是蛋白trf2調(diào)節(jié)劑的新型肽和包含其的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及以下通式(I)的肽化合物：R1–(AA)n–X1–X2–X3–Lys–Lys–Gln–Lys–Trp–X4–(AA)p–R2。所述肽化合物可用作TRF2蛋白調(diào)節(jié)化合物和對(duì)DNA雙鏈斷裂具有保護(hù)作用。另外本發(fā)明涉及化妝組合物，其包含在生理可接受的介質(zhì)中的至少一種通式(I)的肽，并涉及其其化妝用途以預(yù)防和/或治療老化和光老化的皮膚跡象。本發(fā)明最后涉及依靠根據(jù)本發(fā)明的所述肽的美容治療的方法。
【專利說明】是蛋白TRF2調(diào)節(jié)劑的新型肽和包含其的組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化妝領(lǐng)域。其涉及作為TRF2蛋白調(diào)節(jié)化合物的以下通式(I)的肽化合物:
[0002]R1 - (AA) n - X1 - X2 - X3 - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp -X4- (AA) p - R2 (I)
[0003]因此其對(duì)DNA雙鏈斷裂有端粒保護(hù)作用和預(yù)防作用。包含在化妝組合物中的所述肽化合物意在預(yù)防和/或延緩延緩和/或治療老化的皮膚跡象。
[0004]衰老是影響“正?！苯M成人體的所有細(xì)胞的生物過程。生理性地，這涉及人體的一般老化，無論它們是皮膚細(xì)胞、毛發(fā)細(xì)胞、器官細(xì)胞等。
[0005]已有科學(xué)論證:衰老具體地是由端?？s短(復(fù)制衰老)或由嚴(yán)重的或長期的暴露于生理應(yīng)激信號(hào)(例如氧化應(yīng)激)引起的。研究用以限制細(xì)胞衰老的并因此限制人類的老化跡象的方法之一包括作用于端?？s短和/或限制氧化應(yīng)激對(duì)DNA的作用。
[0006]端粒由序列TTAGGG的重復(fù)和特定蛋白形成。端粒位于染色體的端部并確保其穩(wěn)定性。與端粒相關(guān)的蛋白有與雙鏈端粒DNA直接結(jié)合的TRFl和TRF2蛋白(TRF表示端粒結(jié)合因子)，或自身結(jié)合至單鏈3’端的POTl蛋白。在細(xì)胞分裂中，復(fù)制期間TTAGGG基序在轉(zhuǎn)運(yùn)中丟失。端粒的這種丟失由反轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶部分補(bǔ)償，由此保證最佳長度，所述端粒酶在先前存在的端粒端從頭合成端粒重復(fù)。所產(chǎn)生的問題是在體細(xì)胞中這種端粒酶的活性特別低，導(dǎo)致在各染色體復(fù)制中的端?？s短。目前用于限制皮膚老化以及其衰老的策略之一包括增強(qiáng)皮膚細(xì)胞的端粒酶活性。但是這導(dǎo)致所述細(xì)胞的無限增殖化，所述無限增殖化是不期望的因?yàn)闊o限增殖化的細(xì)胞可能與癌細(xì)胞相關(guān)。
[0007] 申請(qǐng)人:探索了另一途徑以嘗試通過調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白和更具體地TRF2蛋白的量來延緩細(xì)胞衰老。因此 申請(qǐng)人:開發(fā)了以下通式(I)的化合物:
[0008]R1 - (AA) J1-X1-X2-X3- Lys - Lys - Gln - Lys - Trp -X4- (AA) p - R2 (I)
[0009]所述化合物能夠通過調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白(TRF)的量預(yù)防和/或延緩和/或治療老化皮膚跡象。由于調(diào)節(jié)存在于細(xì)胞中的TRF蛋白的量，它們?cè)陬A(yù)防皮膚細(xì)胞損傷時(shí)DNA雙鏈斷裂的發(fā)生也是有用的。
[0010]如專利申請(qǐng)US20020076719、W09836066、或W02004092395中所述，之前已有提議
TRF蛋白調(diào)節(jié)化合物或端粒穩(wěn)定劑。但是上文引用的文獻(xiàn)中，沒有一篇描述或公開了本專利申請(qǐng)公開的肽化合物、或此類化合物化妝用途作為抗老化皮膚跡象的物質(zhì)。
[0011]因此本發(fā)明首先涉及以下通式⑴的肽`化合物:
[0012]R1 - (AA)n- X1-X2-X3- Lys - Lys - Gln - Lys - Trp -X4- (AA)p - R2 (I)
[0013]第二，本發(fā)明涉及化妝組合物，其包含所述通式(I)的肽化合物作為活性成分。
[0014]另外，第三，本發(fā)明涉及包含所述通式⑴的肽化合物的組合物的化妝用途，用以預(yù)防和/或延緩和/或治療老化皮膚跡象。具體而言，所述化妝組合物可用于:(i)調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白(TRF)的量和/或延緩皮膚細(xì)胞的衰老，(ii)預(yù)防損傷時(shí)皮膚細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂的發(fā)生，(iii)預(yù)防和/或治療皮膚光老化的皮膚跡象，和最后(iv)保護(hù)皮膚免受外部應(yīng)激。[0015]最后，第四，本發(fā)明涉及依靠包含式(I)的所述肽化合物的組合物對(duì)于待處理的皮膚或皮膚附屬物進(jìn)行化妝治療的方法，或依靠根據(jù)本發(fā)明的肽限制端粒的降解而不改變端粒酶的量和/或活性的化妝治療方法。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的肽化合物，特征在于其:
[0017]-調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白(TRF)和具體的TRF2蛋白的量；
[0018]-限制具有老化細(xì)胞表型的細(xì)胞內(nèi)波形蛋白細(xì)胞骨架的蛋白的增加和聚集；
[0019]-限制經(jīng)受甲基乙二醛的皮膚活組織的損傷外觀；和
[0020]-總之，使得可以預(yù)防和/或延緩和/或治療經(jīng)治療的細(xì)胞中的衰老跡象。
[0021]本發(fā)明首先涉及通式(I)的肽化合物:
[0022]R1 - (AA) n - X1 - X2 - X3 - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp -X4- (AA) p - R2 (I)
[0023]其中:
[0024]X1代表天冬酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、或無氨基酸，
[0025]X2代表異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、或無氨基酸，
[0026]X3代表蘇氨酸、天冬酰胺，絲氨酸、或無氨基酸，
[0027]X4代表絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或無氨基酸，
[0028]AA代表任意氨基酸，`η和P是0_2之間的整數(shù)，
[0029]R1代表N端氨基酸的伯胺官能-NH2，其中兩個(gè)氫原子中的一個(gè)可以被或不被以下基團(tuán)取代:乙酰基類型的飽和或不飽和的C1至C3tl烷基鏈、或苯甲酰基、甲苯磺?；?、或芐氧基羰基類型的芳香族基團(tuán)，
[0030]R2代表C端氨基酸的羧基官能的羥基-0Η，其中氫原子可以被或不被以下基團(tuán)取代=C1至C3tl烷基鏈，或NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y代表C1至C4烷基鏈，
[0031]所述通式(I)的序列由5至13個(gè)氨基酸殘基組成。
[0032]術(shù)語“肽化合物”或”肽”指通過肽鍵或修飾的肽鍵互相結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的鏈。
[0033]“肽化合物”或“肽”指上述本發(fā)明的天然的或合成的肽，或無論其是通過蛋白水解或合成獲得的，其片段中的至少一個(gè)或其任何天然的或合成的肽的序列包含上述肽的完整或部分序列。
[0034]組成本發(fā)明的肽化合物的氨基酸可以是左旋的結(jié)構(gòu)即L-，和/或右旋的結(jié)構(gòu)即D~o因此本發(fā)明的妝可以是L_、D-或DL-形式。
[0035]可能有必要使用本發(fā)明的肽的帶保護(hù)的形式，以提高抗降解性。明顯地該保護(hù)形式必須是生物相容形式并且必須與化妝領(lǐng)域的用途相容。優(yōu)選地，為了保護(hù)N端氨基酸的伯胺官能，使用具有飽和或不飽和的C1至C3tl烷基鏈的乙酰基類型的R1基團(tuán)的取代，所述R1基團(tuán)可選自乙?；蚍枷阕寤鶊F(tuán)。優(yōu)選地，為了保護(hù)C端氨基酸的羧基官能，使用C1至Cm烷基鏈的R2基團(tuán)，或NH2、NHY或NYY基團(tuán)取代，Y代表C1至C4烷基鏈。
[0036]可在N端或C端或兩端保護(hù)本發(fā)明的肽。
[0037]在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，在通式⑴中，η和P等于零，通式⑴的序列由5至9個(gè)氨基酸殘基組成。因此，這表示在通式(I)中:
[0038]X1代表天冬酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、或無氨基酸，
[0039]X2代表異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、或無氨基酸，[0040]X3代表蘇氨酸、天冬酰胺，絲氨酸、或無氨基酸，
[0041]X4代表絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或無氨基酸，
[0042]整數(shù)η和P等于零，
[0043]R1代表N端氨基酸的伯胺官能-NH2，其中兩個(gè)氫原子中的一個(gè)可以被或不被以下基團(tuán)取代:乙?；愋偷娘柡突虿伙柡偷腃1至C3tl烷基鏈、或苯甲酰基、甲苯磺?；?、或芐氧基羰基類型的芳香族基團(tuán)，
[0044]R2代表C端氨基酸的羧基官能的羥基-0Η，其中氫原子可以被或不被以下基團(tuán)取代=C1至C3tl烷基鏈，或NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y代表C1至C4烷基鏈，
[0045]所述通式⑴的序列由5至9個(gè)氨基酸殘基組成。
[0046]在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽化合物對(duì)應(yīng)于下式之一:
[0047](SEQ ID N0.1) Asn - Thr - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Thr - Asn - NH2
[0048](SEQ ID N0.2) Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - NH2
[0049](SEQ ID N0.3) Gly - Gly - Leu - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Asn - Leu - Tyr
[0050](SEQ ID N0.4) Ala - Met - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - NH2
[0051](SEQ ID N0.5) Ala - Leu - Ser - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Gln
[0052](SEQ ID N0.6) Cys - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Ser - NH2
[0053]本發(fā)明也涉及這些序列的同源形式。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“同源”指與選自SEQ IDN0.1至SEQ ID N0.6的序列的所述肽序列至少50%，或優(yōu)選地至少80%，甚至更優(yōu)選地至少90%相同的任何肽序列。短語“至少Χ%相同的肽序列”指待比較的兩個(gè)序列的氨基酸殘基之間的相同性百分比，由兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)之后獲得。所述最優(yōu)比對(duì)通過局部同源性算法實(shí)現(xiàn)，例如NCBI網(wǎng)站上可用的BLAST P軟件所使用的那些。
[0054]術(shù)語“同源的”也可指通過取代化學(xué)相當(dāng)?shù)陌被岫cSEQ ID N0.1至SEQ IDN0.6的序列的肽序列不同的肽，即通過將一個(gè)殘基用另一個(gè)具有相同特征的殘基取代。因此典型的取代在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；和在Asp和Glu酸性殘基之間；在Asn和Gln之間；和在Lys和Arg堿性殘基之間；或在Phe和Tyr芳香族殘基之間進(jìn)行。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的通式(I)的肽可使用組成氨基酸或其衍生物通過典型的化學(xué)合成(在固相或在均一的液相中)、或通過酶合成(Kullmann等人，J.Biol.Chem.1980; 225:8234)獲得。
[0056]本發(fā)明的肽可以是天然的或合成來源。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述肽得自化學(xué)合成。
[0057]最后，活性成分可以是單一的肽、肽與肽衍生物的混合物，和/或由氨基酸衍生物組成。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的肽化合物可溶于一種或多種生理適用的溶劑，所述生理適用的溶劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)狀多醇、或這些溶劑的任何混合物。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的另一有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的肽化合物可溶于化妝或制藥載體(例如脂質(zhì)體)，或吸附在粉末狀有機(jī)聚合物、礦物支持物(例如滑石和皂土)，更通常地可溶于或固定于任何生理適用的載體。[0060]其次，本發(fā)明涉及化妝組合物，其包含所述通式(I)的肽化合物作為活性成分。
[0061]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物是適合于局部應(yīng)用的形式，包括化妝用可接受的介質(zhì)?！盎瘖y用可接受的”，是指適合用于與人皮膚或皮膚附屬物接觸的介質(zhì)，而沒有毒性、不相容、不穩(wěn)定、過敏反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)。要用于皮膚上的組合物可以是霜、水包油乳劑、或油包水或復(fù)合乳劑、溶液、懸液、微乳劑、水成的或無水的凝膠、血清或囊泡分散體(dispersion)、貼劑、噴劑、軟膏、潤發(fā)油、洗液、膠質(zhì)、奶、洗液、棒或粉的形式，所有形式都適合應(yīng)用在皮膚、唇和/或皮膚附屬物上。 [0062]優(yōu)選地，所述肽化合物在組合物中以約0.1至500ppm之間的濃度，且優(yōu)選以約I至150ppm之間的濃度存在。
[0063]更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物也包含至少一種其它活性成分?？梢苑窍拗菩苑绞揭玫挠腥缦鲁煞址N類:植物肽水解產(chǎn)物、其它肽化合物、防曬劑、抗自由基劑或防皺劑。也可能引用維生素C及其衍生物、維生素B、DHEA(脫氫表雄酮)、植物固醇、水楊酸及其衍生物、類視黃醇、類黃酮、糖胺、吡咯，金屬鹽、或聚合物。
[0064]所述組合物也可包含治療劑、抗老化劑、抗皺劑、潤膚劑、吸水劑和消炎劑，調(diào)節(jié)分化、皮膚色素沉著或褪色等的制劑。
[0065]在更具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物除了式(I)的肽化合物將包含:
[0066]-一種(或多種)細(xì)胞色素C-激活化合物，和/或；
[0067]-一種(或多種)水通道蛋白-激活化合物和/或；
[0068]-一種(或多種)Sirtuin-激活化合物和/或；
[0069]-一種(或多種)增強(qiáng)細(xì)胞黏著的化合物和/或；
[0070]-一種(或多種)增大膠原或?qū)诱尺B蛋白類型等的基質(zhì)蛋白的生產(chǎn)的化合物；
[0071]-一種(或多種)hsp蛋白-調(diào)節(jié)化合物；
[0072]-一種(或多種)增大細(xì)胞能量的化合物；
[0073]-一種(或多種)提高皮膚屏障功能的化合物；
[0074]-—種(或多種)提高細(xì)胞同步的化合物，例如調(diào)節(jié)Clock蛋白、Perl蛋白或Bmal蛋白的物質(zhì)；
[0075]-一種(或多種)線粒體-保護(hù)化合物。
[0076]上文所述化合物可以是天然來源的(例如植物肽或非肽水解產(chǎn)物)或者是合成來源的(例如肽化合物)。
[0077]另外，可將如下的添加劑加入所述組合物中:例如溶劑、稀釋劑、染料、防曬劑、自黝黑劑、顏料、填充劑、防腐劑、吸味劑、增稠劑、乳化劑、增濕劑、潤膚劑、香料、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、遮蔽劑和調(diào)節(jié)劑。
[0078]在每一情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將確保選擇這些輔助劑及其比例以使得不會(huì)不利地影響本發(fā)明組合物所預(yù)期的有利性質(zhì)。這些輔助劑可以占所述組合物總重量的例如
0.01%至20%之間。當(dāng)本發(fā)明的組合物是乳劑時(shí)，相對(duì)于所述組合物的總重量，油相可以是5至80重量％，且優(yōu)選5至50重量％。組合物中使用的乳化劑和共乳化劑將選自所涉及領(lǐng)域內(nèi)典型使用的那些。例如，相對(duì)于所述組合物的總重量，它們可以0.3至30重量％的變化比例使用。
[0079]第三，本發(fā)明涉及在化妝可接受的介質(zhì)中包含所述肽化合物的組合物的化妝用途，用以預(yù)防和/或延緩和/或治療老化的皮膚跡象?！袄匣钠つw跡象”包括但不限于老化引起的皮膚上可見的任何跡象。具體地，這指皺紋、深的和粗糙的紋，小皺紋、裂紋、皮膚和皮下組織的松弛、皮膚彈性和張力的損失、緊致性和色澤的損失、和皮膚萎縮。另外，“老化的皮膚跡象”涉及粗大的毛孔、瑕疵、變色、老年斑、角化病、膠原蛋白流失、和在真皮和表皮中的其它變化，但也涉及因老化的皮膚和皮膚附屬物的所有外觀變化，例如角質(zhì)層的表面粗糙度，以及不系統(tǒng)性涉及改變的外觀方面的任何皮膚內(nèi)部變化，例如真皮變薄。
[0080]在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，所述化妝組合物使得可在皮膚細(xì)胞中調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白的量和/或延緩衰老。短語“調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白(TRF)的量”指增加或減少細(xì)胞中存在的TRF蛋白的量，或(通過直接或間接調(diào)芐基因表達(dá))增加/減少其蛋白合成，或通過其它生物過程，例如信使RNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定化/去穩(wěn)定化。優(yōu)選地，所述TRF蛋白由TRF2和/或POTl蛋白代表。
[0081]在本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化妝組合物用于預(yù)防皮膚細(xì)胞中在損傷時(shí)DNA雙鏈斷裂的發(fā)生。實(shí)際上，在皮膚遭受的損傷中，特別是由于UV輻射和氧化應(yīng)激的損傷中，所述細(xì)胞的DNA可能遭受表現(xiàn)為雙鏈斷裂的損傷。根據(jù)本發(fā)明的肽化合物證實(shí)了它們對(duì)于這種類型的損傷的DNA保護(hù)作用。
[0082]本發(fā)明的肽的另一個(gè)用途包括預(yù)防和/或治療皮膚光老化的皮膚跡象?！肮饫匣敝赣砷L時(shí)期和累積暴露于日光所引起的皮膚的過早老化。
[0083]本發(fā)明的肽也可用于保護(hù)皮膚免受外部應(yīng)激?！巴獠繎?yīng)激”指由環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激。例如,可以提及的應(yīng)激有:例如污染，UV輻射，引起氧化應(yīng)激的應(yīng)激,或刺激性產(chǎn)品如表面活性劑、防腐劑或香料，機(jī)械應(yīng)激如磨損、剃須或脫毛。但是，優(yōu)選地，外部應(yīng)激主要包括UV輻射，以及具體地UVB輻射,和引起氧化應(yīng)激的應(yīng)激。
[0084]最后，本發(fā)明最后涉及化妝治療方法，其特征是在早上和夜晚，在皮膚上應(yīng)用包含有效量的如上文定義的肽化合物`的組合物，用以預(yù)防和/或治療老化的皮膚跡象。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過本發(fā)明的組合物進(jìn)行化妝治療皮膚的方法，用以限制端粒降解，而不改變端粒酶的數(shù)量和/或活性。有效地，本發(fā)明的肽使得可以穩(wěn)定化和/或限制端粒降解而不影響端粒酶的活性和/或數(shù)量，這是重要的，因?yàn)橛纱瞬淮嬖诩?xì)胞無限增值的風(fēng)險(xiǎn)。
[0085]下文的實(shí)施例描述和闡明本發(fā)明所述肽化合物的功效，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施方案
[0086]實(shí)施例1:研究SEQ ID N0.2的肽對(duì)由復(fù)制衰老而老化的成纖維細(xì)胞的作用
[0087]將人成纖維細(xì)胞放入特定培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)物中，并通過每日施用1%或3%濃度的SEQ ID N0.2的肽保持在培養(yǎng)物中進(jìn)行長期處理(超過17傳代)。在培養(yǎng)物傳代6和17中的細(xì)胞上進(jìn)行波形蛋白免疫熒光檢測(cè)試驗(yàn)。然后用PBS清洗細(xì)胞，用3.7%的甲醛固定10分鐘。通過 0.2% 的 Triton X-100 (FisherChemical)透化 10 分鐘，并用 1% 的 BSA (Euromedex)培育15分鐘。然后加入抗波形蛋白抗體(Tebu Santa Cruz)，并在室溫下在1/200的稀釋度下培育2小時(shí)。用PBS清洗之后，以1/1000的稀釋度加入與標(biāo)記物Alexa Fluor?488結(jié)合的驢抗小鼠IgG抗體,并在室溫下培育I小時(shí)。最后用Fluoromount G(ElectronMicroscopy Science)將該部分封片并在顯微鏡(Nikon Eclipse80i, enlargement40x)下檢測(cè)。
[0088]結(jié)果/結(jié)論:
[0089]觀察到用SEQ ID N0.2的肽處理的老化的成纖維細(xì)胞比未處理的老化的成纖維細(xì)胞表達(dá)較少的波形蛋白。波形蛋白的增多和聚集與伴隨著老化跡象的細(xì)胞骨架的改變相關(guān)聯(lián)。因此，可總結(jié)為用本發(fā)明的SEQ ID N0.2的肽化合物進(jìn)行的處理使得可限制歸因于成纖維細(xì)胞的老化的波形蛋白的增多和聚集。
[0090]實(shí)施例2 =SEQ ID N0.4的肽對(duì)用甲基乙二醛體外致衰老的活組織模型的作用研究
[0091]通過用甲基乙二醛(MGO)處理的手段，人工使人皮膚的活組織體外衰老。為此，將穿刺的(des punch de) 6-mm的人皮膚穿刺活組織培育在特定培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的氣-液界面。然后用5mM或IOmM的MGO(Sigma)處理它們，MGO沉積在活組織表面和培養(yǎng)物培養(yǎng)基中。然后處理該活組織:
[0092]-條件1:20μ L 的 PBS1X，或
[0093]-條件2:20 μ L 的 1% 的 SEQ ID N0.4 的肽，或
[0094]-條件3:20 μ L 的 3% 的 SEQ ID N0.4 的肽。
[0095]將該活組織固定并包埋于石蠟中，然后使用切片機(jī)切成4-μ m的部分。在之前切割的部分上進(jìn)行蘇木精/伊紅(Hematoxyline/eosine) (H&E)免疫標(biāo)記并且通過顯微鏡觀測(cè)研究它們的形態(tài)和結(jié)構(gòu)(在顯微鏡Nikon Eclipse E600下，物鏡40x)。
[0096]結(jié)果/結(jié)論:`
[0097]在對(duì)照I條件下，即未加入肽，觀察到MGO引起皮膚活組織顯著的損傷，更確切地對(duì)其結(jié)構(gòu)的損傷。因?yàn)橛?0μΜ量的MGO觀察到更多的損傷，所以引起的損傷是劑量依賴性的。
[0098]當(dāng)用SEQ ID N0.4的肽化合物處理該活檢時(shí)，注意到在所述活檢的結(jié)構(gòu)上造成的損傷比對(duì)照條件下的要不明顯得多。所述肽的保護(hù)性效果是劑量依賴性的，用3%的劑量比1%的劑量觀察到的損傷更少。
[0099]因此可總結(jié)為，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受導(dǎo)致顯著損傷和過早衰老的應(yīng)激時(shí)，SEQ ID N0.4的肽對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有保護(hù)性效果。
[0100]實(shí)施例3:在用SEQ ID N0.2的狀處理的人成纖維細(xì)朐中通過siRNA研究TRF2蛋白的表達(dá)
[0101]為了量化在人成纖維細(xì)胞群體中本發(fā)明肽化合物對(duì)TRF2的過表達(dá)的功效，使用siRNA技術(shù)將編碼TRF2的基因“關(guān)閉”。
[0102]方案:
[0103]將成纖維細(xì)胞置于6孔平板的培養(yǎng)物中直至60%的鋪滿。通過在下文描述的以1%加入SEQ ID N0.2的肽更新培養(yǎng)物培養(yǎng)基。然后將100 μ L之前生產(chǎn)的最終包含IOnM TRF2的siRNA和轉(zhuǎn)染劑的混合物一次一滴并一次一孔地輕柔加入。在37°C和5%的CO2中培育該細(xì)胞培養(yǎng)物平板72小時(shí)。每兩天更新一次該培養(yǎng)物培養(yǎng)基。建立四個(gè)條件:
[0104]-條件1:對(duì)照,無siRNA和無活性劑
[0105]-條件2:用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，無活性劑
[0106]-條件3:未轉(zhuǎn)染但用活性劑處理的細(xì)胞[0107]-條件4:用siRNA轉(zhuǎn)染并用活性劑處理的細(xì)胞
[0108]通過用抗TRF2抗體并依照常規(guī)方案進(jìn)行的典型免疫轉(zhuǎn)移技術(shù)(Western印跡)觀察TRF2表達(dá)的量化。為了分析在已用siRNA轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中所述肽提供的補(bǔ)償作用，將與其中基因未被siRNA關(guān)閉的相對(duì)未處理的成纖維細(xì)胞進(jìn)行比較。
[0109]結(jié)果/結(jié)論:
[0110]條件I和3之間，可注意到相對(duì)于對(duì)照，肽的添加導(dǎo)致TRF2蛋白表達(dá)增加了 17%。條件I和2之間，清楚地表明siRNA對(duì)TRF2蛋白表達(dá)的作用:有效降低了 26%。但是添加活性劑至siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞使得能夠恢復(fù)TRF2表達(dá)，相對(duì)于對(duì)照條件siRNA的存在導(dǎo)致的減少不大于18%。 [0111]結(jié)論是根據(jù)本發(fā)明的活性劑使得能在經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞中補(bǔ)償TRF2蛋白表達(dá)的減少(由特定siRNA引起的減少)。
[0112]實(shí)施例4:抗老化面霜組合物
[0113]
【權(quán)利要求】
1.以下通式(I)的肽化合物:
R1 - (AA)n- X1-X2-X3- Lys - Lys - Gln - Lys - Trp -X4- (AA)p - R2
其中， X1代表天冬酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、或無氨基酸， X2代表異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、或無氨基酸， X3代表蘇氨酸、天冬酰胺，絲氨酸、或無氨基酸， X4代表絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或無氨基酸， AA代表任意氨基酸，η和P是0-2之間的整數(shù)， R1代表N端氨基酸的伯胺官能-NH2，其中兩個(gè)氫原子中的一個(gè)可被或不被以下基團(tuán)取代:乙?；愋偷娘柡突虿伙柡偷腃1至C3tl烷基鏈，或苯甲?；?、甲苯磺酰基、或芐氧基羰基類型的芳香族基團(tuán)， R2代表C端氨基酸的羧基官能的羥基-ΟΗ，其中氫原子可被或不被以下基團(tuán)取代=C1至C30烷基鏈，或nh2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y代表C1至C4烷基鏈， 所述通式(I)的序列由5至13個(gè)氨基酸殘基組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽化合物，特征在于η和P等于0，并且其中所述通式⑴的序列由5至9個(gè)氨基酸殘基組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽化合物，特征在于其對(duì)應(yīng)于下式之一:
(SEQ ID N0.1) Asn - Thr - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Thr - Asn - NH2
(SEQ ID N0.2)Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - NH2
(SEQ ID N0.3) Gly - Gly - Leu - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Asn - Leu - Tyr
(SEQ ID N0.4) Ala - Met - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - NH2
(SEQ ID N0.5) Ala - Leu - Ser - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Gln
(SEQ ID N0.6) Cys - Lys - Lys - Gln - Lys - Trp - Ser - NH2
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的一項(xiàng)所述的肽化合物，特征在于其溶于一種或多種生理適用的溶劑，所述生理適用的溶劑選自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環(huán)狀多醇、或這些溶劑的任何混合物。
5.化妝組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1至4中的一項(xiàng)所述的肽化合物，和化妝用可接受的介質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，特征在于其是適于局部施用的形式，所述適于局部施用的形式選自霜、水包油乳劑、或油包水或復(fù)合乳劑、溶液、懸液、微乳劑、水成的或無水的凝膠、血清或囊泡分散體、貼劑、噴劑、軟膏、潤發(fā)油、洗液、膠質(zhì)、奶、棒或粉。.
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合物，特征在于所述肽化合物以約0.1至500ppm之間的濃度存在于所述組合物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，特征在于所述肽化合物以約I至150ppm之間的濃度存在于所述組合物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中的任一項(xiàng)所述的組合物，特征在于其還含有至少一種其它活性成分，所述其它活性成分選自植物肽水解產(chǎn)物、其它肽化合物、防曬劑、抗自由基劑、或防皺劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中的一項(xiàng)所述的組合物的化妝用途，其用于預(yù)防和/或延緩和/或治療老化的皮膚跡象。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝用途，用于在皮膚細(xì)胞中調(diào)節(jié)端粒相關(guān)蛋白(TRF)的量和/或延緩衰老。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化妝用途，特征在于所述端粒相關(guān)蛋白由TRF2和/或POTl代表。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝用途，用于預(yù)防皮膚細(xì)胞中在損傷時(shí)DNA雙鏈斷裂的發(fā)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝用途，特征在于所述老化的皮膚跡象是:皺紋、深的和粗糙的紋，小皺紋、裂紋、皮膚和皮下組織的松弛、皮膚彈性和張力的損失、緊致性和色澤的損失、和皮膚萎縮。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝用途，用于預(yù)防和/或治療皮膚光老化的皮膚跡象。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝用途，用于保護(hù)皮膚免受外部應(yīng)激。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化妝用途，特征在于所述外部應(yīng)激是UV輻射或氧化應(yīng)激。
18.化妝治療方法，特征在于在早上和夜晚，在皮膚上施用包含有效量的權(quán)利要求1至4中的一項(xiàng)所定義的肽化合物的組合物，用以預(yù)防和/或治療老化的皮膚跡象。
19.化妝治療方 法，特征在于在皮膚上有規(guī)律地施用包含有效量的權(quán)利要求1至4中的一項(xiàng)所定義的肽化合物的組合物，用以限制端粒的降解而不改變端粒酶的量和/或活性。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103562219SQ201280026902
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月2日
【發(fā)明者】C·達(dá)爾法拉, N·東洛熱, J-M·博托 申請(qǐng)人:Isp投資公司