在重組含油微生物中表達(dá)油體鈣蛋白以提高其中的油含量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了由于油體鈣蛋白多肽的表達(dá)而具有提高的油含量的重組含油微生物。本發(fā)明所公開的重組含油微生物產(chǎn)生占其細(xì)胞干重至少25%的油，并且包含功能性的多不飽和脂肪酸（PUFA）生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構(gòu)建體。還描述了提高重組含油微生物中的油的量的方法。
【專利說明】在重組含油微生物中表達(dá)油體鈣蛋白以提高其中的油含量[0001]本申請要求2011年5月26日提交的美國臨時申請61/490，337的優(yōu)先權(quán)，該申請全文以引用方式并入本文?！炯夹g(shù)領(lǐng)域】[0002]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及由于油體鈣蛋白多肽的表達(dá)而能夠產(chǎn)生更多的油的重組含油微生物?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003]微生物如絲狀真菌、酵母和藻類產(chǎn)生多種脂質(zhì)，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、 糖脂、聚酮化合物、留醇脂和孕烯醇酮脂類。通常從微生物中提取的一類脂質(zhì)是甘油脂，包括脂肪酸甘油酯(“三?；视汀被颉癟AG”)。TAG是主要的脂肪酸儲存單元，因此可含有長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，以及較短的飽和的及不飽和的脂肪酸與較長鏈的飽和脂肪酸。對在藥物和膳食產(chǎn)品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”； ω-3]的興趣一直在持續(xù)地增長。有效地并高性價比地產(chǎn)生包含PUFA的脂質(zhì)組合物的方法因此是尤其期望的。[0004]有多種商品化的PUFA來源。然而，有多種與這些使用天然來源的生產(chǎn)方法相關(guān)聯(lián)的缺點(diǎn)。第一，天然來源，例如魚和植物，趨于具有高度異質(zhì)性的油組成。從這些來源獲得的油能夠需要大量地純化，以分離或富集一種或多種所期望的PUFA。魚油通常具有令人不悅的嗅味，其可以是不能被經(jīng)濟(jì)地從所期望的產(chǎn)物分離的，并且能夠?qū)е麓祟惍a(chǎn)物不能作為食品補(bǔ)充劑被接受。令人不悅的嗅味能夠使得基于高劑量的攝入的醫(yī)療規(guī)程不合乎期望， 并阻礙患者的依從性。[0005]魚可積聚環(huán)境污染物，并且攝入魚油膠囊作為飲食補(bǔ)充劑可導(dǎo)致攝入不合乎期望的污染物。PUFA的天然來源還受制于可用性的不可控的波動(例如，由于天氣、疾病、或者就魚類資源而言的過度捕撈)。同樣，產(chǎn)生PUFA的作物與被開發(fā)用于產(chǎn)生食物的雜交體作物相比往往并不是在經(jīng)濟(jì)上有競爭力的。天然地產(chǎn)生PUFA的一些生物(例如，紫球藻 ^i(J}orphyridium)、^M^M(Jiortierella')')的大規(guī)模發(fā)酵還能夠是昂貴的和/或難以以商業(yè)規(guī)模培養(yǎng)。由于這些限制，進(jìn)行了大量用于開發(fā)能夠高效地和以商業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生PUFA的重組含油微生物的工作(例如，美國專利申請公布2005-0136519-A1)。此外， 還報道了在重組含油微生物中用以允許所期望的PUFA的產(chǎn)生的脂肪酸生物合成途徑的修飾(例如，美國專利申請公布 2006-0110806-A1、2006-0115881-Al、2009-0093543-A1、和 2010-0317072-A1)。然而，仍然存在對具有相對于目前已知的菌株的油提高的油含量的重組含油微生物的需求。[0006]美國專利7，256，014公開了至少一種植物油質(zhì)蛋白基因在被工程化以產(chǎn)生疏水的/親脂的化合物(例如類胡蘿卜素)的微生物細(xì)胞中的表達(dá)，顯著提高了該化合物的總體滴度。[0007]Froissard等人(/--? Yeast Res.9:428-438, 2009)公開了用編碼油體鈣蛋白多肽(擬南芥iAa7ia/?a)油體鈣蛋白l，AtClol)的異源性基因轉(zhuǎn)化的非含油酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae ),表現(xiàn)出脂質(zhì)體數(shù)量和大小的提高并且比親本菌株積聚了更多的脂肪酸。
[0008]然而，沒有用編碼油體鈣蛋白多肽的基因轉(zhuǎn)化重組含油微生物來提高此類重組微生物細(xì)胞的油含量的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]在第一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了重組含油微生物，該重組含油微生物產(chǎn)生占其細(xì)胞干重至少25%的油，并且該重 組含油微生物包含功能性的多不飽和脂肪酸生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構(gòu)建體。在與由相應(yīng)對照產(chǎn)生的油的量相比時，該實(shí)施例的重組含油微生物產(chǎn)生更大量的油，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸。
[0010]在第二實(shí)施例中，所述重組含油微生物可以是酵母、真菌、或藻類。在第三實(shí)施例中，所述重組含油微生物可以是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。
[0011]在第四實(shí)施例中，在由所述重組含油微生物產(chǎn)生的油中包含的多不飽和脂肪酸可以是ω-3多不飽和脂肪酸或ω-6多不飽和脂肪酸。在第五實(shí)施例中，所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0012]在第六實(shí)施例中，由遺傳構(gòu)建體編碼的油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比對方法與 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或 51 具有至少 90% 的同一性。該實(shí)施例的油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
[0013]在第七實(shí)施例中，將由遺傳構(gòu)建體編碼的油體鈣蛋白多肽連接到催化二?；视王；拿浮Ｔ诘诎藢?shí)施例中，催化二?；视王；拿甘橇字?二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)。
[0014]在第九實(shí)施例中，相對于所述油體鈣蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油體鈣蛋白多肽包含添加的半胱氨酸殘基。所述添加的半胱氨酸殘基能夠散布在所述油體鈣蛋白多肽的N末端和C末端區(qū)域內(nèi)。
[0015]在第十實(shí)施例中，本發(fā)明提供了提高重組含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步驟:
a)提供本發(fā)明的重組含油微生物；
b)使步驟(a)的重組含油微生物在其中產(chǎn)生油的條件下生長，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸；以及
c)任選地,回收步驟(b)的油。
[0016]在所述方法的一個方面，所述重組含油微生物可以是酵母、真菌、或藻類。在另一方面，所述重組含油微生物可以是解脂耶氏酵母。
[0017]在所述方法的另一方面，在由所述重組含油微生物產(chǎn)生的油中包含的多不飽和脂肪酸可以是ω-3多不飽和脂肪酸或ω-6多不飽和脂肪酸。在另一方面，所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(ΕΡΑ)。
[0018]在所述方法的又一個方面，由遺傳構(gòu)建體編碼的油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比對方法與 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、38、40、42、或51 具有至少 90%的同一性。該方面的油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。[0019]【專利附圖】

【附圖說明】和序列表圖1是PYRH55的質(zhì)粒圖譜，其被描述于本文的實(shí)例I中。[0020]圖2顯示了 AtClols和cys-AtClols的氨基酸序列之間的比對。添加至AtClols 以產(chǎn)生cys-AtClols的半胱氨酸殘基帶有下劃線。[0021]表14
【權(quán)利要求】
1.重組含油微生物,所述重組含油微生物產(chǎn)生占其細(xì)胞干重至少25%的油，其中所述重組含油微生物包含功能性的多不飽和脂肪酸生物合成途徑和至少一種編碼油體鈣蛋白多肽的遺傳構(gòu)建體； 進(jìn)一步地，其中在與由相應(yīng)對照產(chǎn)生的油的量相比時，所述重組含油微生物產(chǎn)生更大量的油，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物，其中所述微生物選自酵母、真菌、和藻類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物，其中所述微生物是解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica )。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物， 其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3多不飽和脂肪酸和ω-6多不飽和脂肪酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組含油微生物，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物，其中所述油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal W 比對方法與選自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、38、40、42 和 51 的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物，其中將所述油體鈣蛋白多肽連接到催化二酰基甘油?；拿?。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組含油微生物，其中所述酶是磷脂:二?；视王；D(zhuǎn)移BI(PDAT)0
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物，其中相對于所述油體鈣蛋白多肽的野生型氨基酸序列，所述油體鈣蛋白多肽包含添加的半胱氨酸殘基，其中所述添加的半胱氨酸殘基散布在所述油體鈣蛋白多肽的N末端和C末端區(qū)域內(nèi)。
10.提高重組含油微生物中包含的油的量的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組含油微生物； b)使步驟(a)的重組含油微生物在其中產(chǎn)生油的條件下生長，所述油包含至少一種多不飽和脂肪酸；以及 c)任選地，回收步驟(b)的油。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組含油微生物選自酵母、真菌、和藻類。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述微生物是解脂耶氏酵母。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3多不飽和脂肪酸和ω-6多不飽和脂肪酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)0
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述油體鈣蛋白多肽具有的氨基酸序列基于Clustal W 比對方法與選自 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 和32的氨基酸序列具有至少90%的同一性，其中所述油體鈣蛋白多肽具有油體鈣蛋白功能。
【文檔編號】C07K14/37GK103562217SQ201280025445
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月26日
【發(fā)明者】S-P.洪, Q.Q.朱 申請人:納幕爾杜邦公司