抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備適用于犬的抗體的方法。還提供了與犬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結合且中和犬NGF結合p75或TrkA犬NGF受體能力的犬源化抗體。本發(fā)明延及編碼所述抗體的核酸和使用所述抗體和/或核酸治療犬疼痛和關節(jié)炎的方法。
【專利說明】抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及充當犬神經(jīng)生長因子的拮抗劑抗體及其片段。本發(fā)明還涉及制備這些抗體的方法以及這些抗體和片段在治療犬的與神經(jīng)生長因子相關的病癥中的治療用途，例如疼痛、疼痛相關病癥以及與導致慢性疼痛發(fā)作的病癥。
【背景技術】
[0002]神經(jīng)生長因子(NGF)是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽鏈、β多肽鏈和Y多肽鏈構成。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，其參與許多不同的作用。NGF促進感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的生存和分化，并且通過兩類膜結合受體即低親和性NGF受體ρ75和高親和性NGF受體跨膜酪氨酸激酶TrkA來傳達信號。NGF與TrkA或ρ75的結合導致感覺神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)。
[0003]已經(jīng)描述了使用NGF拮抗劑治療人類的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.0p.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，國際專利申請W02006/131951描述了人源化形式的大鼠aDll(aDll)單克隆抗體。a Dll抗體對小鼠NGF具有結合特異性，但已知也與人類和大鼠形式的NGF結合。在施用至人之前，需要對a Dll大鼠衍生單克隆抗體進行人源化，從而使產(chǎn)生的中和抗體最少，該中和抗體是由人類對嚙齒類衍生抗體的抗大鼠抗體(HAMA)反應產(chǎn)生的。而且，用人恒定結構域取代小鼠恒定結構域允許選擇下游效應子功能。
[0004]目前，通過施用數(shù)種鎮(zhèn)痛劑包括局部和全身麻醉劑、麻醉性鎮(zhèn)痛劑、α2拮抗劑、非類固醇抗炎藥(NSAIDs)和類固醇來進行犬的疼痛管理。這些藥物中的每一種都需要頻繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，對于患有慢性疼痛例如患有癌痛或關節(jié)炎的犬，需要不頻繁施用且持久有效的疼痛緩解。
[0005]雖然NGF在犬組織中表達，并且已經(jīng)表征了犬NGF分子(Eisele 1.WoodIS.German AJ.Hunter L.Trayhurn Ρ.，，Adipokine gene expression in dogadipose tissues and dog white adipocytes differentiated in primaryculture，，Hormone&Metabolic Research.37 (8): 474-81>2005Genbank XP_540250),但該文章既沒有描述犬NGF的拮抗劑，也沒有在犬中使用阻塞NGF介導的信號傳導以防止或緩解疼痛。由于中和抗體的產(chǎn)生，因此在犬中使用在其他物種中充當抗NGF拮抗劑的已知抗體并不可行。而且，包含犬衍生恒定結構域和衍生自已知的抗NGF抗體例如CiDll的可變結構域的嵌合抗體的產(chǎn)生，并不能保證與犬NGF結合。此外，這樣的抗體可以顯示出與犬中可能存在但最初衍生該抗體的物種中不存在的其他靶表位的交叉反應。另外，中和抗體的產(chǎn)生將限制該抗體的長期治療施用，當治療與慢性疼痛相關的病癥或癌病癥況時，這是特別重要的條件。同樣，使用CDR移植或相關的技術產(chǎn)生犬源化形式的抗NGF抗體可能導致中和抗體的產(chǎn)生，并且可能進一步顯示抗原結合親和性與親合力的降低。因此，迫切需要用于犬疼痛治療中充當犬NGF拮抗劑的結合成員(binding member),其中該結合成員保持高水平的結合親和性與親合力，同時避免了針對其的中和抗體的產(chǎn)生。
[0006]發(fā)明概述[0007]經(jīng)過大量的努力，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了一種制備抗體的方法，該抗體產(chǎn)生特異性結合犬NGF且中和犬NGF生物活性的非免疫原性抗體及其結合片段。特別是，出乎意料地，本文表明，本發(fā)明的抗體及其結合片段與犬NGF的結合，通過抑制犬NGF與高親和性TrkA受體或與p75受體的結合,隔絕了犬NGF的生物活性。這反過來阻止了感知神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)，結果減輕或消除了痛覺。使用重組DNA方法生產(chǎn)抗體，并且出乎意料地該抗體是非免疫原性的，也就是說，在施用至犬個體之后，針對該抗體的中和抗體并未產(chǎn)生。由于使用標準方法例如CDR移植等并未產(chǎn)生抗體，因此這樣的發(fā)現(xiàn)是令人驚訝且完全出乎意料的。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了制備適用于犬中的抗體的方法，其包括或基本上由以下步驟組成:
[0009]從犬之外的物種提供供體抗體，其中所述供體抗體對犬中存在的靶抗原有結合特異性；
[0010]將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個犬抗體的框架區(qū)的氨基酸序列中對應位置的每一氨基酸殘基比較，以鑒別出所述供體受體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個犬抗體的框架區(qū)的氨基酸序列的對應位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及
[0011]用存在于一個或多個犬抗體中對應位置的一個或多個氨基酸殘基來取代所述供體抗體中一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0012]本發(fā)明的方法修飾了犬中使用的供體抗體，這樣的方法使得修飾的抗體的框架區(qū)內(nèi)的任何位置不含有在犬中的該位置將是外來的任何氨基酸。因此，修飾的抗體保持了供體抗體對靶抗原的特異性和親和性，但重要的是修飾并沒有產(chǎn)生潛在的外來表位。因此，在犬中，修飾的抗體不被看做外來的，并且尤其是在長期施用后，也沒有在犬中引起可能導致抗體功效的中和的免疫反應。`
[0013]在某些實施方案中，取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括，用存在于對應位置的與所述一個或多個取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基來取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0014]在某些實施方案中，該方法還包括用衍生自犬抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結構域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結構域的步驟。通常，該重鏈的恒定結構域被HCA或HCD犬恒定結構域取代。
[0015]在某些實施方案中，靶抗原是神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0016]本發(fā)明第一方面的方法并不包括CDR移植。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備的抗體包含供體抗體的CDR、根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法制備的犬源化框架區(qū)，以及犬的恒定結構域。
[0017]本發(fā)明延及根據(jù)本發(fā)明的第一方面例如以下的描述制備的抗體。
[0018]因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了特異性結合犬神經(jīng)生長因子(NGF)的犬源化抗體或其結合片段。通常，當與NGF結合時，犬源化抗體或其結合片段中和NGF生物功能。也就是說，犬源化抗體或結合片段與NGF的結合隔絕了 NGF與TrkA受體或與p75受體結合的能力。在某些實施方案中，犬源化抗體或其結合片段與NGF結合的結合親和力Kd為IxKT8或更小。[0019]在本發(fā)明的另一或相關方面，提供了中和抗體或其抗原結合片段，其能夠與犬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結合，該抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或與其具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選為約25個氨基酸的長度上。
[0020]在一些實施方案中，中和抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是犬源化抗體，即具有已經(jīng)去免疫的氨基酸序列的抗體，從而，當施用至犬后，并不產(chǎn)生針對所述抗體的中和抗體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的制備抗體的方法來制備犬源化抗體。通常通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾抗體的重鏈恒定結構域，從而使得恒定結構域并不介導下游的效應子功能。
[0021]在一些實施方案中，抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 10或與其具有至少85、90、95或99%序列同源性的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0022]在本發(fā)明的另一或相關方面，提供了中和抗體或其抗原結合片段，其能夠與犬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結合，該抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4或與其具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度。[0023]通常，重鏈(VH)的可變區(qū)與包含至少一個免疫球蛋白恒定結構域的另一氨基酸序列結合。在某些實施方案中，免疫球蛋白恒定結構域衍生自子類IgG(免疫球蛋白G)抗體，以形成本發(fā)明的犬源化抗體的完整重鏈。已知四種不同的犬恒定結構域。通常，所述恒定結構域包含CHl、CH2和CH3以及位于CHl和CH2結構域之間的合適的連接體(或鉸鏈“hinge”)。通常，本發(fā)明的抗犬NGF抗體包含與恒定結構域結合的重鏈可變結構域，其中該恒定結構域并不介導下游的效應子功能例如補體結合、ADCC、Fc受體結合等。通常，所述重鏈具有犬重鏈同種型A或D。
[0024]在某些實施方案中，抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:包含SEQ IDN0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%同一性的氨基酸序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0025]在某些另外的實施方案中，抗體或結合片段可以包含其中恒定結構域中的至少一個氨基酸殘基被取代或缺失以阻止該氨基酸殘基糖基化的重鏈。因此，在某些另外的實施方案中，抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:包含選自SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQID NO: 22的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0026]在一些實施方案中，優(yōu)選不介導下游效應子功能例如補體結合、ADCC、Fc受體結合等且具有重鏈恒定結構域的抗體或片段。這樣的重鏈可以包含犬來源的亞型IgG-A的重鏈并且可以具有氨基酸序列SEQ ID N0:6、ll、15或19。而且，這樣的重鏈可以包含犬來源的亞型IgG-D并且可以具有氨基酸序列SEQ ID N0:9、14、18或22。
[0027]在另一個或相關的方面，本發(fā)明延及中和抗體或其抗原結合片段，其能夠與犬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結合，所述抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:輕鏈和重鏈，其中輕鏈(VL)的可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中重鏈(VH)的可變區(qū)包含、組成為或基本組成為:與氨基酸序列SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4相同或基本上同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。 [0028]在某些實施方案中，抗體或結合成員(binding member)包含輕鏈,所述輕鏈包含、組成為或基本組成為:氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 10或與其具有至少85%、優(yōu)選為95%、更優(yōu)選為至少98%氨基酸同一'丨生的序列。在某些實施方案中,所述同一'丨生是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0029]在某些實施方案中,抗體或結合成員包含重鏈,所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選至少98%序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0030]在某些實施方案中，抗體可以與至少受體分子綴合。
[0031]在某些另外的實施方案中，可以取代或缺失恒定結構域中的至少一個殘基，以防止該殘基的糖基化。因此，在某些另外的實施方案中，抗體或抗體結合片段包含、組成為或基本組成為:重鏈，其中該重鏈包含選自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0032]本發(fā)明人進一步限定了一系列可以與互補性決定區(qū)(⑶Rs)結合以形成犬源化重鏈可變結構域和犬源化輕鏈可變結構域的框架區(qū)(FR)。每一個重鏈結構域和輕鏈結構域都具有4個框架區(qū)，稱為FR1、FR2、FR3和FR4。
[0033]抗體分子可以包含重鏈可變結構域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關的插入框架區(qū)。重鏈可變結構域(VH)⑶R稱為HCDRs，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列位置可以找到這些 CDRs: VHCDRl - Kabat 殘基 31-35、VHCDR2 - Kabat 殘基 50-65、VHCDR3 - Kabat 殘基95-102(Kabat EA et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest (具有免疫學重要性的蛋白質(zhì)序列)，5th edition.Bethesda:US Department of Health andHuman Services,)。
[0034]而且，抗體進一步包含輕鏈可變結構域，其包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關的插入框架區(qū)。輕鏈可變結構域(VL)CDR稱為VLCDR，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列氨基酸殘基位置可以找到這些CDRs:VLCDRl - Kabat殘基24-34、VLCDR2 - Kabat殘基50-56、VLCDR3 - Kabat 殘基 89-97。
[0035]輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域包含四個框架區(qū)，？町、？1?2、？1?3和？1?4，以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 排列插入 CDR。
[0036]在另一方面，本發(fā)明延及抗NGF抗體或其NGF結合片段，所述抗體或抗體結合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含以下中的至少一個:
[0037]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24組成的FRl框架區(qū)；
[0038]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25組成的FR2框架區(qū)；
[0039]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27組成的FR3框架區(qū)；
[0040]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 28組成的FR4框架區(qū)；
[0041]所述重鏈可變區(qū)，包含以下中的至少一個:
[0042]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:29組成的FRl框架區(qū)；
[0043]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:30組成的FR2框架區(qū)；
[0044]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32組成的FR3框架區(qū)；
[0045]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成的FR4框架區(qū)。
[0046]通常，輕鏈⑶R和`重鏈⑶R衍生自對犬NGF具有結合特異性的抗體。
[0047]通常，本發(fā)明犬源化抗犬NGF抗體的產(chǎn)生不需要待引入輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域的框架區(qū)內(nèi)的回復突變。
[0048]在某些實施方案中，包含以上描述的所述至少一個框架區(qū)的輕鏈可變結構域與犬來源的輕鏈恒定結構域結合，犬衍生輕鏈恒定結構域通常為輕鏈K恒定結構域，但任選地為λ輕鏈。在某些實施方案中，所述輕鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:23或SEQ IDNO:24的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或SEQ ID NO: 27的FR3區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 28的FR4區(qū)，或與前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少于5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0049]在某些另外的實施方案中，包含以上描述的至少一個框架區(qū)的重鏈可變區(qū)與犬衍生重鏈恒定結構域結合。在某些實施方案中，恒定結構域的氨基酸序列沒有任何翻譯后修飾，或者可以被修飾以除去可能經(jīng)歷N-連接或O-連接糖基化的任何殘基或全部殘基，這樣使得恒定結構域未被糖基化。在某些實施方案中，重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO:31或SEQID NO: 32的FR3區(qū)和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 33的FR4區(qū)，或具有與前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0050]在某些另外的實施方案中，可以對本文描述的框架區(qū)進行修飾。也就是說，
【發(fā)明者】確認，對于每一框架區(qū)中的一些殘基來說，可以為指定位置選擇氨基酸。重要的是，這些框架區(qū)修飾不會導致互補性決定區(qū)的構象改變，這是由于這可以改變所得抗體的結合特異性和/或親和性。在某些實施方案中，本發(fā)明延及將2個或以上氨基酸取代引入到輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸殘基。
[0051]因此，在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及多肽，例如包含具有FRl區(qū)的輕鏈可變結構域的抗體或其抗原結合片段，所述FRl區(qū)包含被以下氨基酸取代(其中氨基酸用其單字母代碼表示)中的一個或多個修飾的氨基酸序列SEQ ID NO:23，即位置3的氨基酸殘基Q (Q3)被氨基酸殘基V取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，以及T22被S取代。此外，還可以提供一個或多個以下取代:T5被I取代，Α9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，Ε16被D取代，Ε17被D取代，Κ18被A、E或L取代，Τ22被Y取代，以及C23被Y取代。
[0052]在某些另外的實施方案中，其中輕鏈可變區(qū)具有包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的FRl區(qū)，其可以被一個或多個以下氨基酸取代來修飾:位置3的氨基酸殘基V(V3)被氨基酸殘基Q取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，以及T22被S取代。此外，還可以提供一個或多個以下取代:T5被I取代，Α9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，Ε16被D取代，Ε17被D取代，Κ18被A、E或L取代，Τ22被Y取代，以及C23被Y取代。
[0053]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的輕鏈FR2區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:Υ2被F取代，Q3被R取代，Α9被S取代，Kll被Q取代，以及L12被R取代。此外，Υ2可以被I或L取代，Q3可以被I或L取代，Q4可以被H取代，Κ5可以被R取代，Ρ6可以被A或S取代，G7可以被D取代，Α9可以被P或T取代，Kl I可以被E或R取代，L12可以被A、G、P或S取代，114可以被L取代，以及Y15可以被E、F、N、S或V取代。
[0054]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的輕鏈FR3區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:S4被D取代，E14被D取代，Y15被F取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，N20被S取代，L22被V取代，S24被P取代，V27被A取代，以及F31被Y取代。此 外，Gl可以被A取代，V2可以被A取代，P3可以被S取代，F(xiàn)6可以被L或V取代，S7可以被I取代，G8可以被A取代，T13可以被A取代，S16可以被R取代，T18可以被R取代，S24可以被A取代，E25可以被D、G、I或N取代，V27可以被G、S或T取代，A28可以被G取代，以及V29可以被I或L取代。
[0055]在某些另外的實施方案中，其中輕鏈可變區(qū)具有包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27的FR3區(qū)，其可以被一個或多個以下氨基酸取代修飾:S4被D取代，E14被D取代，F(xiàn)15被Y取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，S20被N取代，L22被V取代，P24被S取代，V27被A取代，以及Y31被F取代。此外，Gl可以被A取代，V2可以被A取代，P3可以被S取代，F(xiàn)6可以被L或V取代，S7可以被I取代，G8可以被A取代，T13可以被A取代，S16可以被R取代，T18可以被R取代，S24可以被A取代，E25可以被D、G、I或N取代，V27可以被G、S或T取代，A28可以被G取代，以及V29可以被I或L取代。
[0056]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 28的輕鏈FR4區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:E8被D取代。此外，G2可以被S取代，A3可以被P、Q或T取代，G4可以被E取代，T5可以被P取代，K6可以被Q或S取代，V7可以被L或W取代，ES可以被R取代，或L9可以被I取代。
[0057]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:29的重鏈FRl區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代修飾:D10被G取代，N13被Q取代，G15被T取代，G16被E取代，T17被S取代，T19被R取代，V24被A取代，S28被T取代，L29被F取代，以及T30被S取代。此外，El可以被D或G取代，V2可以被E、G、1、L或M取代，Q3可以被A、E、H、K、L、P、R、S或V取代，L4可以被P或V取代，V5可以被A、E、L或M取代，E6可以被A或Q取代，S7可以被F、L或T取代，G9可以被E取代，DlO可以被A、E、N或T取代，Lll可以被Q、R、V或W取代，V12可以被A、I或M取代，N13可以被K或R取代，P14可以被F或T取代，G15可以被A或E取代，G16可以被A取代，T17可以被P取代，L18可以被R取代，T19可以被G、K或V取代，L20可以被I或V取代，S21可以被Y取代，V23可以被A、E、I或L取代，V24可以被G、1、S或T取代，S25可以被G、P或T取代，G26可以被D、R或T取代，F(xiàn)27可以被D、1、L、S、T或V取代，S28可以被A、D、1、L、Μ、N、P或R取代，L29可以被Ι、Μ或V取代，Τ30 可以被 D、G、H、1、K、N、R、V 取代。
[0058]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的重鏈FR2區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:L6被P取代，R8被K取代，Ell被Q取代，G14被A取代。此外，Wl可以被C取代，V2可以被A、F、I或L取代，Q4可以被H或L取代，A5可以被D、G、P、S、T或V取代，G7可以被E、L或R取代，R8可以被A、E、G、M或Q取代，G9可以被D、E、R、T或V取代，LlO可以被F、M或P取代，Ell可以被D、H、L、P或R取代，W12可以被C、F、L、M、S或Y取代，V13可以被F、I或L取代，G14可以被L、S或T取代。
[0059]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:31的重鏈FR3區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:L2被F取代，T5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，Sll被N取代，V13被L取代，F(xiàn)14被Y取代，K16被Q取代，H18被N取代，Q21被R取代，S22被A取代，T2 7被V取代，R32被K取代。此外，Rl可以被Q取代，L2可以被V取代，T3可以被A、I或S取代，14可以被L、M、T或V取代，T5可以被A或F取代，R6可以被K取代，D7可以被E或N取代，T8可以被D、G、I或S取代，S9可以被D、G、P、T或V取代，KlO可以被E、G、M、N、Q或R取代，Sll可以被D、H、K或R取代，T12可以被A、1、M或S取代，V13可以被A、I或M取代，F(xiàn)14可以被H、S或T取代，L15可以被I取代，K16可以被A、D、E、H或R取代，M17可以被L取代，H18可以被D、K、P、R、S或T取代，S19可以被D、G、N、R或T取代，L20可以被V取代，Q21可以被G、1、K、S或T取代，S22可以被D、G、P、T或V取代，E23可以被A、D或V取代，T25可以被A、M或S取代，A26可以被G或V取代，T27可以被F、1、K、L、M或Q取代，Y28可以被H取代，Y29可以被F或H取代，A31可以被C、G、L、M、R、S、T 或 V 取代，R32 被 A、D、E、G、1、L、Μ、N、P、Q、S、T 或 V 取代。
[0060]在某些另外的實施方案中，其中重鏈可變結構域具有包含氨基酸序列SEQ IDNO: 32的FR3區(qū)，其可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:L2被F取代，Τ5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，SI I被N取代，V13被L取代，F(xiàn)14被Y取代，Q16被K取代，H18被N取代，R21被Q取代，S22被A取代，T27被V取代，R32被K取代。此外，Rl可以被Q取代，L2可以被V取代，T3可以被A、I或S取代，14可以被L、M、T或V取代，T5可以被A或F取代，R6可以被K取代，D7可以被E或N取代，T8可以被D、G、I或S取代，S9可以被D、G、P、T或V取代，KlO可以被E、G、M、N、Q或R取代，Sll可以被D、H、K或R取代，T12可以被A、1、M或S取代，V13可以被A、I或M取代，F(xiàn)14可以被H、S或T取代，L15可以被I取代，K16可以被A、D、E、H或R取代，M17可以被L取代，H18可以被D、K、P、R、S或T取代，S19可以被D、G、N、R或T取代，L20可以被V取代，Q21可以被G、1、K、S或T取代，S22可以被D、G、P、T或V取代，E23可以被A、D或V取代，T25可以被A、M或S取代，A26可以被G或V取代，T27可以被F、1、K、L、M或Q取代，Y28可以被H取代，Y29可以被F或H取代，A31 可以被 C、G、L、M、R、S、T 或 V 取代，R32 被 A、D、E、G、1、L、M、N、P、Q、S、T 或 V 取代。
[0061]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 33的重鏈FR4區(qū)可以通過被一個或多個以下氨基酸取代進行修飾:L6被S取代。此外，Wl可以被L取代，G2可以被A或S取代，Q3可以被D、H、P或R取代，T5可以被A、1、N或S取代，L6可以被P、Q或R取代，V7可以被1、L或P取代，T8可以被A、F、1、L、P、S或Y取代，V9可以被A取代，SlO可以被A、C、P或T取代，Sll可以被A、L或P取代。
[0062]在本發(fā)明以上方面的某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是犬源化抗體。
[0063]在本發(fā)明以上方面的某些實施方案中，本發(fā)明的犬源化NGF中和抗體或由其衍生的結合片段與犬NGF (神經(jīng)生長因子)特異性結合且其結合親和性的平衡解離常數(shù)(Kd)為lxl0_8或更小。而且，優(yōu)選該犬源化抗體不與犬內(nèi)存在的任何其他表位交叉反應，并且進一步，當將本發(fā)明的抗體施用于犬時，不產(chǎn)生針對本發(fā)明的抗體的中和抗體。此外，優(yōu)選抗體的恒定結構域不介導任何下游的效應子功能，包括但不限于補體結合和激活、ADCC以及Fe受體結合和激活。
[0064]在本發(fā)明的以上方面的某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段在犬中的血清半衰期為至少一周。通常，血清半衰期是至少8天。通常，該抗體在犬中不是免疫原性的。
[0065]在本發(fā)明的以上方面的某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段是純化的或通過包括陰離子交換層析、疏水作用層析和尺寸排阻層析等方法被純化。在可選的實施方案中，抗體或其抗原結合片段是純化的或通過包括Captoadhere親和層析之后進行陰離子交換層析的方法純化。
[0066]在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段并不介導下游的效應子功能。通常，該抗體或結合片段具有犬重鏈同種型A或D。
[0067]在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面制備抗體的方法來制備犬源化抗體。在某些另外的實施方案中，可以對本發(fā)明的抗體進行重鏈的恒定結構域的氨基酸序列修飾。所述修飾可以包括一個或多個氨基酸殘基的添加、取代或缺失。通常為了改變抗體的功能特性而進行這些氨基酸改變。例如，可以進行氨基酸修飾以防止被抗體恒定結構域介導的下游效應子功能，例如通過防止抗體結合Fe受體、激活補體或誘導ADCC的能力。此外，為了改變當施用于犬時抗體的循環(huán)半衰期，可以對重鏈恒定結構域鉸鏈區(qū)(hinge region)的氨基酸殘基進行修飾。
[0068]本發(fā)明延及結合犬NGF并且隔絕其結合p75或TrkA受體的能力的抗體片段。
[0069]在某些實施方案中，抗體結合片段可以包括被柔性連接體連接以形成單鏈抗體的本發(fā)明的重鏈和輕鏈序列。
[0070]單鏈Fv(scFv)包含VH結構域和VL結構域。VH結構域和VL結構域結合形成革巴結合位點。這兩個結構域通過肽連接體共價連接。scFv分子在N末端需要輕鏈可變結構域的情況下可以具有VL-連接體-VH的形式，或在N末端需要VH結構域的情況下為VH-連接體-VL。因此，在某些另外的實施方案中，抗原結合片段是單鏈Fv(ScFv)抗體片段。在某些另外的實施方案中，抗體結合片段選自Fab抗體片段、Fab’抗體片段、F(ab’)2抗體片段、Fv抗體片段、scFV抗體片段等，但并不限于此。
[0071]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于聯(lián)合療法的多特異性或多價抗體，其包含以不同的結合特異性與其他抗體偶聯(lián)或結合的本發(fā)明的抗NGF抗體或結合片段。多特異性抗體包含對第一 NGF表位有特異性的至少一個抗體或結合片段，和對NGF上存在的另一表位或?qū)Σ煌目乖刑禺愋缘闹辽僖粋€結合位點。多價抗體包含對同一 NGF表位有結合特異性的抗體或抗體結合片段。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明延及包含本發(fā)明的犬源化抗體的四個或更多Fv區(qū)或Fab區(qū)的抗體融合蛋白。另外的實施方案還延及抗體融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗體的一個或多個Fab區(qū)與來自對NGF有特異性的抗體的一個或多個Fab區(qū)或Fv區(qū)。在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及雙特異性抗體，其中本發(fā)明的抗體或其結合片段與對第二靶標有結合特異性的第二抗體或其結合片段連接，所述第二靶標不是NGF。優(yōu)選地，所述第二靶標通過p75或TrkA受體有助于阻止NGF介導的信號傳導?？梢酝ㄟ^本領域技術人員熟知的多種方法或重組方法來制得這樣的多價抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
[0072]本發(fā)明的另一方面提供了抗神經(jīng)營養(yǎng)因子中和抗體，其包含具有氨基酸序列SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的輕鏈可變結構域，和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ IDN0:4的重鏈可變結構域。在某些實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)因子是犬神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0073]本發(fā)明的又一方面提供了治療、抑制或減輕犬的疼痛的方法，該方法包括以下步驟:
[0074]提供治療有效量的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段；以及
[0075]將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
[0076]在某些實施方案中，該抗體是犬源化抗體。
`[0077]在某些實施方案中，該抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQID NO: 3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0078]在某些實施方案中，該抗體包括輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ IDN0:5或SEQ ID NO: 10或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQID NO:1U SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:13和SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、更優(yōu)選為至少98氨基酸同一性的序列。
[0079]在某些實施方案中，抗犬NGF抗體或其抗原結合片段是本發(fā)明的前述方面提供的任何抗犬NGF抗體或其抗原結合片段。
[0080]在某些實施方案中，疼痛是指神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)。特別是,疼痛可以是圍手術期、手術后或外科手術后疼痛。手術后疼痛(post-operative pain)可能在犬的以下任何手術程序后發(fā)生，其包括但不限于矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術、閹割手術等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關的慢性疼痛(腫瘤疼痛)。在某些另外的實施方案中，疼痛與風濕性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎相關或由它們導致。在某些實施方案中，疼痛是炎性疼痛或瘙癢疼痛。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療犬個體的關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括以下步驟:
[0082]提供治療有效量的本發(fā)明的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段；以及
[0083]將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
[0084]在某些實施方案中，該抗體是犬源化抗體。在某些實施方案中，該抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0085]在某些實施方案中，關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥包括選自免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎和相關病癥。
[0086]通常，關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的治療包括減輕、抑制、降低、壓制或延遲與關節(jié)炎病癥相關的或由其引起的疼痛的發(fā)作。
[0087]本發(fā)明的又一方面提供了治療犬個體中由犬NGF表達增加或?qū)GF敏感性增加弓丨起的或與其相關的或?qū)е缕涞牟“Y的方法，所述方法包括以下步驟:
[0088]提供治療有效量的本發(fā)明的犬源化抗犬NGF抗體或其抗原結合片段；以及
[0089]將所述犬源化抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
[0090]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療犬中被NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關的病癥的方法，所述方法包括以下步驟:
[0091] 提供治療有效量的本發(fā)明的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段；以及
[0092]將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
[0093]在某些實施方案中，腫瘤是骨肉瘤。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導腫瘤增殖。
[0094]在某些實施方案中，本發(fā)明的前述方法進一步包括共施用至少一種另外的藥劑的步驟，該藥劑可以提高和/或補足本發(fā)明的抗NGF抗體的功效。例如，該抗體或其抗原結合片段可以與至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇共施用。
[0095]合適的鎮(zhèn)痛劑的實例包括但不限于布托啡喏、丁丙諾啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替唳、嗎啡、納布啡及其衍生物。合適的NSAIDS包括但不限于對乙酰氨基酚、乙酰水楊酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非羅考昔、羅貝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0096]在某些另外的實施方案中，所述至少一種另外的藥劑可以是活性治療劑，其可以是選自抗生素、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗病毒劑或類似藥劑中的一組或多組。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是炎癥介質(zhì)(mediator)的抑制劑,例如PGE受體拮抗劑,免疫抑制劑例如環(huán)孢霉素，或抗炎糖皮質(zhì)激素。在某些另外的實施方案中，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療認知功能障礙或損傷的藥劑，例如老齡犬中日益普遍的失憶或相關病癥。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療心血管疾病的抗高血壓藥劑或者其他化合物，例如以治療高血壓、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一種另外的藥劑可以是利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑或HMG-CoA還原酶抑制劑。
[0097]在某些實施方案中，作為前述方法的一部分，將抗體或抗原結合片段以從約0.01mg/kg體重至約3mg/kg體重,特別是從約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至犬。
[0098]在各種其它方面，本發(fā)明延及包含本發(fā)明任何前述方面的抗體或其結合片段的組合物。在某些實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體。
[0099]本發(fā)明的另一方面提供了用于治療導致犬慢性疼痛或由犬的慢性疼痛引起的疼痛或病癥或通過NGF誘導增殖的腫瘤的藥物組合物，其包含藥學有效量的本發(fā)明的抗體，以及至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0100]在某些實施方案中，所述組合物可以進一步包括至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
[0101]在各種其它方面，本發(fā)明延及編碼本發(fā)明的抗體或抗體結合片段的分離核酸。
[0102]因此，本發(fā)明的另一方面提供了編碼根據(jù)本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗原結合片段的分離核酸。
[0103]在某些實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:3的抗犬NGF抗體或抗體片段的輕鏈可變結構域或具有氨基酸序列SEQ ID N0:5或10的輕鏈。
[0104]在某些另外的實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:2或SEQ IDN0:4的抗犬NGF抗體或抗體片段的重鏈可變結構域或具有選自SEQ ID NO:6-9, SEQ IDNO: 11-14、SEQ ID NO: 15-18 和 SEQ ID NO: 19-22 的氨基酸序列的重鏈。
[0105]在某些實施方案中，所述分離核酸進一步編碼與其可操作地連接的一個或多個調(diào)控序列。
[0106]在另一方面，本方面提供了包含多核苷酸的表達載體，該多核苷酸包含編碼本發(fā)明的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域，或重鏈恒定結構域和/或輕鏈恒定結構域的多核苷酸。在某些實施方案中，所述表達載體進一步包含一個或多個調(diào)控序列。在某些實施方案中，所述載體是質(zhì)?；蚰孓D錄病毒載體。
[0107]本發(fā)明的另一方面提供了并入本發(fā)明的前述方面的表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的任意前述方面的抗體的宿主細胞。
[0108]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生抗犬NGF中和抗體的方法，該方法包括以下步驟:培養(yǎng)本發(fā)明前述方面的宿主細胞以允許該細胞表達抗犬NGF中和抗體。
[0109]本發(fā)明的另一方面提供了純化本發(fā)明的抗犬NGF抗體的方法，包括以下步驟:
[0110](i)陰離子交換層析；
[0111](ii)疏水作用層析；以及
[0112](iii)尺寸排阻層析。
[0113]本發(fā)明的另一方面提供了純化本發(fā)明的抗犬NGF抗體的方法，包括以下步驟:
[0114](i) Captoadhere 親和層析；以及
[0115](ii)陰離子交換層析。
[0116]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗犬NGF犬源化抗體的方法，包括以下步驟:在合適的宿主細胞內(nèi)表達本發(fā)明前述方面的一個或多個多核苷酸/核酸或載體，其表達本發(fā)明抗體的輕鏈和/或重鏈；回收表達的多肽，其可以在一個宿主細胞內(nèi)一起表達或者在不同的宿主細胞內(nèi)單獨表達；以及分離抗體。[0117]本發(fā)明的又一方面提供了治療、減輕或抑制犬的疼痛或者治療通過NGF誘導增殖的腫瘤的方法，所述方法包括:將有效量的本發(fā)明任意前述方面的多核苷酸施用至犬。[0118]本發(fā)明的又一方面提供了本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，用于治療或預防犬的疼痛。
[0119]在某些實施方案中，疼痛是急性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術后疼痛或者由犬的任何手術程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術、閹割手術等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與風濕性關節(jié)炎相關或由其引起。在某些實施方案中，疼痛是炎性疼痛或瘙癢疼痛。
[0120]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，用于治療關節(jié)炎尤其是骨關節(jié)炎和/或風濕性關節(jié)炎。
[0121 ] 本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，用于治療患病犬個體的通過NGF誘導增殖的腫瘤及其相關的病癥、尤其是骨肉瘤。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導腫瘤增殖。
[0122]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段、或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物、或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，在制備用于治療或預防犬的疼痛的藥物中的用途。
[0123]通常，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術后疼痛或者由犬的任何手術程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術、閹割手術等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與風濕性關節(jié)炎相關或由其引起。在某些實施方案中，疼痛是炎性疼痛或瘙癢疼痛。
[0124]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，在制備用于治療、抑制、減輕或預防犬的風濕性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎的藥物中的用途。
[0125]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段、或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物、或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結合片段的核酸或載體，在制備用于治療犬的通過NGF誘導增殖的腫瘤及其相關病癥、尤其是骨肉瘤的藥物中的用途。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導腫瘤增殖。
[0126]本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗犬NGF中和單克隆抗體或其片段的細胞系或其衍生細胞或后代細胞。
[0127]本發(fā)明的又一方面提供了用于治療犬的疼痛、或者用于治療與疼痛相關的病癥、或者用于治療、減輕或抑制與骨關節(jié)炎或風濕性關節(jié)炎相關的疼痛的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明任意前述方面的抗犬NGF抗體或結合片段以及其使用說明。
[0128]本發(fā)明的又一方面提供了體外、離體和體內(nèi)檢測流體中抗犬NGF單克隆抗體的診斷試劑盒，用于確定所述抗體的濃度。該試劑盒可以包含本發(fā)明任意抗體或其結合片段。該試劑盒可以包含使用說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0129]圖1示出根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的犬源化抗體與鼠NGF和犬NGF結合的圖表。
[0130]圖2A-2D示出一系列顯示本發(fā)明的犬源化抗體的蛋白A純化的凝膠。
[0131]圖3示出顯示使用SDS-Page純化犬源化抗體的結果的凝膠。
[0132]圖4示出顯示犬源化抗體抑制TF-1細胞的NGF誘導的增殖的曲線圖。
[0133]圖5示出顯示抗原捕獲的犬源化抗體誘導的補體沉積(complement deposition)的圖表。
[0134]圖6示出犬源化抗NGF輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。下劃線標注根據(jù)Kabat編號識別的三個⑶R區(qū)。特定殘基上方的星號表明犬源化序列與大鼠aDll抗鼠NGF單克隆抗體的氨基酸序列之間序列上的區(qū)別。
[0135]圖7示出犬源化抗NGF重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。下劃線標注根據(jù)Kabat編號識別的三個⑶R區(qū)。特定殘基上方的星號表明犬源化序列與大鼠aDll抗鼠NGF單克隆抗體的氨基酸序列之間序列上的區(qū)別。
[0136]圖8示出犬K輕鏈(caN-kLC)抗體的犬源化抗NGF輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID N0:5)。用黑 體表示可變結構域。
[0137]圖9示出犬IgG-A重鏈(caN-HCA)的犬源化抗NGF重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID N0:6)。用黑體表示可變結構域。
[0138]圖10示出犬IgG-B重鏈(caN-HCB)的犬源化抗NGF重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID N0:7)。用黑體表示可變結構域。
[0139]圖11示出犬IgG-C重鏈(caN-HCC)的犬源化抗NGF重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID N0:8)。用黑體表示可變結構域。
[0140]圖12示出犬IgG-D重鏈(caN-HCD)的犬源化抗NGF重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID N0:9)。用黑體表示可變結構域。
[0141]圖13A示出顯示使用不同稀釋度的SEQ ID No:5和SEQ ID No:7與SEQ ID No: 10和SEQ ID No: 11比較抗犬NGF單克隆抗體與NGF結合的圖表。
[0142]圖14A示出顯示具有HCB和HCC重鏈同種型的抗犬NGF單克隆抗體的N-糖基化和非糖基化(aglycosylated)與NGF結合比較的圖表。圖14B示出顯示來自圖14A的上清液的補體沉積的圖表。
[0143]圖15A和15B示出使用三步法(方法I)定量純化本發(fā)明的抗犬NGF抗體，包括(I)陰離子交換層析，(2)疏水作用層析，以及(3)尺寸排阻層析。圖15A示出通過尺寸排阻HPLC分級的結果。圖15B示出每一步驟后級分的還原性SDS-PAGE凝膠。圖15C和I?示出使用兩步法(方法II)定量純化本發(fā)明的抗犬NGF抗體,包括(I)Captoadhere層析，(2)陰離子交換層析。圖15C是非還原條件和還原條件下的SDS-PAGE分析。泳道I是MWS，泳道2是2 μ g/mL3450樣品和O μ I還原劑，泳道3是4 μ g/mL3450樣品和O μ I還原劑，泳道4是6 μ g/mL3450樣品和O μ I還原劑，泳道5是MWS，泳道6是2 μ g/mL3450樣品和3 μ I還原劑，泳道7是4 μ g/mL3450樣品和3 μ I還原劑，泳道8是6 μ g/mL3450樣品和3 μ I還原劑，以及泳道9是麗S。圖1?是尺寸排阻色譜。[0144]圖16A示出方法I和方法II純化的抗NGF單克隆抗體的比較。圖16A是通過非還原SDS-PAGE和還原SDS-PAGE進行比較。圖16B是通過抗NGF ELISA進行比較。
[0145]圖17示出將抗犬NGF抗體靜脈內(nèi)給藥至狗后，體重(上組)和溫度(下組)是穩(wěn)定的。
[0146]圖18示出靜脈注射至狗后，抗犬NGF單克隆抗體血漿濃度的動力學分析。靜脈注射2mg/kg抗NGF抗體至小獵犬，在指示的時間采集血漿樣品并且通過NGF ELISA檢測抗NGF單克隆抗體。抗犬NGF單克隆抗體具有出人意料的約9天的長消除(β )階段半衰期。
[0147]圖19示出抗犬NGF單克隆抗體減低狗的炎性疼痛。在_1天時將瓷土注射到小獵犬的墊腳中，在O天時注射抗體或或媒介對照，并且通過視覺評分量表估算跛度。
[0148]發(fā)明詳述
[0149]通過大量的試驗，發(fā)明人獲得了大鼠抗-小鼠NGF單克隆抗體(MAb) aDll氨基酸序列，并且出乎意料地用其產(chǎn)生了非免疫原性抗-犬NGF抗體。所得到的非免疫原性抗體，其并不是使用標準CDR移植技術產(chǎn)生的，經(jīng)證明，其顯示了結合犬NGF的高親和性?？贵w中和了犬NGF生物功能，特別是通過抑制NGF基于細胞的受體TrkA和p75的結合。而且，還意外地發(fā)現(xiàn)，當施用至犬時，并不在犬中產(chǎn)生針對它的中和抗體。因此，本發(fā)明的犬源化抗體適合于長期緩解狗的慢性疼痛。
[0150]發(fā)明人利用的產(chǎn)生本發(fā)明抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的方法，導致輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的框架區(qū)內(nèi)存在的特定大鼠(供體)氨基酸殘基被這樣的殘基取代，基于本發(fā)明人的分析，所述殘基會保留CDR區(qū)的構象，并因此保持結合特異性和親合力，同時如果將抗體以不變的形式施用至犬，降低可能導致針對該抗體產(chǎn)生的中和抗體的免疫原性表位的存 在。具體而言，制備本發(fā)明(被稱為PETisation)抗體的方法包括:通過將供體抗體框架區(qū)的序列與衍生自犬的一個抗體或抗體庫的序列進行比較，評價供體(例如大鼠)抗體框架區(qū)的序列施用至犬的適宜性。盡管該比較是在供體序列與靶序列的單個成員之間進行，但是顯而易見的是，與靶序列庫進行比較是優(yōu)選的，因為這將擴展靶標種類中每一 Kabat位置的自然選擇的數(shù)目。這不但將增加供體與靶標之間匹配的可能性，而且還將擴展不存在匹配的取代的選擇。因此，將能夠選擇與供體盡可能緊密的特征的取代。當供體序列與犬序列在任何Kabat數(shù)目或?qū)奈恢貌煌瑫r，修飾供體序列以用犬中該位置的自然的氨基酸殘基來取代正在討論的氨基酸殘基。
[0151]如果需要取代供體免疫球蛋白中存在的氨基酸殘基，通常采用保守取代的原則，其中該氨基酸殘基天然位于犬Kabat位置并且在大小、電荷、疏水性方面與供體序列中被取代的氨基酸盡可能密切相關的氨基酸殘基取代。目的是選擇不引起供體抗體的三維結構擾動或破壞或引起最低程度的擾動或破壞。在某些情況下，將沒有清楚的選擇，并且每一選擇都有利弊。最終的決定可能要求各種可選序列的三維建模甚至表達。然而，通常利用明顯的偏好。作為該步驟的結果，當殘基在靶中是外來的并且該取代氨基酸與被取代的氨基酸盡可能密切相關時，僅對供體序列作出改變。因而，避免了外來表位的產(chǎn)生，但是由于維持了整個三位結構，因此，還維持了親和性和特異性。
[0152]輕鏈恒定結構域和重鏈恒定結構域通常衍生自犬(靶)衍生的抗體。選擇或修飾重鏈恒定結構域，從而使得它們不介導下游的效應子功能。非常意外的是，由于發(fā)現(xiàn)并沒有產(chǎn)生針對本發(fā)明產(chǎn)生的抗體的中和抗體或者產(chǎn)生了最少的所述抗體，因此驚人地發(fā)現(xiàn)該抗體具有長循環(huán)半衰期和重復劑量給藥的相關益處。而且，由于以不影響CDR區(qū)的三位構造的方式進行框架殘基取代，使得其，與期望的靶標的結合特異性沒有變化。
[0153]在人類和小鼠中存在四種主要的IgG同種型，雖然術語是類似的，但它們在行為和功能上是不同的，其包括對細菌產(chǎn)物例如蛋白A和蛋白G的親和性，激活補體依賴性細胞溶解(CDC)的能力以及通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)誘導殺死靶細胞的能力。當將抗體設計為清除具有它們的同源抗原的靶細胞時，用CDC和ADCC活性或“防護的”恒定結構域選擇IgG同種型在臨床上被認為是有益的，例如在腫瘤控制或感染控制方面(例如，為了上述目的，在人類醫(yī)學應用中優(yōu)選人IgGl同種型)。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統(tǒng)被認為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小CDC和ADCC活性的人IgG同種型(例如，在這樣的人類醫(yī)學應用中，常常優(yōu)選IgG4同種型)。已經(jīng)描述了犬免疫系統(tǒng)中的四個不同的免疫球蛋白Y (IgG)重鏈恒定結構域同型(美國專利號5852183，Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology and Immunopathology, 80.259-270)以及單個κ和λ恒定結構域序列。并沒有按照由其介導的功能活性來表征四個犬重鏈恒定結構域A、B、C和D。不管與IgG家族的總體同源性如何，與來自其它物種的家族成員相比，編碼犬IgG的蛋白彼此更接近，因此如果將任一種認為是四種犬同種型的的每一種，那么僅通過同源來限定上述功能是不合適的。當將抗體設計為例如在腫瘤控制或感染控制中清除具有同源抗原的靶細胞時，用CDC和ADCC活性恒定結構域選擇IgG同種型是有利的，例如在人類醫(yī)學應用中優(yōu)選人IgGl同型。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統(tǒng)被認為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小或“非防衛(wèi)”的CDC和ADCC活性的人IgG同型，例如在人類醫(yī)療用途中，選擇IgG4同種型。
[0154]本發(fā)明的抗體包含犬來源的重鏈恒定結構域和犬來源的輕鏈恒定結構域。而且，互補性決定區(qū)衍生自大鼠ct Dll抗-小鼠NGF抗體。a Dll抗體首先描述于Cattaneoet al.(Cattaneo A, Rapposelli B, Calissano P.(1988) “Three distinct types ofmonoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nervegrowth factor”.J Neurochem50 (4): 1003-1010，)。隨后 Ruberti et al.(RubertijF.et al.(1993) “Cloning and Expression of an Ant1-Nerve Growth Factor (NGF)Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach”.Cellular and MolecularNeurobiology.13(5):559-568)克隆了 a Dll 抗體。
[0155]將衍生自a Dll抗體的⑶R區(qū)與本發(fā)明人確定的框架區(qū)序列組合來維持⑶R的三級結構，因此維持了結合特異性，同時當將抗體施用至犬時，阻止針對所述抗體產(chǎn)生中和抗體。
[0156]每一輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域都包含四個框架區(qū)，稱為FR1-FR4。對于這些框架區(qū)中的每一個，本發(fā)明人已經(jīng)確定了每一特定位置的優(yōu)選氨基殘基(所謂的優(yōu)選殘基)，和還可能在該位置提供的可選的氨基酸殘基。以下表1至表8示出每一重鏈和輕鏈的四個框架區(qū)。這些表相對特定框架區(qū)，并且進一步根據(jù)用于沿完整的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的長度識別特定殘基位置的編號系統(tǒng)，提供了氨基酸位置。組I示出的一個殘基或多個殘基是優(yōu)選的殘基，而組2的殘基是可選的殘基。然而，對于涉及該特定位置的組I所示的殘基來說，這些殘基通常不是優(yōu)選的。使用單字母系統(tǒng)確定氨基酸殘基。
[0157]表1-輕鏈可變結構域FRl殘基
【權利要求】
1.一種制備適用于犬的抗體的方法，包括以下步驟: 從犬以外的物種中提供供體抗體，其中所述供體抗體對所述犬中存在的靶抗原具有結合特異性； 將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個犬抗體框架區(qū)氨基酸序列中對應位置存在的每一氨基酸殘基進行比較，以鑒別出所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個犬抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)對應位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及 用所述一個或多個犬抗體中對應位置存在的一個或多個氨基酸殘基取代所述供體抗體中的一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
2.如權利要求1所述的方法，其中取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括:用對應位置存在的與一個或多個被取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述方法進一步包括下述步驟:用來自犬抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結構域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結構域。
4.如權利要求3所述的方法，其中用HCA或HCD型犬恒定結構域取代所述重鏈的恒定結構域。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是神經(jīng)生長因子(NGF)。
6.能夠特異性結合犬神經(jīng)生長因子(NGF)的中和抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗體結合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一'丨生的氨基酸序列。`
7.如權利要求6所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或犬源化抗體。
8.如權利要求6或7所述的抗體或其抗原結合片段，其中通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾所述抗體的重鏈恒定結構域，使得所述恒定結構域并不介導下游的效應子功能。
9.如權利要求6-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 10或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
10.如權利要求6-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含選自SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
11.如權利要求6-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含選自SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
12.如權利要求6-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含選自SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
13.抗犬NGF抗體或其犬NGF結合片段，包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含以下中的至少一個: 由氨基酸序列SEQ ID N0:23或SEQ ID NO:24組成或包含所述氨基酸序列的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:25組成或包含所述氨基酸序列的FR2框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID N0:26或SEQ ID NO:27組成或包含所述氨基酸序列的FR3框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:28組成或包含所述氨基酸序列的FR4框架區(qū)； 所述重鏈可變區(qū)包含以下中的至少一種: 由氨基酸序列SEQ ID NO:29組成或包含所述氨基酸序列的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:30組成或包含所述氨基酸序列的FR2框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32組成或包含所述氨基酸序列的FR3框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成或包含所述氨基酸序列的FR4框架區(qū)。
14.如權利要求13所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQID NO: 23的FRl區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 23通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:氨基酸殘基Q3被V取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，T22被S取代，T5被I取代，A9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，E16被D取代，E17被D取代，K18被A、E或L取代，T22被Y取代，以及C23被Y取代。
15.如權利要求13所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQID NO: 24的FRl區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 24通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:殘基V3被Q取代，T5被M取代，S7被T取代，A9被L取代，L13被V取代，Q15被P或R取代，E16被G取代，K18被T或P取代，V19被A取代，T20被S取代，以及T22被S取代，T5被I取代，A9被P取代，S12被A取代，S14被R或T取代，E16被D取代，E17被D取代，K18被A、E或L取代，T22被Y取代，以及C23被Y取代。
16.如權利要求13-15中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO:25的FR2區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO:25通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:Y2被F取代，Q3被R取代，Α9被S取代，Kl I被Q取代，L12被R取代，Υ2被I或L取代，Q3被I或L取代，Q4被H取代，Κ5被R取代，Ρ6被A或S取代，G7被D取代，Α9被P或T取代，Kll被E或R取代，L12被A、G、P或S取代，114被L取代，以及Υ15被E、F、N、S或V取代。
17.如權利要求13-16中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 26的FR3區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 26通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:S4被D取代，E14被D取代，Y15被F取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，N20被S取代，L22被V取代，S24被P取代，V27被A取代，F(xiàn)31被Y取代，Gl被A取代，V2被A取代，P3被S取代，F(xiàn)6被L或V取代，S7被I取代，G8被A取代，T13被A取代，S16被R取代，T18被R取代，S24被A取代，E25被D、G、I或N取代，V27被G、S或T取代，A28被G取代，以及V29被I或L取代。
18.如權利要求13-16中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 27的FR3區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 27通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:S4被D取代，E14被D取代，F(xiàn)15被Y取代，S16被T取代，L17被F取代，T18被K取代，S20被N取代，L22被V取代，P24被S取代，V27被A取代，Y31被F取代，Gl被A取代，V2被A取代，P3被S取代，F(xiàn)6被L或V取代，S7被I取代，G8被A取代，T13被A取代，S16被R取代，T18被R取代，S24被A取代，E25被D、G、I或N取代，V27被G、S或T取代，A28被G取代，以及V29被I或L取代。
19.如權利要求13-18中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 28的FR4區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 28通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:E8被D取代，G2被S取代，A3被P、Q或T取代，G4被E取代，T5被P取代，K6被Q或S取代，V7被L或W取代，E8被R取代，或L9被I取代。
20.如權利要求13-19中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO:29的FRl區(qū)的重鏈可變結構域，所述SEQ ID NO:29通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:D10被G取代，N13被Q取代，G15被T取代，G16被E取代，T17被S取代，T19被R取代，V24被A取代，S28被T取代，L29被F取代，T30被S取代，El被D或G取代，V2被E、G、1、L或M取代，Q3被A、E、H、K、L、P、R、S或V取代，L4被P或V取代，V5被A、E、L或M取代，E6被A或Q取代，S7被F、L或T取代，G9被E取代，DlO被A、E、N或T取代，Lll被Q、R、V或W取代，V12被A、I或M取代，N13被K或R取代，P14被F或T取代，G15被A或E取代，G16被A取代，T17被P取代，L18被R取代，T19被G、K或V取代，L20被I或V取代，S21被Y取代，V23被A、E、I或L取代，V24被G、1、S或T取代，S25 被 G、P 或 T 取代，G26 被 D、R 或 T 取代，F(xiàn)27 被 D、1、L、S、T 或 V 取代，S28 被 A、D、1、L、M、N、P或R取代，L29被1、M或V取代，T30被D、G、H、1、K、N、R或V取代。
21.如權利要求13-20中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO:30的FR2區(qū)的重鏈可變結構域，所述SEQ ID NO:30通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:L6被P取代，R8被K取代，Ell被Q取代，G14被A取代，Wl被C取代，V2被A、F、I或L取代，Q4被H或L取代，A5被D、G、P、S、T或V取代，G7被E、L或R取代，R8被A、E、G、M或Q取代，G9被D、E、R、T或V取代，LlO被F、M或P取代，Ell被D、H、L、P或R取代，W12被C、F、L、M、S或Y取代，V13被F、I或L取代，G14被L、S或T取代。
22.如權利要求13-21中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 31的F R3區(qū)的重鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 31通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:L2被F取代，T5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，Sll被N取代，V13被L取代，F(xiàn)14被Y取代，K16被Q取代，H18被N取代，Q21被R取代，S22被A取代，T27被V取代，R32被K取代，Rl被Q取代，L2被V取代，T3被A、I或S取代，14被L、M、T或V取代，T5被A或F取代，R6被K取代，D7被E或N取代，T8被D、G、I或S取代，S9被 D、G、P、T 或 V 取代，KlO 被 E、G、M、N、Q 或 R 取代，Sll 被 D、H、K 或 R 取代，T12 被 A、1、M或S取代，V13被A、I或M取代，F(xiàn)14被H、S或T取代，L15被I取代，K16被A、D、E、H或R取代，M17被L取代，H18被D、K、P、R、S或T取代，S19被D、G、N、R或T取代，L20被V取代，Q21被G、1、K、S或T取代，S22被D、G、P、T或V取代，E23被A、D或V取代，T25被A、M或S取代，A26被G或V取代，T27被F、1、K、L、M或Q取代，Y28被H取代，Y29被F或H取代，A31 被 C、G、L、M、R、S、T 或 V 取代，R32 被 A、D、E、G、1、L、M、N、P、Q、S、T 或 V 取代。
23.如權利要求13-21中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO: 32的FR3區(qū)的重鏈可變結構域，所述SEQ ID NO: 32通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:L2被F取代，T5被S取代，T8被N取代，S9被A取代，Sll被N取代，V13被L取代，F(xiàn)14被Y取代，Q16被K取代，H18被N取代，R21被Q取代，S22被A取代，T27被V取代，R32被K取代，Rl被Q取代，L2被V取代，T3被A、I或S取代，14被L、M、T或V取代，T5被A或F取代，R6被K取代，D7被E或N取代，T8被D、G、I或S取代，S9被 D、G、P、T 或 V 取代，KlO 被 E、G、M、N、Q 或 R 取代，Sll 被 D、H、K 或 R 取代，T12 被 A、1、M或S取代，V13被A、I或M取代，F(xiàn)14被H、S或T取代，L15被I取代，K16被A、D、E、H或R取代，M17被L取代，H18被D、K、P、R、S或T取代，S19被D、G、N、R或T取代，L20被V取代，Q21被G、1、K、S或T取代，S22被D、G、P、T或V取代，E23被A、D或V取代，T25被A、M或S取代，A26被G或V取代，T27被F、1、K、L、M或Q取代，Y28被H取代，Y29被F或H取代，A31 被 C、G、L、M、R、S、T 或 V 取代，R32 被 A、D、E、G、1、L、M、N、P、Q、S、T 或 V 取代。
24.如權利要求13-23中任一項所述的抗犬NGF抗體或犬NGF結合片段，其包含具有SEQ ID NO:33的FR34區(qū)的輕鏈可變結構域，所述SEQ ID NO:33通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進行修飾:W1被L取代，G2被A或S取代，Q3被D、H、P或R取代，T5被A、1、N或S取代，L6被P、Q 或R取代，V7被1、L或P取代，T8被A、F、1、L、P、S或Y取代，V9被A取代，SlO被A、C、P或T取代，Sll被A、L或P取代。
25.如權利要求13-24中任一項所述的抗體，其中所述抗體具有HCA或HCD型犬恒定結構域。
26.通過權利要求1-5中任一項所述的方法制備的抗體或其結合片段。
27.如權利要求6-26中任一項所述的抗體或其結合片段，其中所述抗體或片段與犬NGF的結合抑制犬NGF結合p75或TrkA犬NGF受體的能力。
28.如權利要求6-27中任一項所述的抗體或結合片段，其以平衡解離常數(shù)為IX10_8或更小的結合親和性與犬NGF特異性結合。
29.如權利要求6-28中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗原結合片段選自單鏈Fv(ScFv)抗體片段、Fab抗體片段、Fab’抗體片段和F(ab’)2抗體片段。
30.如權利要求6-29中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗體是多特異性抗體或多價抗體。
31.如權利要求6-30中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗體或結合片段在犬中的血清壽命為至少一周。
32.如權利要求6-31中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗體或結合片段在犬中不是免疫原性的。
33.如權利要求6-32中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗體通過包括陰離子交換層析、疏水作用層析和尺寸排阻層析的步驟的方法可純化。
34.如權利要求6-33中任一項所述的抗體或結合片段，其中所述抗體通過包括Captoadhere親和層析和陰離子交換層析的步驟的方法可純化。
35.一種治療、抑制或減輕犬疼痛的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是犬源化抗體；以及 將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體是權利要求6-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
37.如權利要求35所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
38.如權利要求35所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包括輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 10或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
39.如權利要求35-38中任一項所述的方法，其中所述疼痛選自神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、圍術期疼痛、手術后疼痛和外科手術后疼痛。
40.如權利要求39所述的方法，其中術后疼痛選自矯形外科手術、軟組織外科手術、卵巢子宮切除術和閹割手術引起的疼痛。
41.一種治療犬個體關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是犬源化抗體；以及 將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體是權利要求6-34中任一項所述的抗體。
43.如權利要求41所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQID NO: 2或SEQ ID NO:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
44.如權利要求41所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包括輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 10或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為選自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
45.如權利要求41-44中任一項所述的方法，其中所述關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥包括選自免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎的病癥。
46.如權利要求41-45中任一項所述的方法，其中所述關節(jié)炎或關節(jié)炎病癥的治療包括減輕、抑制、降低、 壓制或延遲與所述關節(jié)炎病癥相關或由其引起的疼痛的發(fā)作。
47.治療犬個體由犬NGF表達增強或?qū)GF敏感性增強引起的或與其相關的或?qū)е缕洳“Y的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是犬源化抗體；以及 將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
48.如權利要求47所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體是權利要求6-34中任一項所述的抗體。
49.如權利要求47所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
50.如權利要求47所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 10或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含、組成為或基本組成為選自SEQ ID NO:6, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDNO: 14的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
51.治療犬中由NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關的病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗犬NGF抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是犬源化抗體；以及 將所述抗犬NGF抗體或其抗原結合片段施用至有需要的犬。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體是權利要求6-34中任一項所述的抗體。
53.如權利要求51所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結構域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
54.如權利要求51所述的方法，其中所述抗犬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 10或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含組成為或基本組成為選自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
55.如權利要求51-54中任一項所述的方法,其中所述腫瘤是由自分泌或旁分泌NGF誘導增殖的。
56.如權利要求55所述的方法，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
57.如權利要求35-56中任一項所述的方法，其進一步包括共施用至少一種另外的治療劑的步驟。
58.如權利要求57所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇和類固醇。
59.如權利要求57所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自抗生素、抗真菌治療劑、抗原生動物治療劑和抗病毒治療劑。
60.如權利要求57所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自炎癥介質(zhì)的抑制劑、PGE受體拮抗劑、免疫抑制劑、環(huán)孢霉素、抗炎糖皮質(zhì)激素、用于治療認知功能障礙或損傷的藥劑、抗高血壓藥劑、用于治療心血管功能障礙的化合物、利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和HMG-CoA還原酶抑制劑。
61.如權利要求35-60中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結合片段以約0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重的劑量施用至犬。
62.如權利要求35-60中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結合片段以約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至犬。
63.用于治療由犬疼痛引起或?qū)е碌奶弁椿虿“Y或由NGF誘導增殖的腫瘤的藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求6-34中任一項所述的抗犬NGF犬源化抗體或其結合片段，以及至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
64.如權利要求63所述的藥物組合物，還包含至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
65.如權利要求63或64所述的藥物組合物，其中所述導致疼痛的病癥選自風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、瘙癢、炎癥、免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎、急性疼痛、慢性疼痛、外科手術疼痛、外科手術后的疼痛，或所述由NGF誘導增殖的腫瘤是骨肉瘤。
66.分離的核酸，其編碼權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
67.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO:1或SEQ ID N0:3的抗犬NGF抗體或抗體片段的輕鏈可變結構域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5或10的輕鏈。
68.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4的抗犬NGF犬源化抗體或抗體片段的重鏈可變結構域或具有選自SEQ ID NO: 6-9, SEQ ID N0:ll_22的氨基酸序列的重鏈。
69.如權利要求66-68中任一項所述的分離的核酸,其可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列。
70.表達載體,其包含權利要求66-69中任一項所述的核酸。
71.如權利要求70所述的表達載體，其進一步包含一個或多個調(diào)控序列。
72.如權利要求70或71所述的表達載體，其中所述載體是質(zhì)?；蚰孓D錄病毒載體。
73.宿主細胞，其并入了權利要求70-72中任一項所述的表達載體。
74.產(chǎn)生犬源化抗犬NGF中和抗體的方法，所述方法包括:培養(yǎng)權利要求73所述的宿主細胞，以使所述細胞表達犬源化抗犬NGF中和抗體。
75.治療、減輕或抑制犬疼痛或者治療由NGF誘導增殖的腫瘤的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求66-69中任一項所述的核酸施用至所述犬。
76.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段,權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，用于治療或預防犬疼痛。
77.如權利要求76所述的抗體或抗體結合片段，其中所述疼痛選自:急性疼痛、慢性疼痛、圍術期疼痛、手術后疼痛、矯形外科手術引起的疼痛、與軟組織外科手術相關的疼痛、由卵巢子宮切除術引起的疼痛、由閹割手術引起的疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、與癌癥或癌性病癥相關的慢性疼痛以及與風濕性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎相關的或由其引起的疼痛。
78.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段，權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，用于治療關節(jié)炎。
79.如權利要求78中所述的抗體或抗體結合片段，其中所述關節(jié)炎是骨關節(jié)炎、免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎或風濕性關節(jié)炎。
80.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段，權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，用于治療或預防犬個體中由NGF誘導增殖的腫瘤及其相關病癥。
81.如權利要求80所述的抗體或抗體結合片段，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
82.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段，權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，在制備用于治療或預防犬的疼痛的藥物中的用途。
83.如權利按要求82所述的用途，其中所述疼痛選自急性疼痛、慢性疼痛、圍術期疼痛、手術后疼痛、矯形外科手術引起的疼痛、與軟組織外科手術相關的疼痛、由卵巢子宮切除術引起的疼痛、由閹割手術引起的疼痛、與癌癥或癌性病癥相關的慢性疼痛以及與風濕性關節(jié)炎相關的或由其引起的疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎。
84.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段，權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，在制備用于治療、抑制、減輕或預防犬關節(jié)炎的藥物中的用途。
85.如權利按要求84所述的用途，其中所述關節(jié)炎是骨關節(jié)炎、免疫介導的多發(fā)性關節(jié)炎或風濕性關節(jié)炎。
86.權利要求6-34中任一項所述的抗體或抗體結合片段,權利要求63-65中任一項所述的藥物組合物，權利要求66-69中任一項所述的核酸或者權利要求70-72所述的表達載體，在制備用于治療犬中由NGF誘導增殖的腫瘤和其相關病癥的藥物中的用途。
87.如權利按要求86所述的用途，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
88.細胞系或其衍生細胞或后代細胞，其產(chǎn)生權利要求6-34中任一項所述的抗犬NGF中和單克隆抗體或其片段。
89.用于治療犬疼痛、或者用于治療與疼痛相關的病癥、或者用于治療、減輕或抑制與免疫介導關節(jié)炎、骨關節(jié)炎或風濕性關節(jié)炎相關的疼痛、或者用于治療犬中由NGF誘導增殖的腫瘤和其相關病癥的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求6-34中任一項所述的抗犬NGF抗體或結合片段及其使用說明。
90.用于檢測抗犬NGF單克隆抗體或結合片段的診斷試劑盒，其包含權利要求6-34中任一項所述的抗犬NGF抗體或結合片段。
【文檔編號】C07K16/46GK103732622SQ201280033616
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月8日 優(yōu)先權日:2011年5月6日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·吉爾芮 申請人:Nvip私人有限公司