporation, Madison, WI, USA)獲得 Luc 的 cDNA。
[0115]質(zhì)粒pORF-HSVTK (4.373Kbp)編碼HSV的胸苷激酶(TK)，并處于由α -1延伸因子啟動(dòng)子與人T細(xì)胞白血病病毒的5’非翻譯區(qū)組成的雜合啟動(dòng)子的控制下(Invivogen, SanDiego, CA, USA)ο
[0116]實(shí)施例8.MDA-MB-231和MCF7乳腺癌細(xì)朐系中的NTSRl檢測
[0117]通過RT-PCR研究(圖6)和免疫熒光(圖7)證實(shí)MDA-MB-231和MCF7乳腺癌細(xì)胞系中NSTRl的存在。對(duì)于PCR反應(yīng)，我們使用NTSRl和肌動(dòng)蛋白的特異引物。RT-PCR示出在N1E-115細(xì)胞系(陽性對(duì)照)和 兩個(gè)乳腺癌系中對(duì)應(yīng)于NTSRl的589bp條帶。相比之下，在L929細(xì)胞系(陰性對(duì)照)中沒有此條帶。在所有三個(gè)細(xì)胞系中，我們觀察到對(duì)應(yīng)于肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增子的349bp條帶。反過來，NTSRl的存在還通過間接的免疫熒光檢定加以證實(shí)。各個(gè)細(xì)胞系NlE-115、MDA-MB-231和MCF7示出受體的差異分布圖譜。對(duì)照細(xì)胞系N1E-155顯示出與膜定位或膜下定位對(duì)應(yīng)的點(diǎn)標(biāo)記。在細(xì)胞系MDA-MB-231中,標(biāo)記物優(yōu)選位于細(xì)胞核周區(qū)，而在細(xì)胞系MCF7中，分布圖譜對(duì)應(yīng)于使細(xì)胞具有上皮形態(tài)的細(xì)胞膜(鐵絲網(wǎng)狀)。相比之下，我們在L929細(xì)胞系中未觀察到免疫反應(yīng)性。
[0118]實(shí)施例9.本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物經(jīng)由NTSRl內(nèi)吞作用而在MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞系中內(nèi)化
[0119]NTSRl經(jīng)由內(nèi)吞作用使NTS-多聚復(fù)合物內(nèi)化的功能性在乳腺癌細(xì)胞系中使用NTS(ΙμΜ)、SR48692 (500ηΜ)或蔗糖(0.45Μ)的阻斷檢定進(jìn)行評(píng)價(jià)。用碘化丙啶(紅色)標(biāo)記NTS-多聚復(fù)合物的pDNA，以顯示其在經(jīng)由Hoechst33258 (藍(lán)色)染色的細(xì)胞核中的定位。細(xì)胞質(zhì)用鈣黃綠素AM (calcein AM，綠色)進(jìn)行染色。細(xì)胞通過共聚焦多光譜成像系統(tǒng)TCS-SPE (Leica Mycrosystems, Wetzlar, Germany)進(jìn)行分析。在以下 Ex/Em 條件下檢測熒光:對(duì)于使用紫外光的藍(lán)色通道為405/430nm ;對(duì)于使用氬激光的綠色通道為488/512-573nm ;對(duì)于使用氦氖激光的紅色通道為563/563-544。我們得到在z軸上分開I μ m的10-20個(gè)連續(xù)光區(qū)。
[0120]MDA-MB-231細(xì)胞(圖8)顯示出比MCF7細(xì)胞(圖9)細(xì)胞核增加的碘化丙啶熒光，表明它們更有效地內(nèi)化NTS-多聚復(fù)合物。[0121]如同所預(yù)期的，用NTS或SR48692阻斷NTSRl結(jié)合位點(diǎn)會(huì)阻止NTS-多聚復(fù)合物進(jìn)入兩種細(xì)胞系(圖8和9)。通過與蔗糖高滲溶液孵育而抑制內(nèi)體形成，同樣阻斷NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)化(圖8和9)。這些結(jié)果證實(shí)了通過NTS-多聚復(fù)合物經(jīng)由NTSRl內(nèi)吞作用進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移的特異性。
[0122]實(shí)施例10.GFP報(bào)告某閔在轉(zhuǎn)染有本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物的MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞中的表達(dá)
[0123]pEGFP-Nl質(zhì)粒經(jīng)由NTS-多聚復(fù)合物在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中的特異性內(nèi)化引起GFP報(bào)告基因的表達(dá)(圖10)。將細(xì)胞與產(chǎn)生最高效內(nèi)化的摩爾濃度下(pEGFP-Nl(6nM)、PK (5 μ Μ)和NTS-載體(180nM))形成的NTS-多聚復(fù)合物一起孵育。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌并用ImM Hoechst33258固定。細(xì)胞中的熒光用DMIRE2Leica 顯微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)的 20X 物鏡進(jìn)行分析，使用以下濾片:對(duì)于Hoechst33258為A，對(duì)于GFP為K3。圖像用Leica DC3005相機(jī)(LeicaMycrosystems ；Nussloch, Germany)進(jìn)行數(shù)字化。
[0124]實(shí)施例11.通討俥用本發(fā)明的NTS-多聚復(fù)合物在MDA-MB-231細(xì)朐中轉(zhuǎn)染HSVTK自殺基因而引起的細(xì)胞凋亡早發(fā)
[0125]通過膜聯(lián)蛋白V-FITC對(duì)早期凋亡標(biāo)志物磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)的檢測更具體地顯示出在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pORF-HSVTK所造成的破壞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，僅在以最佳1:30摩爾比轉(zhuǎn)染有NTS-多聚復(fù)合物的細(xì)胞中觀察到膜聯(lián)蛋白V的熒光。相比之下，在比率1:15 (無效劑量)下沒有標(biāo)記物(圖11)。由于固定后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行碘化丙啶染色，該檢定不能對(duì)壞死作為另一可能的細(xì)胞死亡機(jī)制而參與其中的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用apoDETECTANNEXIN V-FITC試劑盒來證實(shí)磷脂酰絲氨酸(PS)在細(xì)胞膜外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖11，區(qū)塊A和D)。細(xì)胞用碘化丙啶染色(圖11，區(qū)塊B-E)。圖11中區(qū)塊C和F對(duì)應(yīng)于同一排的圖像。顯微圖片代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使用帶K3濾片的Leica DMIRE2顯微鏡對(duì)FITC進(jìn)行熒光觀察并用TX2濾片對(duì)碘化丙啶進(jìn)行熒光觀察`。
[0126]實(shí)施例12.在使用本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染HSVTK自殺基因后，細(xì)胞密度降低
[0127]將乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF7以及得自健康乳腺組織(陰性對(duì)照)的原代培養(yǎng)物暴露至以最佳摩爾比(1:30)含有質(zhì)粒pORF-HSVTK的NTS-多聚復(fù)合物。二十四小時(shí)后，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并添加補(bǔ)充有10%BFS和10 μ g/mL GCV的培育培養(yǎng)基。含有GCV的培養(yǎng)基每24小時(shí)更換，持續(xù)2天。HSVTK-GCV系統(tǒng)的細(xì)胞毒性效應(yīng)通過比色MTT細(xì)胞存活力測試來說明。含有GCV的自殺系統(tǒng)的活化并不影響健康人細(xì)胞的可行性，但使癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF7的細(xì)胞可行性降低50%以上。有趣的是，NTS-多聚復(fù)合物的單次轉(zhuǎn)染急劇降低MDA-MB-231細(xì)胞系的細(xì)胞可行性(圖12)。此效應(yīng)與這些細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)TS-多聚復(fù)合物的杰出能力有關(guān)，如實(shí)施例9中所顯示的。
[0128]實(shí)施例13.通過阻斷NTSRl的活化來抑制本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染在MDA-MB-231細(xì)朐中的毒件
[0129]除陽性對(duì)照外，在添加含有質(zhì)粒pORF-HSVTK的NTS-多聚復(fù)合物之前，在不同的阻斷條件下孵育MDA-MB-231細(xì)胞30分鐘。這段時(shí)間后，添加NTS-多聚復(fù)合物，其事先用碘化丙啶(IOmM)染色并以對(duì)于pORF-HSVTK的最佳摩爾比(1:30)形成。在轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，添加GCVlOyg/mL。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，去除培育培養(yǎng)基并添加補(bǔ)充有BFS (10%)和IOyg/mL GCV的培養(yǎng)基。此GCV培養(yǎng)基每24小時(shí)更換，持續(xù)2天。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過MTT比色測試來評(píng)價(jià)細(xì)胞可行性。在GCV的存在下，NTSRl競爭性阻斷劑NTS (I μ M)或SR48692(0.5μΜ或ΙμΜ)阻止NTS-多聚復(fù)合物與NTSRl之間相互作用引起的細(xì)胞毒性效應(yīng)(圖13)。而且，通過在0.45Μ蔗糖中孵育以阻斷內(nèi)吞作用，也阻止細(xì)胞毒性效應(yīng)(圖13)?？偠灾?，阻斷測試已證實(shí)，NTS-多聚復(fù)合物在MDA-MB-231細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染所引起的毒性作用是由NTS-多聚復(fù)合物與NTSRl之間的相互作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而產(chǎn)生的。因此，大量但特異性的內(nèi)吞作用本身將在體內(nèi)提供惡性細(xì)胞數(shù)量的一定降低。將該結(jié)論包含在此，作為對(duì)本發(fā)明的額外貢獻(xiàn)。
[0130]實(shí)施例14.乳腺癌的動(dòng)物模型
[0131]在無胸腺的4周齡Nu/Nu雌小鼠中進(jìn)行檢定，在雌鼠的右側(cè)腹皮下層中接種3X106MDA-MB-231細(xì)胞(圖14)。對(duì)于內(nèi)化測試，對(duì)表達(dá)所克隆的與GFP結(jié)合的NTSRl的細(xì)胞進(jìn)行異種移植，而對(duì)于表達(dá)測試，使用野生型細(xì)胞系。將動(dòng)物保持在23°C的食物和水自由采用的無菌盒中，光照和黑暗期為12-12小時(shí)；監(jiān)測雌鼠并記錄腫瘤的進(jìn)行性生長(圖15)。為防止腫瘤進(jìn)行性生長受到動(dòng)物生命機(jī)能的干擾，并使痛苦最小化，在細(xì)胞系移植后第3周結(jié)束研究。在那時(shí)，腫瘤的平均體積為75mm3 (圖15)。所有過程基于NRC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用遵循墨西哥立法(N0M-062-Z00-1999 ;SAGARPA)進(jìn)行。CINVESTAV動(dòng)物使用和護(hù)理委員會(huì)監(jiān)督并批準(zhǔn)我們的實(shí)驗(yàn)程序。
[0132]實(shí)施例15.在體內(nèi)進(jìn)行的本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物的內(nèi)化
[0133]在形成NT的多聚復(fù)合物之前，用碘化丙啶(IOmM)標(biāo)記質(zhì)粒pEGFP-Nl，如早先報(bào)道的(Martinez-Fong, 2000)。
[0134]通過微量泵(BionanalyticalSystem, Inc.Model MD1001, West LafayetteIN，USA)輸注以10μ L/min的速率將標(biāo)記的多聚復(fù)合物(300μ L)接種到腫瘤中。接種后6小時(shí)，在深度麻醉下，用50mL磷酸鹽緩沖液(PBS) pH7.4，以及之后的4%Ρ--對(duì)動(dòng)物進(jìn)行心臟灌流。我們進(jìn)行腫瘤解剖，然后將其保持在30%蔗糖(作為冷凍保護(hù)劑)中36小時(shí)。隨后，進(jìn)行12μηι厚的切片。將切片貼附到玻片上，并用ProLong Gold (Invitrogen)覆蓋以保護(hù)熒光。細(xì)胞和NT-多聚復(fù)合物的熒光在TCS-SPE共聚焦多光譜成像系統(tǒng)(LeicaMicrosystems, Wetzlar, Germany)中觀察。在以下Ex/Em條件下檢測突光:對(duì)于使用IS激光的綠色通道為488/512~573nm，對(duì)于使用氦氖激光的紅色通道為563/563~544。我們得到在z軸分開I μ m的10~20個(gè)連續(xù)光區(qū)。
[0135]共聚焦切片的水平面顯示出在基因修飾成表達(dá)NTSR1-GFP的MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)部的NTS-多聚復(fù)合物的紅色熒光標(biāo)記。在共聚焦切片的豎直平面上得到相似的結(jié)果。這些結(jié)果已證實(shí)MDA-MB-231在體內(nèi)內(nèi)化本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物的能力(圖16)。
[0136]實(shí)施例16.體內(nèi)轉(zhuǎn)某閔表汰
[0137]將帶有可以進(jìn)行綠色熒光蛋白表達(dá)的質(zhì)粒pEGFP-Nl (300 μ L)的多聚復(fù)合物或?qū)φ沼梦⒘勘?Bionanalytical System, Inc., Model MD1001, West Lafayette, IN, USA)輸注以10 μ L/min的速率接種到腫瘤中。三天后，在深麻醉下，用50mL磷酸鹽緩沖液(PBS)PH7.4，以及之后的4%ΡΠ1對(duì)動(dòng)物進(jìn)行心臟灌流。我們進(jìn)行腫瘤解剖，然后將其保持在30%蔗糖(作為冷凍保護(hù)劑)中36小時(shí)。隨后，進(jìn)行1211111厚的切片，用Hoechst33258 (SigmaC0., Saint Louis, MO，USA)對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。將切片貼附到玻片上，并用ProLong Gold(InvitiOgen)覆蓋以保護(hù)熒光。細(xì)胞和NT-多聚復(fù)合物的熒光在TCS-SPE共聚焦多光譜成像系統(tǒng)(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)中觀察。在以下Ex/Em條件下檢測熒光:對(duì)于使用氬激光的綠色通道為488/512-573nm，對(duì)于使用紫外光的藍(lán)色通道為405/430nm。
[0138]如所預(yù)期的，本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物的體內(nèi)內(nèi)化也引起GFP在MDA_MB_231腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，其中MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞用Hoechst33258核染料來辨認(rèn)。表達(dá)較為高效且大量，如共聚焦顯微鏡研究所示(圖17)。與瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染一致，帶有質(zhì)粒pEGFP-Nl (300μυ的多聚復(fù)合物經(jīng)團(tuán)注接種到眼后靜脈竇中(全身轉(zhuǎn)染)也引起MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞中的GFP體內(nèi)表達(dá)(圖18)。使用對(duì)于瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染所述的條件，在靜脈方式轉(zhuǎn)染后三天，通過多光譜共聚焦顯微鏡記錄12μπι厚橫切片中的表達(dá)，并用Hoechst33258 (Sigma C0., SaintLouis, MO, USA)進(jìn)行復(fù)染。
[0139]實(shí)施例17.在使用NTS-多聚復(fù)合物轉(zhuǎn)染自殺基因pORF-HSVTK后減小的腫瘤體積、其生長速率和質(zhì)暈
[0140]對(duì)4周齡Nu/Nu無胸腺雌小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)它們在皮下右側(cè)腹接種3X106MDA-MB-231細(xì)胞(圖14)。逐步評(píng)價(jià)腫瘤生長速率直至達(dá)到100mm3，然后將動(dòng)物分成三組:不經(jīng)處理的對(duì)照組、經(jīng)瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染處理的組、以及經(jīng)血流轉(zhuǎn)染的組。將攜帶有對(duì)HSVTK自殺基因進(jìn)行編碼的質(zhì)粒pORF-HSVTK的NTS-多聚復(fù)合物(300 μ L)用于轉(zhuǎn)染。對(duì)于向腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染，用克他命-甲苯噻嗪的混合物深度麻醉動(dòng)物(5: lmg/Kg體重，1.p.；PisaAgropecuaria, SA de CV, Mexico)。使用微量泵(型號(hào) MDlOOl ;Bioanalytical SystemInc., West Lafayette, IN)將300 μ INT-多聚復(fù)合物以10 μ l/min的流量注射到腫瘤中。對(duì)于靜脈轉(zhuǎn)染，使用胰島素注射器(27gl3mm)將300 μ I NTS-多聚復(fù)合物溶液以以團(tuán)注劑量注射到眼后靜脈。在轉(zhuǎn)染后24h開始GCV處理(100mg/Kg體重，1.p.)，并每天重復(fù)。在結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，在深度麻醉下處死動(dòng)物，用50ml PBS進(jìn)行心臟灌流，接著用50ml的4%多聚甲醛固定。將腫瘤切片，并拍照存檔和稱重。最后，將組織保藏在4%多聚甲醛中。所有過程基于NRC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南遵循墨西哥立法(N0M-062-Z00-1999 ；SAGARPA)進(jìn)行。CINVESTAV動(dòng)物使用和護(hù)理委 員會(huì)(IACTC)批準(zhǔn)和監(jiān)督我們的實(shí)驗(yàn)程序。
[0141]所得結(jié)果(圖19)清楚地顯示出，NTS-多聚復(fù)合物能夠?qū)⒆詺⒒蜣D(zhuǎn)染到來源于人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的腫瘤細(xì)胞中并引起治療效應(yīng)。最顯著的特征是由NTS-多聚復(fù)合物的靜脈注射所引起的自殺效應(yīng)，其中NTS-多聚復(fù)合物是用于靶向基因遞送的納米顆粒系統(tǒng)。
[0142]由本發(fā)明NTS-多聚復(fù)合物介導(dǎo)的靶向基因療法比病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)具有更大的優(yōu)勢，因?yàn)殪o脈注射時(shí)病毒載體并不是特異性的。基于NTS-多聚復(fù)合物是安全的遞送系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，其用途為人類乳腺癌治療提供了更大的把握。
[0143]參考文獻(xiàn).[0144]1.Pass, 1., Vogelzang, N., Carbone, M.Malignant Mesothelioma:Advances inPathogenesis, Diagnosis, and Transitional Therapies.Springer:New York.(2005).[0145]2.Martinez-Fong, D.et.al.Vector fusogenico y cariofi Iico paratransferencias genicas mediadas por receptor y usos consecuentes.CINVESTAV-1PN.Mexic0.MX264932B, (2001).[0146]3.Martinez-Fong, D.et.al.1mproved neuro tens in-vector-mediatedgene transfer by the coupling of hemagglutinin HA2fusogenic peptide andVplSV40nuclear localization signal.[0147]Brain research.Molecular brain research, (2002) ; 105 (1-2): 86-97.[0148]4.Martinez-Fong, D.et.al.Biophysical characteristics of neurotensinpolyplex for in vitro and in vivo gene transfection.Biochimica et biophysicaacta (2006);1760(7):1009-20.[0149]5.Wuj G.et al., Targeted delivery of genes encoding secretory proteins,targeted delivery of genes encoding secretory proteins.EP0587738B.University ofConnecticut, (2000).[0150]6.Tatcherj D.R.et.al.Compositions for insulin-receptor mediated nucleicacid delivery.US5830852, Cobra Therapeutics, Ltd.(London，GB)，(1998).[0151]7.Chen, J.et.al.A novel gene delivery system using EGF receptor-mediatedendocytosis.FEBS Letters.(1994);338 (2):167-169.[0152]8.Midoux P et al.Specific gene transfer mediated by lactosylatedpoly-L-lysine into hepatoma cells.Nucleic Acids Res.(1993);21:871 - 878.[0153]9.Rubio-Zapata, HAjRembao-Bojorquez JDjArango-Rodriguez ML,DupouySj Forgez Pj Martinez-Fong D.NT-polyplex:a new tool for therapeutic gene deliveryto neuroblastoma tumors.Cancer Gene Ther.(2009) Jul;16(7):573-84.[0154]10.Martinez-Fong Dj et.al.1n vivo gene transfer to dopamine neurons ofrat substantia nigra via the high-affinity neurotensin receptor.Molecular medicine(2001);Cambridge, Mass;7(3):186-92.[0155]11.Forgez P.，et.al.Neurotensin counteracts apoptosis in breastcancer cells Biochemical and Biophysical Research Communications.(2002)，295(2):482-488.[0156]12.Forgez P，et.al.Expression of neurotensin and NTlreceptor inhuman breast cancer: a potential role in tumor progression.Cancer Res.(2006),66(12):6243-9.[0157]13.Carraway RE，Plona AM.1nvolvement of neurotensin in cancergrowth: evidence, mechanisms and development of diagnostic tools.Peptides.(2006)，27(10):2445-60.[0158]14.Khalili, Cu rielj 2006.Gene therapy for carcinoma of the breast.CancerGene Ther.(2006) 13(7):633 - 647.[0159]15.Bland KIj Konstadoulaki MM，Vezeridis MPj Wanebo HJ.0ncogene proteinco-expression: Value of Ha-ras，c-myc, c-fos，and p53as prognostic discriminantsfor breast carcinoma.Ann.Surg.221 (1995)，pp.706 - 720.[0160]16.Forguezj P.et al.PCT/EP2009/067094Methods for the treatment and theprognostic assessment of malignant pleural mesothelioma.1NSERM.W0/2010/069929.(2010).[0161]17.Forgez P et.al.Neurotensin expression and outcome of malignantpleural mesothelioma.Biochimie，(2010)，92 (2):164-170.[0162]18.Bossard Cj Souaze Fj Jarry A et al.0ver-expression of neurotensinhigh-affinity receptorI (NTSl) in relation with its ligand neurotensin (NT)and nuclear beta-catenin in inflammatory bowel disease-related oncogenesis.Peptides (2007)，28:2030 - 5.[0163]19.Frederique Souazey Patricia Forgez.Molecular and cellularregulation of neurotensin receptor under acute and chronic agonist stimulation.Peptides, (2006)，27 (19): 2493-2501.[0164]20.Salmons Bj Brandtner EMj Hettrich Kj Wagenknecht Wj VolkertB，F(xiàn)ischerS，Dangerfield JAj Gunzburg WH.Encapsulated cells to focus the metabolicactivation of anticancer drugs.Curr Opin Mol Ther.2010.[0165]21.Lipinski KS，Djeha HAj Gawn Jj Cl iff e S，Maitland NJj PalmerDH，Mountain A,Irvine AS,Wrighton CJ.0ptimization of a syntheticbeta-catenin-dependent promoter for tumor-specific cancer gene therapy.MolTher.2004Jul; 10 (I): 150-161.[0166]22.Patyar S，Joshi Rj Byrav DSj Prakash A，Medhi B，Das BK.Bacteria incancer therapy:a novel experimental strategy.J Biomed Sc1.2010Mar23;17(I):21.Review.
【權(quán)利要求】
1.一種NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物，能夠在體外或體內(nèi)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將基因轉(zhuǎn)移至在表面上具有NTSRl受體的乳腺癌細(xì)胞中，其特征在于包含: a)質(zhì)粒，攜帶將要轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中的基因； b)親核肽，靜電結(jié)合至a)； c)多聚-L-賴氨酸，同樣靜電結(jié)合至a)； d)神經(jīng)降壓素，化學(xué)結(jié)合至多聚-L-賴氨酸； e)至少一個(gè)基因融合肽，化學(xué)結(jié)合至多聚-L-賴氨酸；以及 f )任選地包含組織特異性轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子復(fù)合物NTS-多聚復(fù)合物，其中所轉(zhuǎn)移的所述質(zhì)粒攜帶有轉(zhuǎn)染至癌細(xì)胞中的自殺基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子復(fù)合物NTS-多聚復(fù)合物，其中所述自殺基因編碼HSV-Tk 酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子復(fù)合物NTS-多聚復(fù)合物，其中所轉(zhuǎn)移的所述質(zhì)粒攜帶有自殺基因，所述自殺基因是激活其他下游蛋白例如GSK3、Bax/Bcl2、Bac/Bcl2或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的分子復(fù)合物NTS-多聚復(fù)合物，其中所轉(zhuǎn)染的基因由合成的β_連鎖蛋白的啟動(dòng)子調(diào)控。`
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的分子復(fù)合物，其中所述多聚-L-賴氨酸具有不同的分子量并處于其L或D異構(gòu)形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的分子復(fù)合物在獲得藥物中的用途，所述藥物用于治療乳腺癌或表達(dá)功能性NTSRl受體的癌癥，例如間皮瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌或Ewing，s 肉瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物的用途，其中所述藥物用于治療浸潤前乳腺管癌或浸潤性乳腺管癌，以預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物的用途，其中所述藥物連同前藥物質(zhì)例如GCV進(jìn)行給藥，所述給藥按照特定設(shè)計(jì)的化療方案在特定時(shí)間以治療有效劑量進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物的用途，其中所述藥物意在全身給藥、靜脈給藥或原位給藥。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物在制造癌癥藥物中的用途，其中所述治療還包括常規(guī)的放療和化療。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6中一項(xiàng)所述的分子復(fù)合物在體外轉(zhuǎn)染具有功能性NTSRl的細(xì)胞的用途。
13.一種治療在其表面上具有NTSRl受體的癌細(xì)胞的藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求I-6所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物以及可接受的藥物載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物。
16.一種治療乳腺癌或表達(dá)功能性NTSRl受體的癌癥例如間皮瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌或Ewing’ s肉瘤的方法，其中將權(quán)利要求1-6所述的NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物施用至罹患此癌癥的患者。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述癌癥是浸潤前乳腺管癌或浸潤性乳腺管癌，以預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物連同前藥物質(zhì)例如GCV進(jìn)行給藥，所述給藥按照特定設(shè)計(jì)的化療方案在特定時(shí)間以治療有效劑量進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18所述的方法，其中所述NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物經(jīng)全身、靜脈或原位給藥。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19所述的方法，其中所述治療還包括常規(guī)的放療和化療。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20所述的方法，其中所述NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物通過權(quán)利要求13所述的藥物組合物進(jìn)行給藥。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-20所述的方法，其中所述NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物通過權(quán)利要求14所述的藥物組合物進(jìn)行給藥。
23.根據(jù)權(quán)利要求16-20所述的方法，其中所述NTS-多聚復(fù)合物分子復(fù)合物通過權(quán)利要求15所述的藥物組合物進(jìn) 行給藥。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK103458931SQ201280017029
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月10日
【發(fā)明者】R·A·卡斯蒂略羅德里格斯, M·L·埃斯科韋多桑切斯, D·馬丁內(nèi)斯豐 申請人:國立理工學(xué)院高級(jí)研究中心