拮抗cd40之抗體多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供特異性結合人類CD40之新穎抗原決定基的抗體多肽。該等抗體多肽不展現CD40促效劑活性。該等抗體多肽適用于治療涉及CD40活化之疾病，諸如自體免疫疾病。該等抗體多肽可為包含單一VL或VH域之域抗體(domain?antibody，dAb)。該等抗體多肽之半衰期可藉由將該等抗體多肽修飾成亦可結合人類血清白蛋白(human?serum?albumin，HSA)之雙特異性試劑而增加。
【專利說明】拮抗CD40之抗體多肽
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明提供靶向CD40且不展現CD40促效劑活性之抗體及其片段、包含前述者之組合物及使用前述者治療涉及CD40活性之疾病的方法。
相關申請的交叉引用
本發(fā)明要求2011年4月21日提交的美國臨時申請61/477，904的權益，在此將其全部內容援引并入本申請。 [0002]序列表
[0003]本申請案含有ASCII格式之序列表且其據此以全文引用的方式并入本文中。2012年4月17日創(chuàng)建之該ASCII復本被命名為200896W0.txt且大小為1，188，530字節(jié)。
現有技術
[0004]0)40為屬于存在于抗原呈現細胞(antigen presenting cell,APC)(包括樹突狀細胞、B細胞及巨卩遼細胞)上之腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)受體超家族之協同刺激分子。APC在⑶40結合TH細胞上之其配位體⑶154 (⑶40L)時活化。⑶40介導之APC活化涉及多種免疫反應，包括細胞激素產生、協同刺激分子(諸如⑶86)之上調及抗原呈現及B細胞增殖增強。CD40亦可由內皮細胞、平滑肌細胞、纖維母細胞及上皮細胞表現。
[0005]CD40活化亦涉及多種與例如自體免疫性、移植排斥反應或過敏反應相關之不當T細胞反應?？刂撇缓虾跣枰甌細胞反應的一個策略為以拮抗性抗體靶向CD40。舉例而言，先前稱為Chironl212之單株抗體HCD122(魯卡木單抗(Lucatumumab))有關治療某些CD40介導之發(fā)炎性疾病目前處于臨床試驗階段。參見因特網之超文本傳送協議:clinicaltrialsfeeds.0rg/clinical-trials/show/NCTO1275209 (2011 ^ I 月 11 日最后更新)上之 “Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapyin CD40+Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma，，，Clinical Trials Feeds。然而，單株抗體可顯示促效劑活性。舉例而言，抗⑶40抗體Chi220之適用性受限于其弱刺激潛能。參見 Adams 等人，“Development of a chimeric ant1-CD40monoclonalantibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival，，，J.1mmunol.174:542-50(2005)。

【發(fā)明內容】

[0006]在臨床環(huán)境中仍需要不具有部分促效劑活性之抗CD40抗體拮抗劑。本發(fā)明提供特異性結合人類CD40之新穎抗原決定基之新穎抗體多肽。如由競爭分析及由自抗體多肽與CD40共結晶得到之結構所示，CD40抗原決定基不與Chi220抗原決定基重迭。該等抗體多肽有利的是不展現CD40促效劑活性。該等抗體多肽適用于治療涉及CD40活化之疾病，包括自體免疫疾病、移植排斥反應及過敏反應。該等抗體多肽包含可變域。在一個實施例中，抗體多肽呈含有單一可變域之域抗體(dAb)形式。在另一個實施例中，dAb為包含可結合例如人類血清白蛋白(HSA)之第二可變域之雙特異性試劑。
[0007]本發(fā)明提供一種包含第一可變域之抗體多肽，其中該抗體多肽特異性結合人類CD40之抗原決定基，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列，其中該抗體多肽與域抗體(dAb)BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)競爭結合，且其中該抗原決定基包含至少一個選自由 Trpl09、Leul21、Hisl22、Serl24、Serl56、Alal57、Phel58、Glul59 及 Hisl62 組成之群的CD40氨基酸殘基。
[0008]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域包含選自由BMS3h_37、BMS3h_38、BMS3h-56及BMS 3h-198組成之譜系群的抗體多肽之一之氨基酸序列，且其中第一可變域之表觀結合常數為IpM至ΙΟΟηΜ。進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之表觀結合常數為 IpM 至 IOnM0
[0009]亦提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列包含(a)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDRl區(qū)、(b)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR2區(qū)、(c)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR3區(qū)、(d)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FRl區(qū)、(e)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR2區(qū)、(f)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR3區(qū)及(g)與BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之FR4區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR4區(qū)。
[0010]亦提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列包含(a)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDRl區(qū)、(b)與BMS3h-56-269 (SEQ ID NO:417)之CDR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR2區(qū)、(c)與BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之CDR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR3區(qū)。
[0011]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有至多10個氨基酸不同。
[0012]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列有至多5個氨基酸不同。
[0013]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有兩個氨基酸不同。
[0014]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有一個氨基酸不同。
[0015]進一步提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h_56之譜系群，且其中第一可變域之氨基酸序列進一步包含:(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (SEQ ID NO: 1274)之CDRl 區(qū)，其中 X1 SAsp 或 Gly，且 Y1 SMet 或 Leu ； (b)具有序列 Ala-1Ie-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (SEQ ID NO: 1275)之 CDR2 區(qū)，其中 X2 為 Gin、Tyr> Pro、Trp 或 Ala, Y2 為 Thr> Ser、Asn、Gly、Met 或 Gin, Z2 為 Arg、Leu、Tyr> His 或 Phe,且 A2 SLys 或 Met ;及(c)具有序列 X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3 (SEQ ID NO: 1276)之 CDR3 區(qū)，其中 X3 為 Leu 或 Pro, Y3 為 Phe、Gin、Thr 或 Met, Z3 為 Tyr>Pro> Leu> Thr> lie、Phe 或 Met,A3 為 Gin、His、Asp、Ser> Lys> Glu 或 Gly,且 B3 為 Glu、Asp 或 Tyr。
[0016]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域之氨基酸序列包含:(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly—Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Ar g_Leu_Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1 (SEQ ID NO: 1277)之 FRl 區(qū)，其中 X1 為 Leu 或Arg,且 Y1 為 Arg 或 Ala ； (b)具有序列 Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser (SEQ ID NO: 1278)之 FR2 區(qū)，其中 X2 為 Gln 或 Arg, Y2 為 Lys 或 Arg,且 Z2 為 Gly 或Val ; (c)具有序列 Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-GlI1-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys (SEQ ID NO: 1279)之FR3 區(qū)，其中 X3 SThr 或 Met，Y3 SGlu 或 Asp，Z3 SAla 或 Ser，A3 STyr 或 His，且 B3 SAla或Thr ;及(d)具有序列 X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4 (SEQ ID NO: 1280)之FR4 區(qū)，其中 X4 為 Trp 或 Arg，Y4 為 Gln 或 Ρι?，且 Z4 為 Ser 或 Asn。
[0017]進一步提供一種抗體多肽，其中第一可變域包含BMS3h-56-258(SEQ ID N0:10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列。
[0018]進一步提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h_37之譜系群，其中第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-XfPro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO: 1281);且其中 X1 為 Gln 或 Arg J1 為 Glu 或 Gly J1 為 Ala、Leu 或 Glu 為 Phe
[0019]或Tyr ;且 B1 為 Trp 或 Arg。
[0020]亦提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h_38之譜系群，其中第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cy S-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-1 Ie-TrP-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-1le-Ser-Z1-A1-Gly-B^c1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-TyT-Tyr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQ ID NO: 1282);且其中 X1 為 Thr 或 Pro -J1 為 Ala 或 Ser ；Z,為 Arg 或Gly 為 Arg、Ser、Asn、Gin、Gly、His 或 Leu 為 TyrΛ Phe、Trp 或 Gly ；
[0021]C1 為 Ser 或 Gly ;且0丨為 Arg、Met 或 Pro。
[0022]亦提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h_198之譜系群，其中第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y^Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-CYs-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQID NO: 1283);且其中 X1 為 Met 或 Leu -J1 為 Val 或 Phe ；Z,為 Asp 或 Asn ；A,為 Ser 或 Thr ；B1 為 Tyr 或 His 為 Lys 或 Arg 為 Asp 或 Glu 為 Tyr 或 Phe 為 Trp
[0023]或Arg 為 Gly 或 Arg ;且 H1 為 Gln 或 His。
[0024]進一步提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽為域抗體(dAb)。
[0025]進一步提供一種抗體多肽，其中可變域融合至Fe域。
[0026]進一步提供一種抗體多肽，其中該抗體多肽進一步包含特異性結合第二抗原之第二可變域，其中該第二抗原為除人類CD40以外之抗原。
[0027]亦提供一種抗體多肽，其中第二抗原為分化簇(cluster of differentiation,CD)分子或主要組織兼容性復合體(Major Histocompatibility Complex,MHC) II類分子。
[0028]亦提供一種抗體多肽，其中第二抗原為血清白蛋白(SA)。
[0029]本發(fā)明提供一種編碼本文所揭示之抗體多肽的核酸。
[0030]本發(fā)明亦提供一種包含本文所揭示之核酸的載體。
[0031]本發(fā)明亦提供一種包含本文所揭示之載體的宿主細胞。
[0032]本發(fā)明提供一種包含治療有效量之本文所揭示之抗體多肽及醫(yī)藥學上可接受之載劑的醫(yī)藥組合物 。本發(fā)明亦提供一種進一步包含免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑之醫(yī)藥組合物。
[0033]本發(fā)明提供一種治療需要該治療之患者的免疫疾病之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本文所揭示之醫(yī)藥組合物。本發(fā)明亦提供一種方法，其中該醫(yī)藥組合物與免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑組合投與。
[0034]本發(fā)明提供一種治療免疫疾病之方法，其中該免疫疾病為自體免疫疾病或移植相關疾病。本發(fā)明進一步提供一種治療免疫疾病之方法，其中該免疫疾病選自由以下組成之群:艾迪森氏病(Addison’s disease)、過敏癥、僵直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、結腸炎、冠心病、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、葛瑞夫茲氏病(Graves’ disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏病(Hashimoto’ s disease)、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、發(fā)炎性腸病、對重組藥品之免疫反應、全身性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏癥候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、移植排斥反應、血管炎、AIDS、異位性過敏癥、支氣管哮喘、濕疹、麻風病、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織及器官之移植、慢性疲勞癥候群、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、心肌梗塞、中風、自閉癥、癲癇癥、阿瑟氏現象(Arthus’s phenomenon)、全身性過敏反應、酒精成癮及藥物成癮。
[0035]本發(fā)明亦提供一種使用特異性結合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人類CD40之抗原決定基的第一可變域靶向CD40之方法，其中抗體多肽與域抗體(dAb)BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)競爭結合。
[0036]本發(fā)明提供抗體多肽或其醫(yī)藥學上可接受之鹽的醫(yī)學用途，該抗體多肽包含特異性結合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人類CD40之抗原決定基的第一可變域，其中該抗體多肽與域抗體(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)競爭結合。
[0037]本發(fā)明提供抗體多肽或其醫(yī)藥學上可接受之鹽的用途，該抗體多肽包含特異性結合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人類CD40之抗原決定基的第一可變域，其中該抗體多肽與域抗體(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID N0:9)競爭結合，該用途系用于制備用以治療免疫疾病之藥劑。在一些實施例中，醫(yī)藥組合物與免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑組合投與。在其他實施例中，免疫疾病為自體免疫疾病或移植相關疾病。在其他實施例中，該免疫疾病選自由以下組成之群:艾迪森氏病、過敏癥、僵直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、結腸炎、冠心病、克羅恩氏病、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、葛瑞夫茲氏病、格-巴二氏征候群、橋本氏病、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、發(fā)炎性腸病、對重組藥品之免疫反應、全身性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏癥候群、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、移植排斥反應、血管炎、AIDS、異位性過敏癥、支氣管哮喘、濕疹、麻風病、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織及器官之移植、慢性疲勞癥候群、阿茲海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中風、自閉癥、癲癇癥、阿瑟氏現象、全身性過敏反應、酒精成癮及藥物成癮。[0038]本發(fā)明提供一種抗體多肽或其醫(yī)藥學上可接受之鹽，該抗體多肽包含特異性結合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人類CD40之抗原決定基的第一可變域，其中該抗體多肽與域抗體(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID N0:9)競爭結合，該抗體多肽或其醫(yī)藥學上可接受之鹽系用于制備用以治療免疫疾病之藥劑。該藥劑可例如與免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑組合投與。免疫疾病可為例如自體免疫疾病或移植相關疾病。免疫疾病亦可選自由以下組成之群:艾迪森氏病、過敏癥、僵直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、結腸炎、冠心病、克羅恩氏病、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、葛瑞夫茲氏病、格-巴二氏征候群、橋本氏病、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、發(fā)炎性腸病、對重組藥品之免疫反應、全身性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏癥候群、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、移植排斥反應、血管炎、AIDS、異位性過敏癥、支氣管哮喘、濕疹、麻風病、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織及器官之移植、慢性疲勞癥候群、阿茲海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中風、自閉癥、癲癇癥、阿瑟氏現象、全身性過敏反應、酒精成癮及藥物成癮。
[0039]附圖簡要說明
[0040]圖1展示人類⑶40(SEQ ID NO:1)之兩種不同共晶體結構之結合模式，一者具有 dAb BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321)及一者具有 Chi220 抗體之 Fab’。BMS3h_56_5 及Chi220Fab’分子顯示為包含β -股(在dAb中以箭頭表示)及非重復二級結構(在dAb中以環(huán)表示)之草圖。亦顯示互補決定區(qū)(⑶R)，⑶40亦顯示為包含人類⑶40之BMS3h-56-5抗原決定基殘基之早圖。亦顯不Chi220抗原決定基殘基。亦顯不雙硫鍵。標記⑶40之N端(N)及C端(C)。
[0041]圖 2 展示接觸人類 CD40(SEQ ID NO:1)之 BMS3h_56_5 (SEQ ID N0:321)之空間填充模型，其以草圖顯示。顯示接觸⑶40之dAb BMS3h-56-5之表面殘基。標記BMS3h-56-5CDR3 區(qū)及 FR-2 殘基 Leu45、Arg47、Arg56 及 Phe99。在此圖中使用 Kabat 編號(Kabat等人，Sequences of Immunological Interest,第5版,美國健康與人類服務部(U.S.Dept.Health&Human Services), Washington, D.C.(1991))，且與順序編號之不同之處在于使用插入殘基來保持β-股之殘基編號相同。因此，對于BMS3h_56_5,順序殘基53變?yōu)闅埢?2A，順序殘基84、85及86分別變?yōu)?2A、82B、82C，且Kabat殘基編號100缺失(其將介于順序殘基103與104之間)KD40亦以包含非重復二級結構及BMS3h-56-5抗原決定基之草圖表示。在人類與長尾稱猴(Macaca fascicularis)(食蟹稱猴(cynomolgusmonkey))之間不同的 CD40 殘基 Alall5、Phe99、Serl26、Hisl62、Leul21 及 Trp 109 以棒圖標法顯示。作為BMS3h-56-5抗原決定基之一部分的在人類與食蟹獼猴之間不同的CD40殘基為 Trpl09、Leul21 及 Hisl62。CD40 殘基 Trpl09 及 Leul21 處于 BMS3h_56_5CDR3 與 FR-2之間的間隙中。Trp 109之突變大大降低或消除BMS3h-56-5活性。
[0042]圖3展示來自人類及靈長類動物物種之血液樣品上聚乙二醇化抗人類⑶40dAbBMS3h38-2C-P40Br之結合。圖3A顯示BMS3h38_2C_P4(Br結合至人類及獼猴B細胞；圖3B顯示BMS3h38-2C-P40Br結合至人類、恒河猴及黑猩猩B細胞。
[0043]圖4、圖5、圖6及圖7顯示分別來自譜系BMS3h_56、BMS3h_37、BMS3h_38及BMS3h-198之代表性域抗體多肽之ClustalW2比對。
[0044]實施方式
[0045]本發(fā)明提供特異性結合至人類CD40之抗體多肽。該等抗體多肽不展現CD40促效劑活性，且該等抗體多肽適用于治療涉及CD40活化之疾病，諸如自體免疫疾病。該等抗體多肽可使用利用細胞結合分析之初步篩檢，隨后進行一或多輪易錯或簡并寡核苷酸定向親和力成熟來選擇。結果，提供一類特異性結合單一 CD40抗原決定基之抗體多肽。
[0046]“譜系”為如以下實例中所揭示由常見前驅體藉由易錯或簡并寡核苷酸定向親和力成熟而制備且預期結合相同CD40抗原決定基之一組相關抗體多肽。使用抗體多肽之命名表示各種譜系。舉例而言，命名“BMS3h-56”系指針對人類CD40所產生之譜系56之抗體多肽。“譜系 BMS3h-56” 抗體多肽包括 BMS3h-56-l 直至 BMS3h_56_33 及 BMS3h-56_202直至 BMS3h-56-288。
[0047]因此，在一個實施方式中，抗體多肽包含特異性結合人類CD40之可變域，其中該抗體多肽與表3中所列之任一域抗體(dAb)競爭結合。舉例而言，dAb可能屬于選自由以下組成之群的譜系:例如 BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h_41、BMS3h_43、BMS3h_56、BMS3h-131、BMS3h-198 及 BMS3h_202，諸如 dAb BMS3h_56_5、BMS3h-56_201 或 BMS3h_56_258。在另一個實施方式中，抗體多肽特異性結合與表3中所列之任一 dAb相同之人類CD40抗原決定基。舉例而言，抗體多肽可包含特異性結合與例如dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201或BMS3h-56-258相同之人類⑶40抗原決定基的可變域。如下文所揭示，人類⑶40抗原決定基可包含例如SEQ ID NO:1之氨基酸殘基Trp 109。
[0048]抗體多肽可為含有單一可變域之域抗體?？贵w多肽亦可包含其他結構域，諸如Fe域。舉例而言，抗體多肽可包含特異性結合人類血清白蛋白(HSA)之第二可變域。舉例而言，該等雙特異性抗體多肽可具有增加之半衰期。
[0049]在序列表中，SEQ ID NO:1為人類CD40之氨基酸序列；SEQ ID N0:2為長尾獼猴CD40之氨基酸序列。域抗體BMS3h-56-5之氨基酸序列為SEQ ID NO:321。
[0050]如本文所用，“特異性結合”系指抗體多肽結合抗原之解離常數(Kd)如例如藉由表面電漿子共振所量測，為約`I μ M或I μ M以下。適當分析系統(tǒng)包括BIAcore?表面電漿子共振系統(tǒng)及BIAcore?動力學評估軟件(例如2.1版)。特異性結合相互作用之親和力或Kd可為約500nM或500nM以下或約300nM或300nM以下。[0051]術語“約”將為一般熟習此項技術者所了解且在使用其之情形下將有一定程度之變化。一般而言，約涵蓋加上/減去提及值之10%的數值范圍。
[0052]根據此實施方式，以下縮寫及定義適用。須注意，除非本文另外明確規(guī)定，否則如本文所用，單數形式“一(a)”、“一(an)”及“該”包括復數個指示物。因此，舉例而言，提及“抗體”包括復數個該等抗體，且提及“劑量”包括提及一或多個為熟習此項技術者所知之劑量及其等同量等。
[0053]1.CD40 及 CD40 活性
[0054]提供結合人類⑶40之抗體多肽。⑶40亦稱為B細胞表面抗原⑶40、Bp50、⑶40L受體、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5及腫瘤壞死因子受體超家族成員5。人類CD40之相關結構信息可例如以UniProt寄存編號P25942、Q9BYU0及Q53GN5找到?！叭祟怌D40”系指包含以下氨基酸序列之CD40:
[0055]
【權利要求】
1.一種包含第一可變域之抗體多肽，其中該抗體多肽特異性結合人類CD40之抗原決定基，其中該抗體多肽與域抗體(domain antibody, dAb)BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)競爭結合于⑶40，其中⑶40包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列，且其中該抗原決定基包含至少一個選自由 Trpl09、Leul21、Hisl22、Serl24、Serl56、Alal57、Phel58、Glul59 及 Hisl62 組成之群的CD40氨基酸殘基。
2.如權利要求1之抗體多肽，其中該第一可變域包含選自由BMS3h-37、BMS3h_38、BMS3h-56及BMS3h-198組成之譜系群的抗體多肽之一的氨基酸序列，且其中該第一可變域之表觀結合常數為IpM至100ηΜ。
3.如權利要求1至2中任一項之抗體多肽，其中該第一可變域包含選自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56組成之譜系群的抗體多肽之一的氨基酸序列，且其中該第一可變域之hIZCD40L驅動之人類B細胞增殖EC5tl為0.01nM至100.0nM。
4.如權利要求1之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列包含: (a)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDRl區(qū)， (b)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR2區(qū)， (c)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR3區(qū)， (d)與BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)之FRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FRl區(qū)， (e)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之FR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR2區(qū)， (f)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之FR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR3區(qū)，及 (g)與BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)之FR4區(qū)有至多兩個氨基酸不同的FR4區(qū)。
5.如權利要求1之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列包含: (a)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDRl區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDRl區(qū)， (b)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR2區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR2區(qū)， (c)與BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR3區(qū)有至多兩個氨基酸不同的CDR3區(qū)。
6.如權利要求1之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有至多10個氨基酸不同。
7.如權利要求6之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列有至多5個氨基酸不同。
8.如權利要求7之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有兩個氨基酸不同。
9.如權利要求8之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列與BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有一個氨基酸不同。
10.如權利要求2至3中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h-56之譜系群，且其中該第一可變域之氨基酸序列進一步包含:
(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (SEQ ID NO: 1274)之 CDRl 區(qū)，其中 X1 為 Asp 或 Gly，且Y1為Met或Leu ；
(b)具有序列Ala-1le-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO: 1275)之 CDR2 區(qū)，其中 X2 為 Gin、Tyr、Pro、Trp 或 Ala，Y2 為 Thr、Ser, Asn,Gly、Met 或 Gin, Z2 為 Arg、Leu、Tyr> His 或 Phe,且 A2 為 Lys 或 Met ;及
(c)具有序列X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3(SEQ ID NO: 1276)之 CDR3 區(qū)，其中 X3 為 Leu 或Pro, Y3 為 Pheλ Gin、Thr 或 Met，Z3 為 Tyr、Pro、Leu、Thr、lie、Phe 或 Met，A3 為 Gin、His、Asp、Serλ Lys、Glu 或 Gly,且 B3 為 Glu、Asp 或 Tyr0
11.如權利要求10之抗體多肽，其中該第一可變域之氨基酸序列包含:
(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-GIy-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1 (SEQ ID NO: 1277)之 FRl區(qū)，其中X1為Leu或八作，且Y1為Arg或Ala ；
(b)具有序列Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser (SEQ IDNO: 1278)之 FR2 區(qū)，其中 X2 為 Gln 或 Arg, Y2 為 Lys 或 Arg,且 Z2 為 Gly 或 Val ；
(c)具有序列Arg-Phe-Thr-1 Ie-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys (SEQ ID NO: 1279)之FR3 區(qū)，其中 X3 為 Thr 或 Met，Y3 為 Glu 或 Asp，Z3 為 Ala 或 Ser，A3 為 Tyr 或 His，且 B3 為Ala 或 Thr ;及
(d)具有序列X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4(SEQ ID NO: 1280)之 FR4區(qū)，其中X4為Trp或Arg, Y4為Gln或Pro,且Z4為Ser或Asn0
12.如權利要求2至3中任一項之抗體多肽，其中該第一可變域包含BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或 BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列。
13.如權利要求2至3中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h-37之譜系群，其中該第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-XfPrO-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-ThT-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1281);且
其中 X1 為 Gln 或 Arg ；YX 為 Glu 或 Gly ；ZX 為 Ala.Leu 或 Glu ；AX 為 Phe 或 Tyr ;且 B1 為Trp 或 Arg0
14.如權利要求2至3中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h-38之譜系群，其中該第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cy S-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-1le-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-1le-Ser-Z1-A1-Gly-B1-C1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-TYr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1282);且
其中 \ 為 Thr 或 Pro 為 Ala 或 Ser (L1 為 Arg 或 Gly 為 Arg、Ser、Asn、Gln、Gly、His 或 Leu 為 Tyrλ Phe、Trp 或 Gly 為 Ser 或 Gly ;且 D1 為 Arg、Met 或 Pro。
15.如權利要求2至3中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽選自BMS3h-198之譜系群，其中該第一可變域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-CyS-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y1-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-Cys-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO: 1283);且
其中 X1 為 Met 或 Leu !Y1 為 Val 或 Phe -,I1 為 Asp 或 Asn !A1 為 Ser 或 Thr !B1 為 Tyr 或His !C1 為 Lys 或 Arg !D1 為 Asp 或 Glu !E1 為 Tyr 或 Phe !F1 為 Trp 或 Arg !G1 為 Gly 或 Arg ；且H1為Gln或His。
16.如權利要求1至15中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽為域抗體(dAb)。
17.如權利要求1至16中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽為包含該第一可變域及Fe域之融合多肽。
18.如權利要求17之融合多肽，其中該融合多肽包含IgG4Fc域。
19.如權利要求18之融合多肽，其中該融合多肽包含IgGlFc域。
20.如權利要求17至19中任一項之融合多肽，其中該融合多肽包含選自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56組成之譜系群的抗體多肽之一的氨基酸序列，且其中該融合多肽之hIZCD40L驅動之人類B細胞增殖EC5tl為0.0OlnM至100.0nM。
21.如權利要求1至20中任一項之抗體多肽，其中該抗體多肽進一步包含特異性結合第二抗原之第二可 變域，其中該第二抗原為除人類CD40以外之抗原。
22.如權利要求21之抗體多肽，其中該第二抗原為分化簇(clusterofdifferentiation, CD)分子或主要組織兼容性復合體(Major HistocompatibilityComplex, MHC) II 類分子。
23.如權利要求21之抗體多肽，其中該第二抗原為血清白蛋白(SA)。
24.一種核酸，其編碼如權利要求1至23中任一項之抗體多肽。
25.—種載體，其包含如權利要求24之核酸。
26.—種經分離之宿主細胞，其包含如權利要求25之載體。
27.一種醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量之如權利要求1之抗體多肽及醫(yī)藥學上可接受之載劑。
28.如權利要求27之醫(yī)藥組合物，其進一步包含免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑。
29.—種治療需要該治療之患者的免疫疾病之方法,其包含向該患者投與治療有效量之如權利要求27之醫(yī)藥組合物。
30.如權利要求29之方法，其中該醫(yī)藥組合物系與免疫抑制/免疫調節(jié)劑及/或消炎劑組合投與。
31.如權利要求29之方法，其中該免疫疾病為自體免疫疾病或移植相關疾病。
32.如權利要求29之方法，其中該免疫疾病選自由以下組成之群:艾迪森氏病(Addison’s disease)、過敏癥、僵直性脊椎炎、哮喘、動脈粥樣硬化、自體免疫性耳病、自體免疫性眼病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、結腸炎、冠心病、克羅恩氏病(Crohn’sdisease)、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、絲球體腎炎、葛瑞夫茲氏病(Graves’ disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、發(fā)炎性腸病、對重組藥品之免疫反應、全身性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、類肉瘤病、硬皮病、休格連氏癥候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、移植排斥反應、血管炎、AIDS、異位性過敏癥、支氣管哮喘、濕疹、麻風病、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織及器官之移植、慢性疲勞癥候群、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、心肌梗塞、中風、自閉癥、癲癇癥、阿瑟氏現 象(Arthus’s phenomenon)、全身性過敏反應、酒精成癮及藥物成癮。
【文檔編號】C07K16/28GK103842382SQ201280030683
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權日:2011年4月21日
【發(fā)明者】A.蘇里, S.舍里夫, S.蘇查德, A.亞姆紐克, S.克里斯特克, J.塔姆拉, J.布萊森, S.格蘭特, P.德魯 申請人:百時美施貴寶公司, 多曼蒂斯有限公司