抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備適用于馬的抗體的方法。還提供了與馬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合且中和馬NGF結(jié)合p75或TrkA馬NGF受體的能力的馬源化抗體。本發(fā)明延及編碼所述抗體的核酸和使用所述抗體和/或核酸治療馬的疼痛和關(guān)節(jié)炎的方法。
【專利說明】抗神經(jīng)生長因子抗體及其制備和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及充當(dāng)馬神經(jīng)生長因子的拮抗劑抗體及其片段。本發(fā)明還延及制備這些抗體和片段的方法以及這些抗體和片段在治療馬的與神經(jīng)生長因子相關(guān)的病癥中的治療用途，例如疼痛、疼痛相關(guān)病癥以及與導(dǎo)致疼痛發(fā)作的病癥。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長因子(NGF)是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽鏈、β多肽鏈和Y多肽鏈構(gòu)成。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，其參與許多不同的作用。NGF促進(jìn)感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的生存和分化，并且通過兩類膜結(jié)合受體即低親和性NGF受體ρ75和高親和性NGF受體跨膜酪氨酸激酶TrkA來傳導(dǎo)信號。NGF與TrkA或ρ75的結(jié)合導(dǎo)致感覺神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)。
[0003]已經(jīng)描述了使用NGF拮抗劑治療人類的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.0p.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，國際專利申請W02006/131951描述了人源化形式的大鼠aDll(aDll)單克隆抗體。a Dll抗體對小鼠NGF具有結(jié)合特異性，但已知也與人類和大鼠形式的NGF結(jié)合。在施用至人之前，需要對a Dll大鼠衍生單克隆抗體進(jìn)行人源化，從而使產(chǎn)生的中和抗體最少，該中和抗體是由人類對嚙齒類衍生抗體的抗大鼠抗體(HAMA)反應(yīng)產(chǎn)生的。而且，用人恒定結(jié)構(gòu)域取代小鼠恒定結(jié)構(gòu)域允許選擇下游效應(yīng)子功能。
[0004]目前，通過施用數(shù)種鎮(zhèn)痛劑包括局部和全身麻醉劑、麻醉性鎮(zhèn)痛劑、α2拮抗劑、非類固醇抗炎藥(NSAID)和類固醇來進(jìn)行馬的疼痛管理。這些藥物中的每一種都需要頻繁地施用并且在功效和安全性也有局限性。因此，對于患有慢性疼痛例如患有癌痛或關(guān)節(jié)炎的馬，需要不頻繁施用且持久有效的疼痛緩解。
[0005]雖然已知NGF在馬組織中表達(dá)，但既沒有描述馬NGF的拮抗劑，也沒有在馬中使用阻塞NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)以防止或緩解疼痛。由于不利的中和抗體的產(chǎn)生，因此在馬中使用在其他物種中充當(dāng)抗NGF拮抗劑的已知抗體并不可行。而且，包含馬衍生恒定結(jié)構(gòu)域和衍生自已知的抗NGF抗體例如a Dll的可變結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體的產(chǎn)生，并不能保證與馬NGF結(jié)合。此外，這樣的抗體可以顯示出與馬中可能存在但最初衍生該抗體的物種中不存在的其他靶表位的交叉反應(yīng)。另外，不利的中和抗體的產(chǎn)生將限制該抗體的長期施用，當(dāng)治療與慢性疼痛相關(guān)的病癥或癌性病癥時，這是特別重要的條件。同樣，使用CDR移植或相關(guān)的技術(shù)產(chǎn)生馬源化形式的抗NGF抗體可能導(dǎo)致中和抗體的產(chǎn)生，并且可能進(jìn)一步顯示抗原結(jié)合親和性與親合力的降低。因此，迫切需要用于馬疼痛管理的結(jié)合成員，所述結(jié)合成員充當(dāng)馬NGF的拮抗劑，并且保持高水平的結(jié)合親和性與親合力，同時避免針對其的中和抗體的產(chǎn)生。
[0006]發(fā)明概述
[0007]經(jīng)過大量的努力，本發(fā)明人意外制備了特異性結(jié)合馬NGF的馬源化抗體及其來源的結(jié)合片段。出乎意料地，本文表明，本發(fā)明的抗體及其結(jié)合片段與馬NGF的結(jié)合，通過抑制馬NGF與高親和性TrkA受體或與ρ75受體的結(jié)合，隔離了馬NGF的生物活性。這反過來阻止了感知神經(jīng)元中神經(jīng)肽的上調(diào)，結(jié)果減輕或消除了痛覺。已經(jīng)使用重組DNA方法產(chǎn)生了抗體，使得該抗體基本上是非免疫原性的，也就是說，在施用至馬個體時，并未產(chǎn)生針對該抗體的中和抗體。由于使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如CDR移植等并未產(chǎn)生抗體，因此這樣的發(fā)現(xiàn)是令人驚訝且完全出乎意料的。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了制備適合用于馬中的抗體的方法，其包括或基本上由以下步驟組成:
[0009]從馬之外的物種提供供體抗體，其中所述供體抗體對馬中存在的靶抗原有結(jié)合特異性；
[0010]將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個馬抗體的框架區(qū)的氨基酸序列中對應(yīng)位置的每一氨基酸殘基比較，以鑒別出所述供體受體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個馬抗體的框架區(qū)的氨基酸序列的對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及
[0011]用存在于一個或多個馬抗體中對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基來取代所述供體抗體中一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0012]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了修飾馬中使用的供體抗體的方法，這樣的方法使得修飾的抗體的框架區(qū)內(nèi)的任何位置不含有在馬中的該位置將是外來的任何氨基酸。因此，修飾的抗體保持了供體抗體對靶抗原的特異性和親和性，但重要的是修飾并沒有產(chǎn)生潛在的外來表位。因此，在馬中，修飾的抗體不被看做外來的，并且尤其是在長期施用后，也沒有在馬中引起可能導(dǎo)致抗體功效的中和的免疫反應(yīng)。
`[0013]在某些實施方案中，取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括，用存在于對應(yīng)位置的與所述一個或多個取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基來取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
[0014]在某些實施方案中，該方法還包括用衍生自馬抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域置換所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的步驟。通常，該重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域被HC2馬恒定結(jié)構(gòu)域取代。
[0015]在某些實施方案中，靶抗原是神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0016]本發(fā)明第一方面的方法并不包括CDR移植。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備的抗體包含供體抗體的CDR、根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法制備的馬源化框架區(qū)，以及馬恒定結(jié)構(gòu)域。
[0017]本發(fā)明延及根據(jù)本發(fā)明的第一方面例如以下的描述制備的抗體。
[0018]因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了特異性結(jié)合馬神經(jīng)生長因子(NGF)的馬源化抗體或其結(jié)合片段。通常，當(dāng)與NGF結(jié)合時，馬源化抗體或其結(jié)合片段中和NGF生物功能。也就是說，馬源化抗體或結(jié)合片段與NGF的結(jié)合隔離了 NGF與TrkA受體或與p75受體結(jié)合的能力。在某些實施方案中，馬源化抗體或其結(jié)合片段與NGF結(jié)合的結(jié)合親和力Kd為lxlO—8或更小。通常，該馬源化抗體在馬中不是免疫原性的。
[0019]在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的制備抗體的方法來制備該馬源化抗體。
[0020]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與馬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，該抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0021]在一些實施方案中，中和抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是馬源化抗體，即具有已經(jīng)去免疫的氨基酸序列的抗體，從而，當(dāng)施用至馬個體后，并不產(chǎn)生針對其的中和抗體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的制備抗體的方法來制備馬源化抗體。通常通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，從而使得恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。典型地是，所述重鏈?zhǔn)邱RHC2或HC6重鏈。已經(jīng)顯示這些同種型缺乏效應(yīng)子功能(Lewis et al, MolImmunol.2008Feb; 45 (3):818-827)。更典型地是，所述重鏈?zhǔn)邱RHC2重鏈。本發(fā)明人已經(jīng)證明，通過與蛋白A結(jié)合可純化這種同種型。
[0022]在一些實施方案中，抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:4或與其具有至少85、90、95或99%序列同源性的氨基酸序列的輕鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0023]在本發(fā)明的另一或相關(guān)方面，提供了中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與馬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，該抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含氨基酸序列SEQ ID N0:2或與其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度。
[0024]通常，重鏈(VH)的可變區(qū)與包含至少一個免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的另一氨基酸序列結(jié)合。在某些實施方案中，免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域衍生自子類IgG(免疫球蛋白G)抗體，以形成本發(fā)明的馬源化抗體的完整重鏈。已知七種不同的馬免疫球蛋白Y (IgG)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。通常，所述恒定結(jié)構(gòu)域包含CH1、CH2和CH3以及位于所述CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間的合適的連接體(或鉸鏈“hinge”)。通常，本發(fā)明的抗馬NGF抗體包含與恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中該恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能例如補體結(jié)合、ADCC、Fe受體結(jié)合等。
[0025]這樣的重鏈可以包含具有HC2或HC6同種型的重鏈，并且可以具有氨基酸序列SEQID N0:5、6或7。更典型地是，所述重鏈?zhǔn)邱RHC2重鏈。
[0026]在某些實施方案中，抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含涉及馬恒定結(jié)構(gòu)域IgG2(HC2)的SEQ ID NO: 6或涉及馬恒定結(jié)構(gòu)域IgG6 (HC6)的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0027]在某些另外的實施方案中，抗體或結(jié)合片段可以包含其中恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基被取代或缺失以阻止該殘基糖基化的重鏈。該恒定結(jié)構(gòu)域的殘基的去糖基化可以通過阻止恒定結(jié)構(gòu)域(Fe域)與細(xì)胞上的Fe受體(FcR)結(jié)合來限制下游的效應(yīng)子功能。因此，在某些另外的實施方案中，抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:包含SEQID NO: 8 (IgG2 (HC2)的非糖基化形式)和SEQ ID NO: 9 (IgG6 (HC6)的非糖基化形式)的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的重鏈。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0028]在另一個或相關(guān)的方面，本發(fā)明延及中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠與馬神經(jīng)生長因子(NGF)特異性結(jié)合，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含或由以下組成或基本上由以下組成:輕鏈和重鏈，其中輕鏈(VL)的可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中重鏈(VH)的可變區(qū)包含、組成為或基本組成為:與氨基酸序列SEQ ID N0:2相同或基本上同源的氨基酸序列或與其具有至少85、90、95或99%序列同一'丨生的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同一'I"生是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0029]在某些實施方案中，抗體或結(jié)合成員(binding member)包含輕鏈,所述輕鏈包含、組成為或基本組成為:氨基酸序列SEQ ID NO:4或與其具有至少85%、優(yōu)選為95%、更優(yōu)選為至少98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0030]在某些實施方案中,抗體或結(jié)合成員包含重鏈,所述重鏈包含、組成為或基本組成為:SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選至少98%同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0031]通常，通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾所述抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使得恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。通常，所述重鏈?zhǔn)邱RHC2或HC6重鏈。所述重鏈更典型地是馬HC2重鏈。在某些實施方案中，抗體或結(jié)合成員包含重鏈，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選至少98%同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6包含HC2重鏈，已經(jīng)顯示其缺乏效應(yīng)子功能，但是其可以使用蛋白A柱純化。這允許在制造中大規(guī)模純化具有HC2重鏈的抗體，因而是有益的。
[0032]在某些實施方案中，抗體可以與至少受體分子綴合。
[0033]在某些另外的實施方案中，可以取代或缺失恒定結(jié)構(gòu)域中的至少一個殘基，以防止該殘基的糖基化。因此，在某些另外的實施方案中，抗體或抗體結(jié)合片段包含、組成為或基本組成為:重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID N0:8或9的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選至少98%同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0034]本發(fā)明人進(jìn)一步限定了一系列可以與互補性決定區(qū)(CDRs)結(jié)合以形成馬源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域和馬化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)(FR)。每一個重鏈結(jié)構(gòu)域和輕鏈結(jié)構(gòu)域都具有4個框架區(qū)，稱為FR1、FR2、FR3和FR4。
[0035]抗體分子可以包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關(guān)的插入框架區(qū)。重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)⑶R稱為HCDRs，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列位置可以找到這些 CDRs: HCDRl - Kabat 殘基 31-35、HCDR2 - Kabat 殘基 50-65、HCDR3 - Kabat 殘基95-102 (Kabat EA et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest (具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列)，5th edition.Bethesda:US Department of Health andHuman Services,)。
[0036]而且，抗體進(jìn)一步包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)以及相關(guān)的插入框架區(qū)。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)⑶R稱為IXDRs，根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)在下列位置可以找到這些 CDRs: LCDRl - Kabat 殘基 24-34、LCDR2 - Kabat 殘基 50-56、LCDR3 - Kabat 殘基89-97。
[0037]輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含四個框架區(qū)，？町、？1?2、？1?3和？1?4，以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 排列插入 CDR。
[0038]在另一方面或相關(guān)方面，本發(fā)明延及抗NGF抗體或其NGF抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含以下中的至少一個:
[0039]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 10組成的FRl框架區(qū)；
[0040]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 11組成的FR2框架區(qū)；
[0041]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 12組成的FR3框架區(qū)；
[0042]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 13組成的FR4框架區(qū)； [0043]所述重鏈可變區(qū)，包含以下中的至少一個:
[0044]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 14組成的FRl框架區(qū)；
[0045]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 15組成的FR2框架區(qū)；
[0046]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 16組成的FR3框架區(qū)；
[0047]包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 17組成的FR4框架區(qū)。
[0048]通常，輕鏈⑶R和重鏈⑶R衍生自對NGF、優(yōu)選馬NGF具有結(jié)合特異性的抗體。
[0049]通常，本發(fā)明馬源化抗馬NGF抗體的產(chǎn)生不需要待引入輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)內(nèi)的回復(fù)突變。
[0050]在某些實施方案中，包含以上描述的所述至少一個框架區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與馬來源的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，馬衍生輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常為輕鏈K恒定結(jié)構(gòu)域，但任選地為λ輕鏈。在某些實施方案中，所述輕鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的FR3區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:13的FR4區(qū)，或與前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少于5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0051]在某些另外的實施方案中，包含以上描述的至少一個框架區(qū)的重鏈可變區(qū)與馬衍生重鏈恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在某些實施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列沒有任何翻譯后修飾，或者可以被修飾以除去可能經(jīng)歷N-連接或O-連接糖基化的任何殘基或全部殘基，這樣使得恒定結(jié)構(gòu)域未被糖基化。在某些實施方案中，重鏈包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的FRl區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的FR2區(qū)，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16的FR3區(qū)和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17的FR4區(qū)，或具有與前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架區(qū)。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約5個氨基酸，優(yōu)選約10個氨基酸的長度上。
[0052]在某些另外的實施方案中，可以對本文描述的框架區(qū)進(jìn)行修飾。也就是說，
【發(fā)明者】確認(rèn)，對于每一框架區(qū)中的一些殘基來說，可以為指定位置選擇的氨基酸。重要的是，這些框架區(qū)修飾不會導(dǎo)致互補性決定區(qū)的構(gòu)象改變，這是由于這可以改變所得抗體的結(jié)合特異性和/或親和性。在某些實施方案中，本發(fā)明延及將2個或以上氨基酸取代引入到輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸殘基。
[0053]因此，在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及多肽，例如包含具有FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述FRl區(qū)包含被以下氨基酸取代(其中氨基酸用其單字母代碼表示)中的一個或多個修飾的氨基酸序列SEQ ID NO: 10,即位置2的氨基酸殘基I (12)被氨基酸殘基V取代，S7是T，A9是E，Lll是V，S12是T或A，A13是V，S14是T，E17是Q，T18是R，T20是E，121是1、L、M或V，以及E22是K。此外，還可以提供一個或多個以下取代:D1是G、K或V，12是F、N、S或T，V3是A、G、I或M，M4是L、Q或￥，了5是八或I，S7 是 F，A9 是 D、P 或 S，SlO 是 F、L 或 T，Lll 是 S，S12 是 E 或 V, A13 是 L、Q 或 T，S14 是A 或 P，L15 是 P 或 R，G16 是 R，T18 是 S、G 或 K，V19 是 A，T20 是 D 或 V，121 是 T，以及 E22是 L、N、Q、R、S 或 T。
[0054]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的輕鏈FR2區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:K5是R，Q8是E，S9是A，Kll是R或E，L12是R。此外，還可以提供一個或多個以下取代:Υ2是F或H，Q3是R或S，Q4是H、K、R或V，Κ5是V，Ρ6 是 1、L或S，S9 是 P、R、V或 T，PlO 是 L，Kll 是 I 或L，L12 是 A、E、G、H、Q 或 W，L13 是
F、1、M或 V，114 是 F、T、M 或 V，以及 Y15 是 A、C、D、E、F、G、H、Q、R、S、T 或 V。
[0055]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的輕鏈FR3區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代進(jìn)行修 飾:S4是D，F(xiàn)6是Y，D14是E，Y15是F，S16是T，N20是S，S24是A，S29是1、S或T，以及F31是Y。此外，還可以提供一個或多個以下取代:G1是D或F，V2 是 A 或 F，P3 是 L 或 S，S4 是 A、E、G 或 L，F(xiàn)6 是 L，S7 是 C、F、G、N、R 或 T，G8 是 A，S9是03、6、1(、1?、1'或胃，GlO 是 A、R 或 V，Sll 是 A、F、T 或 Y，G12 是 E 或 T，T13 是 A、S 或 W，S16 是 A 或 V，L17 是 F 或 P，T18 是 A、1、S 或 V，119 是 V，N20 是 D、G 或 T，S21 是 D、E、P、R 或 T，Q23 是 E 或 R，S24 是 E 或 T，E25 是 A、D、G 或 T，D26 是 N，V27 是 A、L、E、G 或 S，A28是 G，S29 是 D、E、F、L、M、N 或 V，Y30 是 C，以及 F31 是 H、S、T、V 或 W。
[0056]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的輕鏈FR4區(qū)可以被以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:L9是I。此外，還可以提供一個或多個以下取代:F1是I或L，Q3是L，T5是S，K6是M、N或R，L7是M或V，E8是A、D或K，L9是F、M或V，以及KlO是A、E、
G、1、Q、R、T或 V。
[0057]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的重鏈FRl區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:N13可以是K。此外，還可以提供一個或多個以下取代:K5可以是Q，GlO可以是D，Lll可以是Q，V12可以是M，N13可以是M或R，P14可以是I或S，S15可以是A或G，Q16可以是E，T17可以是A，S19可以是T，T21可以是S或V，T23可以是A、F或S，V24可以是I，S25可以是T，G26可以是A，F(xiàn)27可以是A、G、1、Μ、N、Q或S，S28可以是D、H、1、L、N或P，L29可以是D、S、T或V，以及Τ30可以是Ε、1、N或R。
[0058]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的重鏈FR2區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:W12是F。此外，還可以提供一個或多個以下取代:V2可以是L，A5可以是P、S或V，K8可以是W，G9可以是R，LlO可以是P或W，W12可以是E、H、R、V或Y，以及G14可以是A、D或S。
[0059]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16的重鏈FR3區(qū)可以被一個或多個以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:T3是S，R6是K，F(xiàn)14是Y，Q16是Τ，Μ17是L，R32是G。此外，Α2可以是C、G、1、T或V，T3可以是D、1、M、N或R，14是V，T5是1、L或S，R6是E或S，D7 是 E 或 N，T8 是 A、E、1、P、S 或 Y，S9 是 E、G、K 或 T，KlO 是 E、L、N、Q 或 R，Sll 是 G、K、N 或 R，Q12 是 E、H 或 R，V13 是 A、1、L、F 或 S，F(xiàn)14 是 L、R、S、T 或 V, L15 是 V，Q16 是 I，M17 是 V, N18 是 D、K、R、S 或 T, S19 是 D、E、G、K、M 或 T, L20 是 M 或 V, T21 是 S，S22 是 D、E、G 或 R，E23 是 D 或 G，T25 是 A，A26 是 S，V27 是 D，Y29 是 A、F、I 或 W，A31 是 E、G、1、S、T 或 V，以及 R32 是 A、E、G、H、1、K 或 S。
[0060]在某些另外的實施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 17的重鏈FR4區(qū)可以被以下氨基酸取代進(jìn)行修飾:Q3是P。
[0061]在本發(fā)明以上方面的某些實施方案中，抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是馬源化抗體。
[0062]在本發(fā)明以上方面的某些實施方案中，本發(fā)明的馬源化NGF中和抗體或由其衍生的結(jié)合片段與馬NGF (神經(jīng)生長因子)特異性結(jié)合且其結(jié)合親和性的平衡解離常數(shù)(Kd)為lxl0_8或更小。而且，優(yōu)選該馬源化抗體不與馬內(nèi)存在的任何其他表位交叉反應(yīng)，并且進(jìn)一步，當(dāng)將本發(fā)明的抗體施用于馬時，不產(chǎn)生針對本發(fā)明的抗體的中和抗體。此外，優(yōu)選抗體的恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)任何下游的效應(yīng)子功能，包括但不限于補體結(jié)合和激活、ADCC以及Fe受體結(jié)合和激活。在某些另外的實施方案中，可以對本發(fā)明的抗體進(jìn)行重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列修飾。所述修飾可以包括一個或多個氨基酸殘基的添加、取代或缺失。通常為了改變抗體的功能特性而進(jìn)行所述氨基酸改變。例如，可以進(jìn)行氨基酸修飾以防止被抗體恒定結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的下游效應(yīng)子功能，例如通過防止抗體結(jié)合Fe受體、激活補體或誘導(dǎo)ADCC的能力。此外，為了改變當(dāng)施用于馬時抗體的循環(huán)半衰期，可以對重鏈恒定結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)(hinge region)進(jìn)行修飾。
[0063]通常，通過氨基酸取代或缺失來選擇或修飾抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使得該恒定結(jié)構(gòu)域不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。`通常，所述重鏈?zhǔn)邱RHC2或HC6重鏈。更典型地是，所述重鏈為馬HC2重鏈。
[0064]在另一或相關(guān)方面，本發(fā)明延及特異性結(jié)合一種或多種馬可溶性蛋白的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能，并且所述抗體可通過結(jié)合蛋白A純化。
[0065]在某些實施方案中，所述一種或多種可溶性蛋白選自:CSF、白細(xì)胞介素、生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。在某些實施方案中，所述一種或多種可溶性蛋白是神經(jīng)營養(yǎng)因子。在某些實施方案中，所述一種或多種可溶性蛋白是NGF。
[0066]在某些實施方案中，所述抗體包含通過氨基酸取代或缺失的方式選擇或修飾的重鏈，使得所述抗體不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。
[0067]在某些實施方案中，所述抗體包含具有HC2同種型的重鏈。已經(jīng)證明，含有HC2同種型的抗體缺乏效應(yīng)子功能，并且可使用蛋白A柱層析或蛋白A親和色譜將其純化。
[0068]在某些實施方案中，該抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85，90，95或99%序列同一性的氨基酸序列，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)包含、組成為或基本組成為:與氨基酸序列SEQ ID N0:2相同或基本上同源的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述同源性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸，更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0069]在某些實施方案中，所述抗體包括輕鏈，該輕鏈包含、組成為或基本組成為:氨基酸序列SEQ ID NO: 4或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選95%、更優(yōu)選至少98%氨基酸同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸、更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0070]在某些實施方案中，所述抗體包括重鏈,該重鏈包含、組成為或基本組成為:氨基酸序列SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6，或與所述氨基酸序列具有至少85%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選至少98%同一性的序列。在某些實施方案中，所述同一性是在至少約15個氨基酸，優(yōu)選約20個氨基酸、更優(yōu)選約25個氨基酸的長度上。
[0071]在某些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。通常，所述抗體是馬源化抗體。
[0072]在某些另外的實施方案中，本發(fā)明的抗體或由其衍生的結(jié)合片段與馬NGF(神經(jīng)生長因子)特異性結(jié)合且其結(jié)合親和性的平衡解離常數(shù)(Kd)為1χ10_8或更小。而且，優(yōu)選該馬源化抗體不與馬內(nèi)存在的任何其他表位交叉反應(yīng)，并且進(jìn)一步，當(dāng)將本發(fā)明的抗體施用于馬時，不產(chǎn)生針對本發(fā)明的抗體的中和抗體。
[0073]在某些實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。通常，所述抗體或結(jié)合片段具有馬重鏈亞型HC2。
[0074]在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的制備抗體的方法來制備馬源化抗體。
[0075]本發(fā)明延及結(jié)合馬`NGF且隔離其結(jié)合馬p75受體和馬TrkA受體能力的抗體片段。
[0076]在某些實施方案中，本發(fā)明的任一抗體的抗體結(jié)合片段可以包含通過柔性連接體連接以形成單鏈抗體的本發(fā)明的重鏈和輕鏈序列。
[0077]單鏈Fv(scFv)包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成革巴結(jié)合位點。這兩個結(jié)構(gòu)域通過肽連接體共價連接。scFv分子在N末端需要輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的情況下可以具有VL-連接體-VH的形式，或在N末端需要VH結(jié)構(gòu)域的情況下為VH-連接體-VL。因此，在某些另外的實施方案中，抗原結(jié)合片段是單鏈Fv(ScFv)抗體片段。在某些另外的實施方案中，抗體結(jié)合片段選自Fab抗體片段、Fab’抗體片段、F(ab’)2抗體片段、Fv抗體片段、sFV抗體片段等，但并不限于此。
[0078]在某些另外的實施方案中，本發(fā)明提供了用于聯(lián)合療法的多特異性或多價抗體，其包含以不同的結(jié)合特異性與其他抗體偶聯(lián)或結(jié)合的本發(fā)明的抗NGF抗體或結(jié)合片段。多特異性抗體包含對第一 NGF表位有特異性的至少一個抗體或結(jié)合片段，和對馬NGF上存在的另一表位或?qū)Σ煌目乖刑禺愋缘闹辽僖粋€結(jié)合位點。多價抗體包含對同一馬NGF表位有結(jié)合特異性的抗體或抗體結(jié)合片段。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明延及包含本發(fā)明的馬源化抗體的四個或更多Fv區(qū)Fab區(qū)的抗體融合蛋白。另外的實施方案還延及抗體融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗體的一個或多個Fab區(qū)與來自對馬NGF有特異性的抗體的一個或多個Fab區(qū)或Fv區(qū)。在某些另外的實施方案中，本發(fā)明延及雙特異性抗體，其中本發(fā)明的抗體或其結(jié)合片段與對第二靶標(biāo)有結(jié)合特異性的第二抗體或其結(jié)合片段連接，所述第二靶標(biāo)不是馬NGF。優(yōu)選地，所述第二靶標(biāo)通過p75或TrkA受體有助于阻止NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法或重組方法來制得這樣的多價抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
[0079]本發(fā)明的另一方面提供了抗神經(jīng)營養(yǎng)因子中和抗體，其包含具有氨基酸序列SEQID NO:1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，和/或具有氨基酸序列SEQ ID NO: 2的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)因子是馬神經(jīng)生長因子(NGF)。
[0080]本發(fā)明的又一方面提供了治療、抑制或減輕馬的疼痛的方法，該方法包括以下步驟:
[0081]提供治療有效量的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是馬源化抗體；以及
[0082]將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
[0083]在某些實施方案中，該馬源化抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少95%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或與所述氨基酸序列具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
[0084]在某些實施方案中，該馬源化抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO: 4或與所述氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQ IDN0:9的氨基酸序列，和與前述氨基酸序列具有至少95%、更優(yōu)選至少98氨基酸同一性的序列。
[0085]在某些實施方案中，該馬源化抗體或其抗原結(jié)合片段是本發(fā)明的前述方面提供的任何抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0086]在某些實施方案中，疼`痛是指神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)。特別是,疼痛可以是手術(shù)后或外科手術(shù)后疼痛。手術(shù)后疼痛(post-operativepain)可能在馬的以下任何手術(shù)程序后發(fā)生，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛(腫瘤疼痛)。在某些另外的實施方案中，疼痛與炎性疼痛、瘙癢疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)或由它們導(dǎo)致。在某些另外的實施方案中，疼痛是與腳掌疼痛、太陽下瘀傷(subsolar bruising)、蹄葉炎、蹄膿腫、后顯示外傷(post showing trauma)、比賽后創(chuàng)傷(post race trauma)、舟骨綜合癥和近端懸韌帶炎(proximal suspensory desmitis)相關(guān)或由它們導(dǎo)致。
[0087]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療馬個體的關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括以下步驟:
[0088]提供治療有效量的本發(fā)明的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0089]將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
[0090]在某些實施方案中，該抗體是馬源化抗體。在某些實施方案中，該馬源化抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
[0091]在某些實施方案中，關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥包括選自免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和相關(guān)病癥的病癥。
[0092]通常，關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥的治療包括減輕、抑制、降低、壓制或延遲與關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)的或由其引起的疼痛的發(fā)作。
[0093]本發(fā)明的又一方面提供了治療馬個體中對NGF敏感性增加引起的或與其相關(guān)的或?qū)е缕涞牟“Y的方法，所述方法包括以下步驟:
[0094]提供治療有效量的本發(fā)明的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0095]將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
[0096]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療馬中被NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟:
[0097]提供治療有效量的本發(fā)明的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段；以及
[0098]將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
[0099]在某些實施方案中，腫瘤是骨肉瘤。在某些實施方案中，自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0100]在某些實施方案中，本發(fā)明的前述方法進(jìn)一步包括共同施用至少一種另外的藥劑的步驟，該藥劑可以提高和/或補足本發(fā)明的抗NGF抗體的功效。例如，該抗體或其抗原結(jié)合片段可以與至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇、類固醇、透明質(zhì)酸(hyaluronan)或透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)共同施用。
[0101]合適的鎮(zhèn)痛劑的實例包括但不限于布托啡喏、丁丙諾啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替唳、嗎啡、納布啡及其衍生物。合適的NSAIDS包括但不限于對乙酰氨基酚、乙酰水楊酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非羅考昔、羅貝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
[0102]在某些另外的實施方案中，所述至少一種另外的藥劑可以是活性治療劑，其可以是選自抗生素、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗病毒劑或類似藥劑中的一組或多組。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是炎癥介質(zhì)(mediator)的抑制劑,例如PGE受體拮抗劑,免疫抑制劑例如環(huán)孢霉素，抗炎糖皮質(zhì)激素。在某些另外的方面，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療認(rèn)知紊亂或損傷的藥劑，例如老齡馬中日益普遍的失憶或相關(guān)病癥。而且，所述至少一種另外的藥劑可以是用于治療心血管疾病的抗高血壓藥物或者其他化合物，例如以治療高血壓、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一種另外的藥劑可以是利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑或HMG-CoA還原酶抑制劑、苯基丁氮酮、透明質(zhì)酸、多硫酸化粘多糖(polysulphatedglycosaminoglycan)、白細(xì)胞介素_1受體拮抗劑、IRAP、雙氯芬酸和骨關(guān)節(jié)炎疾病改善藥物。
[0103]在某些實施方案中，作為前述方法的一部分，將抗體或抗原結(jié)合片段以從約
0.01mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量,特別是從約0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至馬。
[0104]在其它方面，本發(fā)明延及包含本發(fā)明任何前述方面的抗體或其結(jié)合片段的組合物。在某些實施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
[0105]本發(fā)明的另一方面提供了用于治療導(dǎo)致馬慢性疼痛或由馬的慢性疼痛引起的疼痛或病癥的藥物組合物，其包含藥學(xué)有效量的本發(fā)明的抗馬NGF馬源化抗體，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0106]在某些實施方案中，所述組合物可以進(jìn)一步包括至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
[0107]在其它方面，本發(fā)明延及編碼本發(fā)明的抗體或抗體結(jié)合片段的分離核酸。
[0108]因此，本發(fā)明的另一方面提供了編碼根據(jù)本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗原結(jié)合片段的分離核酸。
[0109]在某些實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗馬NGF馬源化抗體或抗體片段的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ ID N0:4的輕鏈。
[0110]在某些另外的實施方案中，多核苷酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO: 2的抗馬NGF馬源化抗體或抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:9 的重鏈。
[0111]在某些實施方案中，所述分離核酸進(jìn)一步包含編碼與其可操作地連接的一個或多個調(diào)控序列的核酸。
[0112]在另一方面，本方面提供了包含多核苷酸的表達(dá)載體，該多核苷酸包含編碼本發(fā)明的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。在某些實施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含一個或多個調(diào)控序列。在某些實施方案中，所述載體是質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒載體。
[0113]本發(fā)明的另一方面提供了并入本發(fā)明的前述方面的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的任意前述方面的抗體的宿主細(xì)胞。
[0114]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生馬源化抗馬NGF中和抗體的方法，該方法包括以下步驟:培養(yǎng)本發(fā)明前述方面的宿主細(xì)胞以允許該細(xì)胞表達(dá)馬源化抗馬NGF中和抗體。
[0115]本發(fā)明的又一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗馬NGF馬源化抗體的方法，包括以下步驟:在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明前述方面的一個或多個多核苷酸/核酸或載體，其表達(dá)本發(fā)明抗體的輕鏈和/或重鏈；回收表達(dá)的多肽，其可以在一個宿主細(xì)胞內(nèi)一起表達(dá)或者在不同的宿主細(xì)胞內(nèi)單獨表達(dá)；以及分離抗體。
[0116]本發(fā)明的又一方面提供了治療、減輕或抑制馬的疼痛的方法，所述方法包括:將有效量的本發(fā)明的任意前述方面的多核苷酸施用至馬。
[0117]本發(fā)明的又一方面提供了本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者本發(fā)明前述方面的核酸，或者本發(fā)明任意前述方面的載體，用于治療、預(yù)防或減輕馬疼痛。
[0118]在某些實施方案中，疼痛是急性疼痛。在另外的實施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術(shù)后疼痛或者由馬的任何手術(shù)程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)、卵巢子宮切除術(shù)等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與炎性痛、瘙癢痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)或由其引起。疼痛可以與腳掌疼痛、太陽下瘀傷、蹄葉炎、蹄膿腫、后顯示外傷、比賽后創(chuàng)傷、舟骨綜合癥和近端懸韌帶炎相關(guān)或由其引起。
[0119]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者本發(fā)明前述方面的核酸，或者包含本發(fā)明的任一前述方面的載體，用于治療骨關(guān)節(jié)炎和/或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。[0120]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明的任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，用于治療馬個體中通過NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)病癥、尤其是骨肉瘤。在某些實施方案中，通過自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0121]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物或者本發(fā)明前述方面的核酸、或者包含本發(fā)明的任意前述方面的載體在制備用于治療或預(yù)防馬疼痛的藥物中的用途。
[0122]疼痛可以是急性疼痛或慢性疼痛。在某些實施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手術(shù)后疼痛或者由馬的任何手術(shù)程序造成的疼痛，其包括但不限于矯形外科手術(shù)、軟組織外科手術(shù)等。在某些另外的實施方案中，疼痛是與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛。在某些另外的實施方案中，疼痛與炎性疼痛、瘙癢痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)或由其引起，或者其還可以與腳掌疼痛、太陽下瘀傷、蹄葉炎、蹄膿腫、后顯示外傷、比賽后創(chuàng)傷、舟骨綜合癥和近端懸韌帶炎相關(guān)或由其引起。
[0123]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者本發(fā)明前述方面的核酸，或者包含根據(jù)本發(fā)明的任意前述方面的載體，在制備用于治療、抑制、減輕或預(yù)防馬風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
[0124]本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段、，或者本發(fā)明前述方面的藥物組合物，或者包含本發(fā)明任意前述方面的抗體或抗體結(jié)合片段的核酸或載體，在制備用于治療馬中通過NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)病癥尤其是骨肉瘤的藥物中的用途。在某些實施方案中，通過自分泌或旁分泌NGF來誘導(dǎo)腫瘤增殖。
[0125]本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗馬NGF中和單克隆抗體或其片段的細(xì)胞系或其衍生細(xì)胞或其后代細(xì)胞。
`[0126]本發(fā)明的又一方面提供了用于治療馬的疼痛或者用于治療與疼痛相關(guān)病癥、或者用于治療、減輕或抑制與骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性疼痛、瘙癢痛、腳掌疼痛、太陽下瘀傷、蹄葉炎、蹄膿腫、后顯示外傷、比賽后創(chuàng)傷、舟骨綜合癥和近端懸韌帶炎相關(guān)的疼痛的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的任一前述方面的抗馬NGF抗體或結(jié)合片段以及其使用說明。
[0127]本發(fā)明的又一方面提供了體外、離體和體內(nèi)檢測流體中抗馬NGF單克隆抗體的診斷試劑盒，用于確定所述抗體的濃度。該試劑盒可以包含本發(fā)明任意抗體或其結(jié)合片段。該試劑盒可以包含使用說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0128]圖1示出根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的馬源化抗體與鼠NGF和馬NGF結(jié)合的圖表。
[0129]圖2A-示出顯示本發(fā)明的馬源化抗體蛋白A純化的凝膠，如同使用對重鏈具有特異性的抗馬多克隆抗體通過蛋白免疫印跡所顯示的；圖28示出使用SDS-Page(B)純化馬源化抗體的結(jié)果的凝膠。
[0130]圖3示出顯示通過馬源化抗體抑制TF-1細(xì)胞的NGF誘導(dǎo)增殖的曲線圖。
[0131]圖4示出顯示缺少通過抗原捕獲的馬源化抗體誘導(dǎo)的補體沉積(complementdeposition)的圖表。
[0132]圖5示出馬源化抗NGF的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。下劃線標(biāo)注根據(jù)Kabat編號識別的三個⑶R區(qū)。特定殘基上方的星號表明大鼠a Dll抗鼠NGF單克隆抗體之間序列上的區(qū)別。
[0133]圖6示出馬源化抗NGF的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:2)。下劃線標(biāo)注根據(jù)Kabat編號識別的三個⑶R區(qū)。特定殘基上方的星號表明馬源化序列與大鼠aDll抗鼠NGF單克隆抗體之間的序列上的區(qū)別。
[0134]圖7示出馬K輕鏈(eqN-kLC)抗體的馬源化抗NGF輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID N0:4)。用黑體表示可變結(jié)構(gòu)域。
[0135]圖8示出的馬源化抗NGF重鏈可變結(jié)構(gòu)域馬IgG_2重鏈(eqN_HC2 (IgG2))的氨基酸序列(SEQ ID N0:6)。用黑體表示可變結(jié)構(gòu)域。
[0136]圖9示出具有HC6重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的馬源化抗NGF重鏈可變結(jié)構(gòu)域IgG_6重鏈(eqN-HC6(IgG2))的氨基酸序列(SEQ ID N0:7)。用黑體表示可變結(jié)構(gòu)域殘基。
[0137]圖10示出馬源化抗NGF MAbs的HC2和HC6同種型變體的蛋白A親和層析的比較。圖1OA和IOC示出加載型2 (HC2，圖10A)和型6 (HC6，圖10C)抗體的CHO轉(zhuǎn)染上清液后的UV吸收率(黑線)和導(dǎo)電率(灰線)的分布圖。圖1OB和圖1OD示出從柱回收抗體(通過定量ELISA測量)，并且 顯示幾乎所有的HC2抗體與柱結(jié)合并且其通過特定的洗提被回收(圖10B)，而沒有HC6抗體通過柱結(jié)合(圖10D)。圖11示出通過對應(yīng)于本發(fā)明的方法制備的抗馬NGF多克隆抗體降低馬炎性疼痛。
[0138]發(fā)明詳述
[0139]通過大量的試驗，發(fā)明人獲得了大鼠抗-小鼠NGF單克隆抗體(MAb) aDll氨基酸序列，并且用其產(chǎn)生了非免疫原性抗-NGF抗體。所得到的抗體可以是嵌合抗體或馬源化抗體，其并不是使用標(biāo)準(zhǔn)CDR移植技術(shù)生產(chǎn)而得，其出乎意料地顯示了結(jié)合馬NGF的高親和性。更令人驚奇的是，顯示該抗體可中和馬NGF生物功能，特別是通過抑制NGF基于細(xì)胞的受體TrkA和p75的結(jié)合。而且，還意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施用至馬時，并不在馬中產(chǎn)生針對它的中和抗體。因此，本發(fā)明的非免疫原性抗體適合于長期緩解馬的慢性疼痛。
[0140]發(fā)明人利用的產(chǎn)生本發(fā)明抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的方法，導(dǎo)致輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)內(nèi)存在的特定大鼠(供體)氨基酸殘基被這樣的殘基取代，基于發(fā)明人的分析，所述殘基會保留CDR區(qū)的構(gòu)象，并因此保持結(jié)合特異性和親合力，同時如果將抗體以不變的方式施用至馬，降低可能導(dǎo)致針對該抗體產(chǎn)生的中和抗體的免疫原性表位的存在。具體而言，制備本發(fā)明(被稱為PETisation)抗體的方法包括:通過將供體抗體框架區(qū)的序列與衍生自馬的一個抗體或抗體庫的序列進(jìn)行比較，評價供體(例如大鼠)抗體框架區(qū)的序列施用至馬的適宜性。盡管該比較是在供體序列與靶序列的單個成員之間進(jìn)行，但是顯而易見的是，與靶序列庫進(jìn)行比較是優(yōu)選的，因為這將擴展靶標(biāo)種類中每一 Kabat位置的自然選擇的數(shù)目。這不但將增加供體與靶標(biāo)之間匹配的可能性，而且還將擴展不存在匹配的取代的選擇。因此，將能夠選擇與供體盡可能緊密的特征的取代。當(dāng)供體序列與馬序列在任何Kabat數(shù)目或?qū)?yīng)的位置不同時，修飾供體序列以用馬中該位置的自然的氨基酸殘基來取代正在討論的氨基酸殘基。
[0141]如果需要取代供體免疫球蛋白中存在的氨基酸殘基，通常采用保守取代的原則，其中該氨基酸殘基天然位于馬Kabat位置，并且在大小、電荷、疏水性方面與供體序列中被取代的氨基酸盡可能密切相關(guān)的氨基酸殘基取代。目的是選擇不引起供體抗體的三維結(jié)構(gòu)擾動或破壞或引起最低程度的擾動或破壞。在某些情況下，將沒有清楚的選擇，并且每一選擇都有利弊。最終的決定可能要求各種可選序列的三維建模甚至表達(dá)。然而，通常利用明顯的偏好。作為該步驟的結(jié)果，當(dāng)殘基在靶中是外來的并且該取代氨基酸與被取代的氨基酸盡可能密切相關(guān)時，僅對供體序列作出改變。因而，避免了外來表位的產(chǎn)生，但是由于維持了整個三位結(jié)構(gòu)，因此，還維持了親和性和特異性。
[0142]輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常衍生自馬(靶)衍生的抗體。選擇或銹蝕重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，從而使得它們不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。非常意外的是，由于發(fā)現(xiàn)并沒有產(chǎn)生針對本發(fā)明生產(chǎn)的抗體的中和抗體或者產(chǎn)生了最少的所述抗體，因此驚人地發(fā)現(xiàn)該抗體具有長循環(huán)半衰期和重復(fù)劑量給藥的相關(guān)益處。而且，由于以不影響CDR區(qū)的三位構(gòu)造的方式進(jìn)行框架殘基取代，使其結(jié)合特異性沒有變化。
[0143]盡管雜合的鼠-馬嵌合抗體是已知的，但是目前在文獻(xiàn)中并沒有描述完全馬源化的多克隆抗體的例子。因此，非常意料不到的是，可以產(chǎn)生這樣的抗體，并且經(jīng)證明其具有治療功效。
[0144]在人類和小鼠中存在四種主要的IgG同種型，雖然術(shù)語是類似的，但它們在行為和功能上是不同的，其包括對細(xì)菌產(chǎn)物例如蛋白A和蛋白G的親和性，激活補體依賴性細(xì)胞溶解(CDC)的能力以及通過抗體依賴性細(xì)胞毒性應(yīng)(ADCC)誘導(dǎo)殺死靶細(xì)胞的能力。當(dāng)將抗體設(shè)計用于為清除具有它們的同源抗原的靶細(xì)胞時，用CDC和ADCC活性或“防護的”恒定結(jié)構(gòu)域選擇IgG同種型在臨床上被認(rèn)為是有益的，例如在腫瘤控制或感染控制方面(例如，為了上述目的，在人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中優(yōu)選人IgGl同種型)。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中 ，激活免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小CDC和ADCC活性的人IgG同種型(例如，在這樣的人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，常常優(yōu)選IgG4同種型)。已經(jīng)描述了馬免疫系統(tǒng)中的七個不同的免疫球蛋白Y (IgG)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域同種型以及單獨的K和λ恒定結(jié)構(gòu)域序列。并沒有按照由其介導(dǎo)的功能活性來表征七個馬重鏈恒定結(jié)構(gòu)域IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6和IgG7。當(dāng)將抗體設(shè)計用于為例如在腫瘤控制或感染控制中清除具有同源抗原的靶細(xì)胞時，用CDC和ADCC活性恒定結(jié)構(gòu)域選擇IgG同種型是有利的，例如在人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用中優(yōu)選人IgGl同種型。相比之下，在其他情況中，例如緩解炎癥、疼痛或自身免疫中，激活免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是不可取的，因此優(yōu)選具有最小或“非防衛(wèi)”的CDC和ADCC活性的人IgG同種型。馬MAb同種型具有更廣的活性譜，因此推測防衛(wèi)的(armed)重鏈和非防衛(wèi)的(disarmed)重鏈的選擇具有相似的價值。
[0145]本發(fā)明的抗體包含馬來源的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和馬來源的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。而且，互補性決定區(qū)衍生自大鼠ct Dll抗-小鼠NGF抗體。a Dll抗體首先描述于Cattaneoet al.(Cattaneo A, Rapposelli B, Calissano P.(1988) “Three distinct types ofmonoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nervegrowth factor”.J Neurochem50(4):1003-1010)。隨后 Ruberti et al.(Ruberti, F.et al.(1993) “Cloning and Expression of an Ant1-Nerve Growth Factor(NGF)Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach”.Cellular and MolecularNeurobiology.13(5):559-568)克隆了 a Dll 抗體。[0146]將衍生自a Dll抗體的CDR區(qū)域與本發(fā)明人確定的框架區(qū)序列組合來維持CDR的三級結(jié)構(gòu)，因此維持了結(jié)合特異性，同時當(dāng)將抗體施用至馬時，阻止針對所述抗體產(chǎn)生中和抗體。
[0147]每一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域都包含四個框架區(qū)，稱為FR1-FR4。對于這些框架區(qū)中的每一個，本發(fā)明人已經(jīng)確定了每一特定位置的優(yōu)選氨基殘基(所謂的優(yōu)選殘基)，和還可能在該位置提供的可選的氨基酸殘基。以下表1至表8示出每一重鏈和輕鏈的四個框架區(qū)。這些表相對特定框架區(qū)，并且進(jìn)一步用于沿完整的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的長度識別特定殘基的位置的編號系統(tǒng)，提供了氨基酸位置。組I示出的一個殘基或多個殘基是優(yōu)選的殘基，而組2的殘基是可選的殘基。然而，對于涉及該特定位置的組I所示的殘基來說，這些殘基通常不是優(yōu)選的。使用單字母命名系統(tǒng)確定氨基酸殘基。
[0148]表1輕鏈可變結(jié)構(gòu)域FRl殘基
【權(quán)利要求】
1.一種制備適用于馬的抗體的方法，包括以下步驟: 從除馬以外的物種提供供體抗體，其中所述供體抗體對所述馬中存在的靶抗原具有結(jié)合特異性； 將所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列的每一氨基酸殘基與一個或多個馬抗體框架區(qū)氨基酸序列中對應(yīng)位置存在的每一氨基酸殘基進(jìn)行比較，以鑒別出所述供體抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)與所述一個或多個馬抗體框架區(qū)氨基酸序列內(nèi)對應(yīng)位置的一個或多個氨基酸殘基不同的一個或多個氨基酸殘基；以及 用所述一個或多個馬抗體中對應(yīng)位置存在的一個或多個氨基酸殘基取代所述供體抗體中的一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基的步驟包括:用對應(yīng)位置存在的與一個或多個被取代的氨基酸殘基具有最高同源性的一個或多個氨基酸殘基取代所述一個或多個鑒別出的氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括:用衍生自馬抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域取代所述供體抗體的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中用HC2型馬恒定結(jié)構(gòu)域取代所述重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶抗原是神經(jīng)生長因子(NGF)。
6.能夠特異性結(jié)合馬神經(jīng)生長因子(NGF)的中和抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或馬源化抗體。
8.如權(quán)利要求6或7所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中通過氨基酸取代或缺失的方式來選擇或修飾所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，使得所述恒定結(jié)構(gòu)域并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈?zhǔn)邱R同種型HC2或HC6重鏈。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈?zhǔn)邱R同種型HC2重鏈。
11.如權(quán)利要求6-10中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或者與其具有至少85%同一性的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求6-11中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈包含選自SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 的氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈包含氨基酸序列SEQID NO:5或SEQ ID NO:6或者與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
14.抗馬NGF抗體或其馬NGF結(jié)合片段，所述抗體或抗體結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含以下的至少一個: 由氨基酸序列SEQ ID NO: 10組成或包含其的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 11組成或包含其的FR2框架區(qū)；由氨基酸序列SEQ ID NO: 12組成或包含其的FR3框架區(qū)；以及 由氨基酸序列SEQ ID NO: 13組成或包含其的FR4框架區(qū)； 所述重鏈可變區(qū)包含以下的至少一個: 由氨基酸序列SEQ ID NO: 14組成或包含其的FRl框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 15組成或包含其的FR2框架區(qū)； 由氨基酸序列SEQ ID NO: 16組成或包含其的FR3框架區(qū)；以及 由氨基酸序列SEQ ID NO: 17組成或包含其的FR4框架區(qū)。
15.如權(quán)利要求14所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQID NO: 10的FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 10通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:即 V, S7 是 T，A9 是 E，Lll 是 V，S12 是 T 或 A、A13 是 V，S14 是 T，E17 是 Q，T18是R，T20是E，121是1、L、M或V以及E22是K。
16.如權(quán)利要求14所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQID NO: 10的FRl區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 10通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:即01是6、1(或￥，12是？、隊3或1'，￥3是4、6、1或1]\14是1^、0或￥，了5是八或I，S7 是 F，A9 是 D、P 或 S，SlO 是 F、L 或 T，Lll 是 S，S12 是 E 或 V，A13 是 L、Q 或 T，S14 是A 或 P，L15 是 P 或 R，G16 是 R，T18 是 S、G 或 K，V19 是 A，T20 是 D 或 V，121 是 T，以及 E22是 L、N、Q、R、S 或 T。
17.如權(quán)利要求14-16中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 11的FR2區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 11通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:K5是R，Q8是E，S9是A，Kll是R或Ε，以及L12是R。
18.如權(quán)利要求14-16中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 11的FR2區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中SEQ ID NO: 11通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:Υ2是F或H，Q3是R或S，Q4是H、K、R或V，Κ5是V，Ρ6是I，L或S，S9 是 P、R、V 或 T，PlO 是 L，Kll 是 I 或 L，L12 是 A、E、G、H、Q 或 W，L13 是 F、1、M 或 V，114 是 F、T、M 或 V，以及￥15是六、(:、03、卩、6、!1、0、1?、5、1'或￥。
19.如權(quán)利要求14-18中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 12的FR3區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 12通過被選自以下的一個或多個氨基酸進(jìn)行取代修飾:S4是D，F(xiàn)6是Y，D14是E，Y15是F，S16是T，N20是S，S24是A，S29是1、S或T，以及F31是Y。
20.如權(quán)利要求14-18中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 12的FR3區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中SEQ ID NO: 12通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:G1是D或F，V2是A或F，P3是L或S，S4是A、E、G或L，F(xiàn)6是L, S7 是 C、F、G、N、R 或 T，G8 是 A，S9 是 D、E、G、K、R、T 或 W，GlO 是 A、R 或 V，Sll 是 A、F、T 或 Y，G12 是 E 或 T，T13 是 A、S 或 W，S16 是 A 或 V，L17 是 F 或 P，T18 是 A、1、S 或 V，119是 V，N20 是 D、G 或 T，S21 是 D、E、P、R 或 T，Q23 是 E 或 R，S24 是 E 或 T，E25 是 A、D、G 或T, D26 是 N，V27 是 A、L、E、G 或 S，A28 是 G，S29 是 D、E、F、L、M、N 或 V，Y30 是 C，以及 F31是 H、S、T、V 或 W。
21.如權(quán)利要求14-20中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 13的FR4區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 13通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:L9是I。
22.如權(quán)利要求14-20中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 13的FR4區(qū)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 13通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾=Fl是I或L，Q3是L，T5是S，K6是M、N或R，L7是M或V，E8是A、D 或 K，L9 是 F、M 或 V，以及 KlO 是 A、E、G、1、Q、R、T 或 V。
23.如權(quán)利要求14-22中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 14的FRl區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 14通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:N13是K。
24.如權(quán)利要求14-22中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其包含具有SEQ ID NO: 14的FRl區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 14通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:K5是Q，GlO是D，Lll是Q，V12是Μ，Ν13是M或R，Ρ14是I或S，S15 是 A 或 G，Q16 是 Ε，Τ17 是 A，S19 是 Τ, Τ21 是 S 或 V，Τ23 是 A、F 或 S，V24 是 I，S25是1'，626是六，？27是六、6、1、]?、隊0或5，S28 是 D、H、1、L、N 或 P，L29 是 D、S、T 或 V，以及Τ30 是 Ε、Ι、Ν 或 R。
25.如權(quán)利要求14-24中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，包含具有SEQID NO: 15的FR2區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 15被W12是F的氨基酸取代進(jìn)行修飾。
26.如權(quán)利要求14-24中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，包含具有SEQID NO: 15的FR2區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 15通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾:V2是L，A5是P、S或V，K8是W，G9是R，LlO是P或W，W12是E、H、R、V或Y，以及G14是A、D或S。
27.如權(quán)利要求14-26中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，包含具有SEQID NO: 16的FR3區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 16通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾，即T3是S ，R6是K，F(xiàn)14是Y，Q16是T，M17是L，以及R32是G。
28.如權(quán)利要求14-26中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，包含具有SEQID NO: 16的FR3區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 16通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾，即A2可以是C、G、1、T或V，T3可以是D、1、M、N或R，14是V，T5是1、L或 S，R6 是E 或 S，D7 是E 或N，T8 是A、E、1、P、S 或 Y，S9 是E、G、K 或T，KlO 是E、L，N、Q 或 R，Sll 是 G、K、N 或 R，Q12 是 E、H 或 R，V13 是 A、1、L、F 或 S，F(xiàn)14 是 L、R、S、T 或 V,L15 是 V，Q16 是 I，M17 是 V, N18 是 D、K、R、S 或 T, S19 是 D、E、G、K、M 或 T, L20 是 M 或 V,T21 是 S，S22 是 D、E、G或 R，E23 是D 或G，T25 是A，A26 是 S，V27 是 D，Y29 是 A、F、I 或 W，A31 是 E、G、1、S、T 或 V，以及 R32 是 A、E、G、H、1、K 或 S。
29.如權(quán)利要求14-28中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，包含具有SEQID NO: 17的FR4區(qū)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述SEQ ID NO: 17通過被選自以下的一個或多個氨基酸取代進(jìn)行修飾，即Q3是P。
30.如權(quán)利要求14-29中任一項所述的抗馬NGF抗體或馬NGF結(jié)合片段，其中所述重鏈?zhǔn)邱R同種型HC2的重鏈。
31.通過權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法制備的抗體或其結(jié)合片段。
32.特異性結(jié)合一種或多種馬可溶性蛋白的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體并不介導(dǎo)下游的效應(yīng)子功能，并且所述抗體通過與蛋白A結(jié)合是可純化的。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體包含具有馬HC2同種型的重鏈。
34.如權(quán)利要求32或33所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述一種或多種可溶性蛋白選自CSF、白細(xì)胞介素、生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。
35.如權(quán)利要求34所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述一種或多種可溶性蛋白是NGF。
36.如權(quán)利要求6-35中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其以具有1χ10_8或更小的平衡解離常數(shù)的親和性與馬NGF特異性結(jié)合。
37.如權(quán)利要求6-36中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體或片段與馬NGF的結(jié)合抑制馬NGF結(jié)合p75或TrkA馬NGF受體的能力。
38.如權(quán)利要求6-37中任一項所述的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或結(jié)合片段在馬中不是免疫原性的。
39.如權(quán)利要求6-38中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段選自單鏈Fv(ScFv)抗體片段、Fab抗體片段、Fab’抗體片段和F(ab’)2抗體片段。
40.如權(quán)利要求6-39中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體是多特異性抗體或多價抗體。
41.如權(quán)利要求6-40中任一項所述的抗體或結(jié)合片段，其中所述抗體是嵌合抗體或馬源化抗體。
42.一種治療、抑制或減輕`馬疼痛的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是馬源化抗體；以及 將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體是權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或與其具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含選自SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:9 的氨基酸序列和與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
46.如權(quán)利要求42-45中任一項所述的方法，其中所述疼痛選自神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛和外科手術(shù)后疼痛。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述手術(shù)后疼痛選自矯形外科手術(shù)和軟組織手術(shù)導(dǎo)致的疼痛。
48.治療馬個體關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是馬源化抗體；以及將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體是權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含、組成為或基本組成為:選自SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列和與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
52.如權(quán)利要求48-51中任一項所述的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥包括選自免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。
53.如權(quán)利要求48-52中任一項所述的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥的治療包括減輕、抑制、降低、壓制或延遲與所述關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)或由其引起的疼痛的發(fā)作。
54.治療馬個體由馬NGF表達(dá)增強或?qū)GF敏感性增強引起的或與其相關(guān)的或?qū)е缕涞牟“Y的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是馬源化抗體；以及 將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體是權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
57.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列和與所述氨基酸序列具有至少85%氨基酸同一性的序列。
58.治療馬由NGF誘發(fā)增殖的腫瘤和與其相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟: 提供治療有效量的抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是馬源化抗體；以 及 將所述抗馬NGF抗體或其抗原結(jié)合片段施用至有需要的馬。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體是權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或與所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述抗馬NGF抗體包含輕鏈和/或重鏈，所述輕鏈具有氨基酸序列SEQ ID N0:4或與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重鏈包含、組成為或基本組成為:選自SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列和與所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
62.如權(quán)利要求58-61中任一項所述的方法,其中所述腫瘤由自分泌或旁分泌NGF誘導(dǎo)增殖。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
64.如權(quán)利要求42-63中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括共施用至少一種另外的治療劑的步驟。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇和類固醇。
66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自抗生素、抗真菌治療劑、抗原生動物治療劑和抗病毒治療劑。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述至少一種治療劑選自炎癥介質(zhì)的抑制劑、PGE受體拮抗劑、免疫抑制劑、環(huán)孢霉素、抗炎糖皮質(zhì)激素、用于治療認(rèn)知功能障礙或認(rèn)知損傷的藥劑、抗高血壓藥劑、用于治療心血管功能障礙的化合物、利尿劑、血管擴張劑、β腎上腺素受體拮抗劑、血管緊張肽II轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、苯基丁氮酮、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)、多硫酸化粘多糖、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑、IRAP、雙氯芬酸和骨關(guān)節(jié)炎疾病改善藥物。
68.如權(quán)利要求42-67中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結(jié)合片段以約.0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重的劑量施用至馬。
69.如權(quán)利要求42-67中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結(jié)合片段以約.0.03mg/kg體重至約3mg/kg體重的劑量施用至馬。
70.用于治療導(dǎo)致馬疼痛或由疼痛引起的或?qū)е绿弁吹牟“Y的藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗馬NGF馬源化抗體或其結(jié)合片段，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
71.如權(quán)利要求70所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含至少一種鎮(zhèn)痛劑、NSAID、阿片樣物質(zhì)、皮質(zhì)類固醇或類固醇。
72.如權(quán)利要求70或71所述的藥物組合物，其中所述導(dǎo)致疼痛的病癥選自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥、瘙癢、骨關(guān)節(jié)炎、急性疼痛、慢性疼痛、外科手術(shù)疼痛、外科手術(shù)后疼痛。
73.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
74.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO:1的抗馬NGF抗體或抗體片段的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸序列SEQ ID N0:4的輕鏈。
75.分離的核酸，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO: 2的抗馬NGF馬源化抗體或抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或具有選自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的重鏈。
76.如權(quán)利要求73-75中任一項所述的分離的核酸,其可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列。
77.表達(dá)載體，包含權(quán)利要求73-75中任一項所述的核酸。
78.如權(quán)利要求77所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含一個或多個調(diào)控序列。
79.如權(quán)利要求77或78所述的表達(dá)載體，其中所述載體是質(zhì)粒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
80.宿主細(xì)胞，其整合了權(quán)利要求77-79中任一項所述的表達(dá)載體。
81.產(chǎn)生馬源化抗馬NGF中和抗體的方法，所述方法包括以下步驟:培養(yǎng)權(quán)利要求80所述的宿主細(xì)胞，以使所述細(xì)胞表達(dá)馬源化抗馬NGF中和抗體。
82.治療、減輕或抑制馬疼痛的方法，所述方法包括以下步驟:將治療有效量的權(quán)利要求73-75中任一項所述的核酸施用至所述馬。
83.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，用于治療或預(yù)防馬疼痛。
84.如權(quán)利要求83所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述疼痛選自:急性疼痛、慢性疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、矯形外科手術(shù)引起的疼痛、與軟組織外科手術(shù)相關(guān)的疼痛、 與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛以及與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的或由其引起的疼痛。
85.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，用于治療關(guān)節(jié)炎。
86.如權(quán)利要求85所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
87.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，用于治療或預(yù)防馬由NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤及其相關(guān)病癥。
88.如權(quán)利要求87所述的抗體或抗體結(jié)合片段，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
89.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，在制備用于治療或預(yù)防馬疼痛的藥物中的用途。
90.如權(quán)利要求89所述的用途，其中所述疼痛選自急性疼痛、慢性疼痛、圍術(shù)期疼痛、手術(shù)后疼痛、炎性疼痛、瘙癢疼痛、矯形外科手術(shù)引起的疼痛、與軟組織外科手術(shù)相關(guān)的疼痛、由卵巢子宮切除術(shù)引起的疼痛、與癌癥或癌性病癥相關(guān)的慢性疼痛以及與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的或由其引起的疼痛。
91.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，在制備用于治療、抑制、減輕或預(yù)防馬的關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
92.如權(quán)利要求91所述的用途，其中所述關(guān)節(jié)炎是骨關(guān)節(jié)炎、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
93.權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗體或抗體結(jié)合片段，權(quán)利要求70-72中任一項所述的藥物組合物，權(quán)利要求73-76中任一項所述的核酸或者權(quán)利要求77-79所述的表達(dá)載體，在制備用于治療馬由NGF誘導(dǎo)增殖的腫瘤和其相關(guān)病癥的藥物中的用途。
94.如權(quán)利要求93所述的用途，其中所述腫瘤是骨肉瘤。
95.細(xì)胞系或其衍生細(xì)胞或后代細(xì)胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗馬NGF中和單克隆抗體或其片段。
96.用于治療馬疼痛，或者用于治療與疼痛相關(guān)的病癥，或者用于治療、減輕或抑制與骨關(guān)節(jié)炎、炎癥、瘙癢、免疫介導(dǎo)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛的試劑盒，其包含權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗馬NGF抗體或結(jié)合片段及其使用說明。
97.用于檢測抗馬NGF單克隆抗體或結(jié)合片段的診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求6-41中任一項所述的抗馬NGF抗體或結(jié)合片`段。
【文檔編號】C07K16/22GK103764677SQ201280033623
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
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