使活性多肽的結(jié)合親和力和結(jié)合特異性增強(qiáng)的蛋白質(zhì)骨架模塊的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性得到增強(qiáng)的新穎的蛋白質(zhì)骨架模塊，詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及下述蛋白質(zhì)骨架模塊和其制造方法，該蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含下述多肽：由序列編號(hào)1所示氨基酸序列的第1位～第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；包含活性多肽的多肽；和由序列編號(hào)1所示氨基酸序列的第29位～第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊使內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)，從而在疾病的診斷和治療中是有效的。
【專利說明】使活性多肽的結(jié)合親和力和結(jié)合特異性增強(qiáng)的蛋白質(zhì)骨架模塊
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)主張2011年04月18日提交的韓國專利申請(qǐng)第10-2011-0035613號(hào)的優(yōu)先權(quán)，上述說明書全體為本申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)。
[0002]本發(fā)明涉及使活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)的新型蛋白質(zhì)骨架模塊。更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及下述的蛋白質(zhì)骨架模塊及其制造方法，該蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含:由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；包含活性多肽的多肽；和由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
【背景技術(shù)】
[0003]若對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列的2級(jí)、3級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，則大部分蛋白質(zhì)由獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(或者模塊)構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上、功能上獨(dú)立的單元。同一結(jié)構(gòu)域在不同蛋白質(zhì)中有一個(gè)以上的分布，一個(gè)蛋白質(zhì)由不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域的具體信息可在Prosite (Hulo N 等，Nucleic Acids Res, 36:D245_249, 2008 ;網(wǎng)址:http://kr.expasy.0rg/prosite/), SMART(Letunic I 等，Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006 ;網(wǎng)址:http://smart, embl-heidelberg.de/)等生物信息學(xué)網(wǎng)站上查詢。
[0004]生物體分子間的相互作用(例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸等)在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、細(xì)胞間/內(nèi)的信號(hào)傳遞、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等各種生命現(xiàn)象的產(chǎn)生中具有重要功能。作為現(xiàn)有的與目標(biāo)分子特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)生物學(xué)活性的分子，主要開發(fā)了抗體(全長(zhǎng)或片段)。但是，抗體的問 題在于其具有下述多種問題:其表達(dá)量少，溶解度低，必須要使用動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞株，精制費(fèi)用高，在還原性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定性降低等。因此，迫切需要開發(fā)出可克服抗體的問題同時(shí)還具有抗體這樣的與目標(biāo)分子(targeted molecules)特異性結(jié)合的特性的抗體以外的蛋白質(zhì)。
[0005]為了在癌癥或動(dòng)脈硬化的診斷和治療中進(jìn)行使用，利用噬菌體展示等方法發(fā)掘出的肽具有低結(jié)合力、非穩(wěn)定性、高免疫性等限制。有必要開發(fā)出可克服這樣的問題、提高活性肽在人體內(nèi)的結(jié)合力與穩(wěn)定性、同時(shí)降低免疫性的新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)課題
[0007]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在選擇人體來源的蛋白質(zhì)中的一部分進(jìn)行最佳變形、插入活性肽的情況下，顯示出了可使活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)等可代替現(xiàn)有肽制劑和抗體制劑的優(yōu)異的性質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明的其他目的在于提供一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:
[0009]a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；[0010]b)包含活性多肽的多肽；以及
[0011]c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0012]本發(fā)明的其他目的在于提供一種多聚核苷酸，其編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0013]本發(fā)明的其他目的在于提供一種表達(dá)載體，其包含上述多聚核苷酸。
[0014]本發(fā)明的其他目的在于提供一種宿主細(xì)胞，其經(jīng)上述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
[0015]本發(fā)明的其他目的在于提供一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的制造方法，其包括對(duì)上述宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0016]本發(fā)明的其他目的在于提供一種診斷用組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0017]本發(fā)明的其他目的在于提供一種診斷方法，其包括將上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0018]本發(fā)明的其他目的在于提供上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造診斷用制劑。
[0019]本發(fā)明的其他目的在于提供一種藥物組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0020]本發(fā)明的其他目的在于提供一種診斷用試劑盒，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0021]本發(fā)明的其他目的在于提供一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:
[0022]a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0023]b)包含序列編號(hào)3所示的AP-1 (激活蛋白(activator protein) I)的氨基酸序列的多肽；以及
[0024]c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0025]本發(fā)明的其他目的在于提供一種多聚核苷酸，其編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0026]本發(fā)明的其他目的在于提供一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0027]本發(fā)明的其他目的在于提供一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷方法，其包括將上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0028]本發(fā)明的其他目的在于提供上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用制劑。
[0029]本發(fā)明的其他目的在于提供一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用試劑盒，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0030]技術(shù)的解決方法
[0031]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供了一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:
[0032]a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0033]b)包含活性多肽的多肽；以及[0034]c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0035]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種多聚核苷酸，其編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0036]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含上述多聚核苷酸。
[0037]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其經(jīng)上述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
[0038]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的制造方法，其包括對(duì)上述宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0039]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種診斷用組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0040]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種診斷方法，其包括將上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0041]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造診斷用制劑。
[0042]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架 模塊作為有效成分。
[0043]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種診斷用試劑盒，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0044]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:
[0045]a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0046]b)包含序列編號(hào)3所示的AP-1 (激活蛋白I)的氨基酸序列的多肽；以及
[0047]c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0048]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種多聚核苷酸，其編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0049]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用組合物，其包含上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0050]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷方法，其包括將上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0051]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用制劑。
[0052]為了達(dá)成本發(fā)明的其他目的，本發(fā)明提供了一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用試劑盒，其包含內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0053]以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0054]本發(fā)明提供了內(nèi)置有(包含有)活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊和編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊(蛋白支架(protein scaffold),模塊化蛋白支架(modularizedprotein scaffold))的多聚核苷酸,該內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；b)包含活性多肽的多肽；以及c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0055]本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊具有使所內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)的特征。
[0056]活性多肽是指通過與對(duì)象蛋白質(zhì)的接觸而發(fā)揮出信號(hào)傳遞、對(duì)象蛋白質(zhì)的活化(activation)、失活(deactivation)、磷酸化(phosphorylation)等各種作用的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊通過使內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增加的方法來增加活性多肽的活性。
[0057]結(jié)合親和力(binding affinity)是指使生物體分子間結(jié)合的性質(zhì)的強(qiáng)度。
[0058]結(jié)合特異性(binding specificity)是指特定生物體分子僅與結(jié)合對(duì)象分子特異性結(jié)合的性質(zhì)。
[0059]本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊意味著不會(huì)對(duì)生物體內(nèi)免疫體系帶來影響、可內(nèi)置活性多肽的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)體。本發(fā)明蛋白質(zhì)骨架模塊的分子量小、生物體內(nèi)活性優(yōu)異，不會(huì)對(duì)內(nèi)置的活性多肽的活性帶來影響、不會(huì)對(duì)生物體內(nèi)免疫體系帶來影響，來自在生物體內(nèi)豐富存在的蛋白質(zhì)，不會(huì)產(chǎn)生個(gè)體間效果的差異或產(chǎn)生個(gè)體特異性效果。本發(fā)明人首先開發(fā)出了內(nèi)置活性多肽且使活性多肽的穩(wěn)定性和特性提高的蛋白質(zhì)骨架模塊，將其命名為DMID (Designed modular Tmmuno Diagnostics,免疫診斷設(shè)計(jì)模塊)。
[0060]本發(fā)明的活性多肽可具有藥理活性，內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊可通過活性多肽的作用顯示出內(nèi)在的藥理活性。內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊還具有活性多肽的藥理活性、特別具有效果得到增強(qiáng)的藥理活性。
[0061]本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨 架模塊優(yōu)選可基于穩(wěn)定素(stabilin)-2來源的多肽片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，更優(yōu)選為在序列編號(hào)I所示的氨基酸序列中在不會(huì)對(duì)骨架帶來影響的部分進(jìn)行活性多肽的取代或插入而成的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0062]本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的蛋白質(zhì)骨架模塊是基于在人體中豐富存在的穩(wěn)定素-2來源的多肽片段而設(shè)計(jì)的。穩(wěn)定素-2與利用跨膜受體的淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)、細(xì)胞附著、受體清除、血管生成相關(guān)。該蛋白質(zhì)具有7個(gè)成束蛋白(fasciclin)結(jié)構(gòu)域、16個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor) (EGF)樣結(jié)構(gòu)域、2 個(gè)層粘蛋白(Iaminin)型 EGF 樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)C型凝集素(lectin)樣透明質(zhì)燒(hyaluronan)結(jié)合樣模塊等多種結(jié)構(gòu)域。
[0063]另一方面，本發(fā)明提供編碼上述蛋白質(zhì)骨架模塊的多聚核苷酸。
[0064]本發(fā)明的多聚核苷酸具有的特征是，對(duì)使活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)的蛋白質(zhì)骨架模塊進(jìn)行編碼。
[0065]本發(fā)明的多聚核苷酸意味著編碼下述蛋白質(zhì)骨架模塊的物質(zhì)，該蛋白質(zhì)骨架模塊具有序列編號(hào)I所表示的氨基酸序列、或具有與上述氨基酸序列具有至少70%以上同源性(homology)的氨基酸序列，上述多聚核苷酸為DNA或RNA，優(yōu)選為序列編號(hào)2所表示的DNA。
[0066]本發(fā)明的特征在于提供插入有上述本發(fā)明的多聚核苷酸的表達(dá)載體。
[0067]上述表達(dá)載體意味著如下制造的表達(dá)載體:本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域已知的任意方法將本發(fā)明的多聚核苷酸插入到載體中，利用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/解碼調(diào)節(jié)序列表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊，由此制造出該表達(dá)載體。
[0068]本發(fā)明的“表達(dá)載體”意味著能夠插入或?qū)刖幋a本發(fā)明蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列的本領(lǐng)域已知的質(zhì)粒、病毒或其他介質(zhì)。本發(fā)明的多聚核苷酸序列與表達(dá)調(diào)節(jié)序列能夠可操縱地聯(lián)接，上述可操縱聯(lián)接的基因序列與表達(dá)調(diào)節(jié)序列可同時(shí)含有選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)(replication origin)、并包含在一個(gè)表達(dá)載體內(nèi)。“可操縱聯(lián)接(operably linked)”是指適當(dāng)?shù)姆肿优c表達(dá)調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)，以能夠進(jìn)行基因表達(dá)的方式聯(lián)接而成的基因和表達(dá)調(diào)節(jié)序列?！氨磉_(dá)調(diào)節(jié)序列(expression control sequence) ”意味著利用特定的宿主細(xì)胞可操縱地聯(lián)接而成的用于調(diào)節(jié)多聚核苷酸序列表達(dá)的DNA序列。這樣的調(diào)節(jié)序列包括:用于實(shí)施轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的任意的操縱序列、編碼適宜的mRNA核糖體結(jié)合部位的序列和用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和解碼(解読)的終結(jié)的序列。
[0069]能夠插入編碼上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊的多聚核苷酸的表達(dá)載體有大腸桿菌來源的質(zhì)粒(pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pET30a、pET30c 和 pGEX-GST)、枯草桿菌來源的質(zhì)粒(PUB110和pTP5)、酵母來源的質(zhì)粒(ΥΕρ13、ΥΕρ24和YCp50)和Ti質(zhì)粒等，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或痘苗病毒之類的動(dòng)物病毒、桿狀病毒之類的昆蟲病毒和植物病毒，可以使用pPZP、PGA和pCAMBIA系之類的雙元載體。只要為本領(lǐng)域技術(shù)人員即可選擇適于導(dǎo)入本發(fā)明多聚核苷酸序列的載體，在本發(fā)明中，只要是能夠?qū)⒈景l(fā)明的多聚核苷酸序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)的載體，任意載體均可使用。但是，可優(yōu)選使用按照容易誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)和容易分離出所表達(dá)的蛋白質(zhì)的方式而設(shè)計(jì)出的載體，更可優(yōu)選使用作為含有本發(fā)明多聚核苷酸的重組載體的pET32a載體。
[0070]本發(fā)明提供經(jīng)上述本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0071]上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域中公知的方法利用本發(fā)明的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的微生物，上述微生物沒有限定，優(yōu)選為大腸桿菌(E.coli)，最優(yōu)選為大腸桿菌BL21或大腸桿菌MC1061。
[0072]上述本發(fā)明 中將重組載體導(dǎo)入至宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法沒有限定，可以使用氯化鈣(CaCl2)和熱休克(heat shock)方法、粒子槍轟擊法(particle gun bobardment)、碳化娃晶須(Silicon carbire whiskers)、超聲波處理(sonication)、電穿孔法(electroporation)和基于 PEG(Polyethlenglycol)的沉淀法等。
[0073]可有效利用多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明蛋白質(zhì)骨架模塊的表達(dá)。這樣的宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)意味著:在生成目的編碼序列后可進(jìn)行精制的載體；以及利用適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可在發(fā)生部位原位(in situ)表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊的細(xì)胞。這樣的系統(tǒng)并不限定于此，包括微生物，例如:經(jīng)含有本發(fā)明蛋白質(zhì)骨架模塊編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如E.coli以及B.subtilis);經(jīng)含有蛋白質(zhì)骨架模塊編碼序列的重組酵母表達(dá)載體進(jìn)行了感染的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia));經(jīng)含有蛋白質(zhì)骨架模塊編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)進(jìn)行了感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；經(jīng)含有蛋白質(zhì)骨架模塊編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化、或經(jīng)重組表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒、CaMV ;煙草花葉病毒、TMV)進(jìn)行了感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或保有含有來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如來自腺病毒的啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如 COS、CH0、BHK,293, NSO 和 3T3 細(xì)胞)。
[0074]本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊具有使內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)的特征，這樣的活性多肽的內(nèi)置可通過將編碼活性多肽的多聚核苷酸插入到編碼內(nèi)置在上述蛋白質(zhì)骨架模塊中的活性多肽的多聚核苷酸的特定部位并進(jìn)行表達(dá)的方法來進(jìn)行。
[0075]本發(fā)明提供一種表達(dá)載體及利用上述表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有編碼上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的多聚核苷酸。
[0076]上述表達(dá)載體和宿主細(xì)胞如上所述。
[0077]上述宿主細(xì)胞優(yōu)選為E.coli。
[0078]另外，本發(fā)明提供內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的制造方法，其包括對(duì)上述宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
[0079]根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠有效地生產(chǎn)結(jié)合親和力或結(jié)合特異性得到了增強(qiáng)的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
[0080]對(duì)于利用本發(fā)明的方法制造出的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，為了進(jìn)行蛋白質(zhì)精制，可利用本領(lǐng)域中公知的任意方法、例如色譜法(例如金屬-螯合物色譜、離子交換、親和色譜和尺寸排阻柱色譜法)、離心分離、差示溶解度法或用于進(jìn)行蛋白質(zhì)精制的任意其他標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行精制。
[0081]本發(fā)明的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性得到了增強(qiáng)的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊中，與單獨(dú)活性多肽時(shí)相比，針對(duì)靶物質(zhì)的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增高。
[0082]另一方面，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中，可追加在公知的檢出方法中使用的標(biāo)記物質(zhì)等進(jìn)行附著。
[0083]在本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中，可追加對(duì)于活性多肽的結(jié)合對(duì)象靶位有效的物質(zhì)等進(jìn)行附著。
[0084]例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中可追加聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、抗體Fe域、IgG分子、細(xì)胞毒性藥物、放射性同位元素、造影劑、His-Tag、生物素、Flag-Tag、核酸或細(xì)胞因子等進(jìn)行附著。
[0085]本發(fā)明提供含有上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分的診斷用組合物。
[0086]本發(fā)明提供一種診斷方法，其包括將上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0087]本發(fā)明提供第I項(xiàng)的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造診斷用制劑。
[0088]本發(fā)明中的“有效量”意味著本發(fā)明的組合物或制劑在作為給藥對(duì)象的個(gè)體內(nèi)顯示出可診斷疾病、或可對(duì)診斷提供必要信息的效果的量，上述“個(gè)體”為動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，特別為包括人的動(dòng)物，是動(dòng)物來源的細(xì)胞、組織、器官等。上述個(gè)體為需要進(jìn)行診斷的患者。
[0089]本發(fā)明的組合物可以具有下述組成,該組成中包括0.001重量％~99.999重量％上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊和余量的載體。
[0090]本發(fā)明的診斷用組合物的特征在于，其含有本發(fā)明的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
[0091]本發(fā)明的診斷意味著能夠發(fā)現(xiàn)活性多肽的靶物質(zhì)的有無、分布、量等，并基于此對(duì)于相關(guān)疾病的有無、進(jìn)展?fàn)顟B(tài)進(jìn)行判斷。[0092]例如，IL-4受體在人類的多種癌癥(大腸癌、肺癌、子宮癌和乳腺癌)中過表達(dá)。在本發(fā)明的內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的情況下，由于其與IL-4受體具有結(jié)合力，因而能夠在上述癌癥的診斷和治療中應(yīng)用。
[0093]對(duì)于是否有蛋白質(zhì)的存在以及其量和/或模式進(jìn)行測(cè)定的方法有=Western印跡法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法，enzyme linked immunosorbent assay)、放射線免疫分析法(Radioimmunoassay)、放射免疫擴(kuò)散法(radioimmunodiffusion)、奧克特洛尼(Ouchterlony)免疫擴(kuò)散法、火箭(rocket)免疫電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、補(bǔ)體結(jié)合分析法(Complement Fixation Assay)、FACS (突光活化細(xì)胞分類)、蛋白質(zhì)芯片(protein chip)等,但并不限定于此。
[0094]為了進(jìn)行上述的是否有蛋白質(zhì)的存在以及其量和/或模式的測(cè)定，通?？赏ㄟ^對(duì)于與2次抗體相連的檢測(cè)標(biāo)記(detection label)的信號(hào)強(qiáng)度和模式進(jìn)行檢測(cè)來測(cè)定。
[0095]這樣的檢測(cè)標(biāo)記可以舉出酶、熒光物、配位體、發(fā)光物、微粒、氧化還原分子、放射線同位素等為例，但不必限定于此。作為檢測(cè)標(biāo)記使用酶的情況下，能夠利用的酶有:β -葡萄糖醛酸酶、β -D-葡萄糖苷酶、β -D-半乳糖苷酶、尿素酶、過氧化酶或堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶以及GDPaSe、RNaSe、葡萄糖氧化酶、熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、β -內(nèi)酰胺酶等，但并不限定于此。
[0096]作為檢測(cè)標(biāo)記使用熒光物的情況下，能夠利用的熒光物有:熒光素、異硫氰酸酯、若丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛、熒光胺等，但并不限定于此。作為檢測(cè)標(biāo)記使用配位體的情況下，能夠利用的配位體有生物素衍生物等，但并不限定于此。作為檢測(cè)標(biāo)記使用發(fā)光物的情況下，能夠利用的發(fā)光物有吖啶酯、熒光素、熒光素酶等，但并不限定于此。作為檢測(cè)標(biāo)記使用微粒的情況下，能夠利用的微粒有膠體金、著色乳液等，但并不限定于此。
[0097]作為檢測(cè)標(biāo)記使用氧化還原分子的情況下，能夠利用的氧化還原分子有二茂鐵、釕絡(luò)合物、紫精、醌、Ti離子、Cs離子、二酰亞胺、1，4-苯醌、對(duì)苯二酚、K4W(CN)8,[0s(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、[MO(CN)8]4—等，但并不限定于此。
[0098]作為檢測(cè)標(biāo)記使用放射性同位素的情況下，能夠利用的放射性同位素有3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1251、1311、或 186Re 等，但并不限定于此。
[0099]本發(fā)明的診斷用組合物能夠發(fā)現(xiàn)活性多肽的靶物質(zhì)的有無、分布、量等，可提供能夠?qū)εc此相關(guān)的疾病的有無、進(jìn)展?fàn)顟B(tài)進(jìn)行判斷的信息。與包括未內(nèi)置在本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中的活性多肽的診斷用組合物相比，本發(fā)明組合物的診斷靈敏度、精度、準(zhǔn)確度優(yōu)異，診斷能力優(yōu)異。
[0100]本發(fā)明提供含有上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分的診斷用試劑盒。
[0101]上述診斷用試劑盒可以進(jìn)一步包括支持體、適當(dāng)?shù)木彌_溶液、利用顯色酶或熒光物質(zhì)標(biāo)記的2次抗體、顯色底物液等。上述支持體為硝酸纖維素膜、利用聚乙烯樹脂合成的96孔微板(96well plate)、利用聚苯乙烯樹脂合成的96孔微板、或由玻璃制得的蓋片玻璃等，上述顯色酶為過氧化物酶(peroxidase)、或堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)等，上述熒光物質(zhì)為FITC、或RITC等，上述顯色底物液為ABTS (2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-橫酸，Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))、OPD (鄰苯二胺，o-PhenyIenediamine)、或 TMB (四甲基聯(lián)苯胺，Tetramethyl Benzidine)等。
[0102]本發(fā)明提供含有上述內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分的藥物組合物。
[0103]本發(fā)明的藥物組合物可以輸送對(duì)活性多肽的結(jié)合靶位有效的治療物質(zhì)、細(xì)胞毒性藥物等。
[0104]藥物組合物中，根據(jù)活性多肽種類的不同，其對(duì)象疾病不同。例如，在本發(fā)明的以內(nèi)置有作為活性多肽的AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊為有效成分的藥物組合物的情況下，通過與在人類的多種癌癥(大腸癌、肺癌、子宮癌和乳腺癌)中過表達(dá)的IL-4受體結(jié)合，能夠運(yùn)輸以其為靶位的治療物質(zhì)或細(xì)胞毒性藥物等。
[0105]本發(fā)明提供一種內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊以及編碼上述內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的多聚核苷酸，該內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽:
[0106]a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0107]b)包含序列編號(hào)3所示的AP-1 (激活蛋白I)的氨基酸序列的多肽；以及
[0108]c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0109]上述多聚核苷酸優(yōu)選為選自由序列編號(hào)4~序列編號(hào)6組成的組中的任意I種。
[0110]活性多肽意味著 通過與對(duì)象蛋白質(zhì)的接觸而發(fā)揮出信號(hào)傳遞、對(duì)象蛋白質(zhì)的活化(activation)、失活(deactivation)、磷酸化(phosphorylation)等各種作用的多肽。由于AP-1具有與細(xì)胞因子IL-4受體結(jié)合的氨基酸序列，因而其自身與IL-4受體具有結(jié)合力。已知IL-4受體在人類的多種癌癥(大腸癌、肺癌、子宮癌和乳腺癌)中過表達(dá)，因而與IL-4受體選擇性結(jié)合的活性多肽的開發(fā)可在癌癥的診斷和治療中應(yīng)用。由于IL-4發(fā)揮出利用增加細(xì)胞附著的細(xì)胞因子來誘發(fā)動(dòng)脈硬化的作用，因而AP-1肽可開發(fā)成動(dòng)脈硬化的診斷和治療劑。
[0111]本發(fā)明提供含有以內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分的癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用組合物、以及含有以內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分的癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用試劑盒。
[0112]本發(fā)明提供一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷方法，其包括將內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
[0113]本發(fā)明提供內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用制劑。
[0114]對(duì)于上述癌癥，只要是隨著其發(fā)生、進(jìn)展、退化或消失會(huì)使帶有AP-1具有親和性的結(jié)構(gòu)的生物體物質(zhì)的水平發(fā)生變化的癌，即可為任意癌癥，優(yōu)選為大腸癌、肺癌、子宮癌或乳腺癌。
[0115]本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊、或者可追加含有2種以上的藥學(xué)上容許的載體、賦形劑或稀釋劑。藥學(xué)上容許的載體中，例如可追加含有口服給藥用載體或非口服給藥用載體。口服給藥用載體可以包含乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等?？梢园陔闹苿┑目诜o藥中使用的各種藥物傳遞物質(zhì)。進(jìn)一步地，非口服給藥用載體可以包含水、適宜的油、食鹽水、水性葡萄糖等，可以追加含有穩(wěn)定化劑和保存劑。適宜的穩(wěn)定化劑有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸之類的抗氧化劑。適宜的保存劑有苯扎氯銨、羥苯甲酯或羥苯丙酯和氯丁醇。其他藥學(xué)上容許的載體可參考下述文獻(xiàn)中的記載(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA, 1995)。
[0116]本發(fā)明的組合物可通過任意方法對(duì)以人為代表的哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥。例如，可進(jìn)行口服給藥或非口服給藥。非口服的給藥方法沒有限定，可進(jìn)行靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、隔膜內(nèi)、心臟內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹腔內(nèi)、鼻腔內(nèi)、腸管、局部、舌下或直腸內(nèi)給藥。
[0117]本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)如上所述的給藥途徑進(jìn)行口服給藥用或非口服給藥用制劑的制劑化。
[0118]在口服給藥用制劑的情況下，本發(fā)明的組合物可利用本領(lǐng)域公知的方法制劑化成粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣片劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿、漿料劑、懸浮液等。例如，對(duì)于口服用制劑，可將活性成分與固體賦形劑混配，將其粉碎，添加適宜的輔助劑，以顆粒混合物的形式進(jìn)行加工，從而得到片劑或糖衣片劑。適宜的賦形劑的示例包括:包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、紅蘚醇和麥芽糖醇等的糖類以及包括玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉和馬鈴薯淀粉等的淀粉類；包括纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素等的纖維素類；明膠、聚乙烯吡咯烷酮等之類的填充劑。進(jìn)一步地，根據(jù)情況可添加交聯(lián)接合聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或海藻酸鈉等作為崩解劑。本發(fā)明的藥物組合物可以追加含有抗凝聚劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、香料、乳化劑和防腐劑等。
[0119]在非口服給藥用制劑的情況下，可利用本領(lǐng)域公知的方法制劑化成注射劑、乳膏劑、洗劑、外用軟膏劑、油劑、保濕劑、凝膠劑、氣溶膠和鼻腔吸入劑的形態(tài)。這些劑型全部以制藥化學(xué)中通常公知的處方的形式記載在文獻(xiàn)(Remington’s PharmaceuticalScience, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvanial8042, Chapter87:Blaug, Seymour)中。
[0120]本發(fā)明組合物的蛋白質(zhì)骨架模塊的總有效量可以以單劑量(single dose)對(duì)患者進(jìn)行給藥，也可以利用通過多劑量(multiple dose)長(zhǎng)期給藥的分次治療方法(fractionated treatment protocol)進(jìn)行給藥。本發(fā)明的藥物組合物中，可根據(jù)疾病程度的不同使有效成分的含量不同。優(yōu)選的是，本發(fā)明組合物的蛋白質(zhì)骨架模塊的用量為每I天每Ikg患者體重為約0.01ug~1，OOOrng、最優(yōu)選為0.1ug~100mg。但是,對(duì)于上述蛋白質(zhì)骨架模塊的用量，不僅要考慮藥物組合物的給藥途徑和治療次數(shù)，而且要考慮患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、疾病的嚴(yán)重程度、飲食和排泄率等各種要因等來確定對(duì)于患者的有效給藥量，因而考慮到這些方面，只要為具有本領(lǐng)域常規(guī)知識(shí)的人，即可根據(jù)特定用途確定上述蛋白質(zhì)骨架模塊的適當(dāng)?shù)挠行Ыo藥量。本發(fā)明的藥物組合物只要可表現(xiàn)出本發(fā)明的效果即可，對(duì)其劑型、給藥途徑和給藥方法沒有特別限制。
[0121]本發(fā)明的這樣的效果在本發(fā)明說明書的實(shí)施例中示出。
[0122]本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)于多種模塊結(jié)構(gòu)域中的親和力高、分子量和免疫原性低、在人體豐富存在、能夠進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)檢證的模塊結(jié)構(gòu)域進(jìn)行篩選，選擇出最佳結(jié)構(gòu)域即穩(wěn)定素(Stamiin)-2的EGFL結(jié)構(gòu)域。對(duì)所選擇的序列進(jìn)行三維模型化，利用電腦模擬(insilico)誘發(fā)突變,確立最佳模型。
[0123]在本發(fā)明另一實(shí)施例中，制作對(duì)所選擇的蛋白質(zhì)骨架模塊進(jìn)行編碼的多聚核苷酸序列，將其導(dǎo)入到能夠進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體中，利用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)轉(zhuǎn)化后的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，使本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊進(jìn)行表達(dá)，之后對(duì)其進(jìn)行提取精制。
[0124]在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，利用表面等離子共振分析對(duì)于本發(fā)明的內(nèi)置有作為活性多肽的AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。由測(cè)定結(jié)果確認(rèn)到，在AP-1內(nèi)置于本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中的情況下，親和力比未內(nèi)置的單獨(dú)AP-1肽(naked AP-1)高174 倍。
[0125]在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，對(duì)于活性多肽由本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊所致的檢測(cè)靈敏度的變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果確認(rèn)到，在AP-1內(nèi)置于本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中的情況下，對(duì)IL-4活性的抑制為未內(nèi)置的單獨(dú)AP-1肽的10倍以上。
[0126]在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，對(duì)于本發(fā)明的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊所致的診斷靈敏度進(jìn)行測(cè)定。由細(xì)胞成像(Cellular imaging)或動(dòng)物成像(Animal imaging)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)到，在AP-1內(nèi)置于本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊中的情況下，腫瘤靶向性功能高于未內(nèi)置的單獨(dú)AP-1肽。
[0127]發(fā)明的效果
[0128]如以上所說明，本發(fā)明涉及活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性得到增強(qiáng)的新穎的蛋白質(zhì)骨架模塊，詳細(xì)地說，本發(fā)明提供下述蛋白質(zhì)骨架模塊和其制造方法，該蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含下述多肽:由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；包含活性多肽的多肽；和由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊使內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)，從而在疾病的診斷和治療中是有效的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0129]圖1為穩(wěn)定素-2結(jié)構(gòu)域序列的示意圖以及本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊與內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的三 維模型結(jié)果照片。
[0130]圖2為表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果的曲線圖(DMID AP-1:本發(fā)明的內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊JiAP-1:未結(jié)合蛋白質(zhì)骨架模塊的AP-1肽！Negative control:陰性對(duì)照組)。
[0131]圖3為對(duì)由表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定出的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行比較的曲線圖(本體(anthentic)對(duì)照:IL_4的結(jié)合常數(shù)；肽對(duì)照:未結(jié)合蛋白質(zhì)骨架模塊的AP-1肽的結(jié)合常數(shù)；包埋肽DMID:本發(fā)明的內(nèi)置有AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的結(jié)合常數(shù))。
[0132]圖4為對(duì)內(nèi)置有AP-1的本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊對(duì)于IL-4受體的信號(hào)傳遞抑制效果進(jìn)行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的照片(IL4:白細(xì)胞介素4;AP1:未與蛋白質(zhì)骨架模塊結(jié)合的API ；AP1-DIMID:結(jié)合了蛋白質(zhì)骨架模塊的API ；STAT6:STAT6的水平；pSTAT6:磷酸化的STAT6的水平)。
[0133]圖5為對(duì)內(nèi)置有AP-1的本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊的檢測(cè)能力的提高進(jìn)行測(cè)定的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果的照片(DAP1:利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞核染色得到的照片；FITC:利用異硫氰酸熒光素對(duì)蛋白質(zhì)骨架模塊進(jìn)行標(biāo)記得到的照片；MERGE:將DAPl和FITC照片合在一起得到的圖像；AP1-DMID-FITC:結(jié)合了 FITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)骨架模塊的API ；APl-FITC =FITCT標(biāo)記的AP-1 ;對(duì)照DMID-FITC:未內(nèi)置AP-1的FITC標(biāo)記蛋白質(zhì)骨架模塊，為對(duì)NSSSVDK序列的肽進(jìn)行FITC標(biāo)記的對(duì)照肽)。
[0134]圖6為對(duì)內(nèi)置有AP-1的本發(fā)明蛋白質(zhì)骨架模塊的檢測(cè)能力的提高進(jìn)行測(cè)定的動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果的照片(支架(Scafold)對(duì)照:注入了未內(nèi)置AP-1的蛋白質(zhì)骨架模塊的小鼠；AP-1肽:注入了 AP-1肽的小鼠；DMID P-1:注入了 DMID AP-1的小鼠)。
【具體實(shí)施方式】
[0135]下面通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0136]其中，下述實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例，本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于下述實(shí)施例。
[0137]實(shí)施例1.[0138]DMID (免疫診斷設(shè)計(jì)模塊)互補(bǔ)組篩選和模型化
[0139]1-1.篩選
[0140]對(duì)于在人表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)大量存在的模塊結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)人基因數(shù)據(jù)庫比較分析的后基因組篩選，從而選定20個(gè)互補(bǔ)組，之后以a)高親和力、b)低分子量、c)低免疫原性(low immunogenicity)、d)在人體豐富存在、以及e)能夠進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)檢證的條件為基準(zhǔn)，選擇EGFL (EGF樣)結(jié)構(gòu)域。
[0141]EGFL為在多種血漿蛋白質(zhì)中存在的由40個(gè)氨基酸構(gòu)成的模塊，具有低分子、高安全性、低免疫性的特性。其為由2個(gè)beta-片層(beta-sheet)和3個(gè)二硫鍵構(gòu)成的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，其能夠進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)檢證，存在有不會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)帶來影響的loop，容易插入活性多肽，因而適宜作為DMID互補(bǔ)。
[0142]1-2.三維模型化
[0143]為了進(jìn)行EGFL結(jié)構(gòu)域的三維模型化，使用BLAST與AlignMaster程序。人EGFL結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)由Protein DataBank提供。
[0144]理論基準(zhǔn)的突變和二維模型化利用nnPredic ((www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html)和 jppred(http://www.copmbi0.dundee.ac.uk/ ~www-jpred/submit,html)來進(jìn)行。理論基準(zhǔn)的三維模型化(Knowledge based3_dimensional models)由Swiss Model (http://www.expasy.ch/)提供，此外在 in silico 突變誘發(fā)后利用 Chimera/Modeller6檢證。最后對(duì)DMID模型利用PyMOL分析,進(jìn)行可視化。
[0145]實(shí)施例2.[0146]重組DMID-APl表達(dá)和精制
[0147]2-1.轉(zhuǎn)化菌株制作-DMID-Sal1-HindIII盒的制作
[0148]為了制作本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊(DMID)，將穩(wěn)定素2蛋白質(zhì)所存在的EGFL結(jié)構(gòu)域(4621-4869)克隆到作為E_coli表達(dá)載體的pET32a(Novagen)的BamHl與Xhol位點(diǎn)，制造表達(dá)蛋白質(zhì)。將EGFL結(jié)構(gòu)域的GCTGAC (4639-4644)基因變異為GTCGAC來制造限制酶Sall位點(diǎn)，將AAAGCA(4703-4708)變異為AAGCTT來制造限制酶HindIII位點(diǎn)，制造能夠插入活性多肽的DMID-Sall-HindIII盒。
[0149]2-2.轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)
[0150]將轉(zhuǎn)化后的Origami菌株在含有50ug/ml氨節(jié)青霉素與25ug/ml卡那霉素的20ml的磷酸胰蛋白胨(TP)培養(yǎng)基(2%細(xì)菌用胰蛋白胨，0.2%Na2HP04,0.1%KH2P04,0.8%NaCl, 1.5%酵母提取液，以及0.2%葡萄糖)中培養(yǎng)一夜。[0151]將培養(yǎng)液以4000 Xg進(jìn)行5分鐘離心分離，回收沉淀物，利用含有50ug/ml氨芐青霉素的同體積TP進(jìn)行再懸浮。將其利用TP培養(yǎng)基稀釋至100倍，在37°C進(jìn)行培養(yǎng)，直至0D600值為0.5。將培養(yǎng)終止的培養(yǎng)液冷卻至20°C后，利用0.2mM的IPTG (Isopropy1-β -D-thiogalactoside)進(jìn)行12小時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)，之后回收培養(yǎng)細(xì)胞，保存在_80°C直至進(jìn)行使用時(shí)為止。
[0152]2-3.蛋白質(zhì)提取和分離精制
[0153]將上述保存的細(xì)胞再懸浮在IOml含有ImM PMSF、0.5mM DTT的2XPBS中，在負(fù)載率(Duty cycle):30%、輸出:2.5、5分鐘的條件下進(jìn)行超聲波粉碎。將粉碎的細(xì)胞在15，OOOg進(jìn)行10分鐘離心分離，采集上清液。
[0154]將回收的上清液按照制造商的操作規(guī)范裝在經(jīng)2XPBS緩沖液平衡后的N1-NTN柱(amersham pharmacia biotech AB, Vt=0.5ml)中進(jìn)行上樣。對(duì)于帶有 6 (his) tag 的 DMID,使柱帶有含有30mM咪唑的2XPBS，利用含有30mM咪唑的2 XPBS對(duì)柱進(jìn)行水洗(柱體積的10倍)，之后利用含有250mM咪唑的2XPBS緩沖液(洗脫緩沖液)對(duì)柱進(jìn)行蛋白質(zhì)回收。
[0155]實(shí)施例3.[0156]重組DMID-APl結(jié)合能力提高檢證-表面等離子共振分析
[0157]為了研究本發(fā)明的內(nèi)置有APl的蛋白質(zhì)骨架模塊(DMID-APl)的結(jié)合能力，使用Biacore2000，利用表面等離子共振分析法對(duì)于未內(nèi)置的單獨(dú)APl與DMID-APl的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行測(cè)定。將利用昆蟲細(xì)胞(SF21)表達(dá)和精制的人IL-4受體的胞外域(IL-4Ra)利用HBR緩沖液(IOmM HEPES, pH7.4 ；150mM NaCl ；3.4mM EDTA ;以及 0.005% 表面活性劑 P20)稀釋后，在Biacore CM5chip表面按照制造商的方法進(jìn)行包被(2500RU)。使利用同一緩沖液稀釋的AP-1肽或DMID-APl流過(50ul/min),測(cè)定RU值的變化,之后使用Biaevaluation2.0程序求出結(jié)合常數(shù)。
[0158]如圖2和圖3所示進(jìn)行了表面等離子共振分析，結(jié)果確認(rèn)到，與未內(nèi)置的單獨(dú)肽相t匕，包埋肽DMID顯示出了高174倍的親和力。
[0159]實(shí)施例4.[0160]重組DMID-API檢測(cè)能力提高檢證I一基于IL_4的IL_4受體的活性抑制度的測(cè)定
[0161]將5XIO5 的 THPl(NIH AIDS Research and Reagent Program, NCI9949)細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，之后利用100ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristatel3-acetate) (PMA) (Sigma, P8139-1MG)進(jìn)行 3 天處理使其活化。在無血清條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)后，同時(shí)進(jìn)行0.67ηΜ(1Χ)的單獨(dú)IL-4或多種濃度[10ηX (0.67NM) ] AP-1肽或重組DMID-APl的處理。通過IL-4與IL-4受體間的結(jié)合而誘導(dǎo)的Stat蛋白質(zhì)的磷酸化使用兔多克隆抗體抗STAT6(Cell Signaling, #9362)與兔多克隆抗體抗pTyr641_STAT6 (Cell Signaling, #9361)利用Western法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果確認(rèn)到，如圖4所示，與APl相比，本發(fā)明的DMID-APl將對(duì)Stat蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化的IL-4活性抑制了 10倍以上。
[0162]實(shí)施例5.[0163]重組DMID-APl檢測(cè)能力提高檢證2—細(xì)胞成像、動(dòng)物成像
[0164]5-1.細(xì)胞影像(細(xì)胞成像)
[0165]為了研究本發(fā)明的內(nèi)置有APl的蛋白質(zhì)骨架模塊(DMID-APl)與在細(xì)胞中表達(dá)的IL-4受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力，使用熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)對(duì)于H226細(xì)胞系中的未內(nèi)置的單獨(dú)APl與DMID-APl相對(duì)于IL-4受體的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。將AP-1肽或精制的DMID-APl利用透析緩沖液(50mM硼酸，150mM NaCl, ImM EDTA, pH9.0)在4°C進(jìn)行透析后，與熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素(FITC) (sigma)在37 V反應(yīng)I小時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。在37°C加入50mM甘氨酸5分鐘使反應(yīng)停止后，利用透析緩沖液(20mM Tris HCl，pH8.0)于4°C進(jìn)行透析。向H226細(xì)胞中分別添加相同量的對(duì)照組肽、AP-U DMID-APl使其結(jié)合，洗滌后利用4%多聚甲醛(PFA)進(jìn)行固定，細(xì)胞核利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行染色，之后利用熒光顯微鏡(Zeiss, Oberkochen, Germany)進(jìn)行觀察。
[0166]結(jié)果確認(rèn)到，如圖5所示，對(duì)于AP1-DMID-FITC，與不同的AP-1或?qū)φ战M肽相比，表達(dá)IL-4受體的細(xì)胞標(biāo)記能力優(yōu)異。
[0167]5-2.動(dòng)物影像(動(dòng)物成像)
[0168]將I X IO7個(gè)H226細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，皮下注射至5~6周齡的雌性BALB/c裸鼠的右側(cè)大腿部，制造皮下腫瘤模型。約3周后腫瘤的尺寸為0.1cm~Icm,此時(shí)用于實(shí)驗(yàn)中。將腫瘤異種移植小鼠麻醉，尾靜脈注射結(jié)合有熒光物質(zhì)的AP-1肽與DMID-APl150ug。利用Optics分析熒光標(biāo)記肽的腫瘤尋靶作用功能。
[0169]結(jié)果確認(rèn)到，如圖6所示，與AP-1相比，DMID-APl的腫瘤尋靶作用功能得到了提聞。
[0170]工業(yè)實(shí)用性
[0171]本發(fā)明涉及活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性得到增強(qiáng)的新穎的蛋白質(zhì)骨架模塊，詳細(xì)地說，本發(fā)明提 供下述蛋白質(zhì)骨架模塊和其制造方法，該蛋白質(zhì)骨架模塊的特征在于，其包含下述多肽:由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽；包含活性多肽的多肽；和由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)骨架模塊使內(nèi)置的活性多肽的結(jié)合親和力或結(jié)合特異性增強(qiáng)，從而在疾病的診斷和治療中是有效的，因而工業(yè)實(shí)用性大。
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述多肽依次連接而成的多肽: a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽； b)包含活性多肽的多肽；以及 c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
2.一種多聚核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
3.—種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求2所述的多聚核苷酸。
4.一種宿主細(xì)胞,其經(jīng)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
5.一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的制造方法，其包括對(duì)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
6.一種診斷用組合物，其包含權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
7.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
8.—種診斷用試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
9.一種內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊，其特征在于，其包含下述成分依次連接而成的多肽: a)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第I位~第19位氨基酸序列構(gòu)成的多肽； b)包含序列編號(hào)3所示的激活蛋白-1也即AP-1的氨基酸序列的多聚核苷酸；以及 c)由序列編號(hào)I所示氨基酸序列的第29位~第86位氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
10.一種多聚核苷酸，其編碼權(quán)利要求9所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊。
11.如權(quán)利要求10所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸為選自由序列編號(hào)4~序列編號(hào)6組成的組中的任意一種。
12.—種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用組合物，其包含權(quán)利要求9所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
13.—種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用試劑盒，其包含權(quán)利要求9所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊作為有效成分。
14.一種診斷方法，其包括將權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
15.權(quán)利要求1所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造診斷用制劑。
16.一種癌癥或動(dòng)脈硬化診斷方法，其包括將權(quán)利要求9所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊以有效量對(duì)于所需要的個(gè)體進(jìn)行給藥的工序。
17.權(quán)利要求9所述的內(nèi)置有活性多肽的蛋白質(zhì)骨架模塊的用途，其用于制造癌癥或動(dòng)脈硬化診斷用制劑。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK103703022SQ201280029758
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】車基元, 蘇仁燮, 金昭延, 李炳憲, 金仁山 申請(qǐng)人:慶北大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)