包含抗-atic自身免疫抗體的肝癌診斷標(biāo)記物以及包含其抗原的肝癌診斷用組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體（autoantibody）或者包含其抗原結(jié)合部位（antigen-binding?site，Paratope）的片段；一種包括測(cè)定所述片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物；一種生產(chǎn)所述自身免疫抗體的雜交瘤細(xì)胞株；一種包含所述組合物的肝癌診斷用試劑盒；利用所述組合物的肝癌診斷方法；以及一種利用所述自身免疫抗體的肝癌治療劑的篩選方法。使用本發(fā)明的抗-ATIC特異反應(yīng)性自身免疫抗體作為肝癌診斷標(biāo)記物，可利用血液、血漿、血清、淋巴液等非侵襲性的生物樣品，以約87%的敏感性和約88%的特異性診斷肝癌的發(fā)生與否。并且，可以?xún)H利用本發(fā)明中鑒定的氨基酸序列，便可簡(jiǎn)單診斷出肝癌，因此對(duì)于肝癌診斷用試劑盒的開(kāi)發(fā)非常有效。
【專(zhuān)利說(shuō)明】包含抗-AT IC自身免疫抗體的肝癌診斷標(biāo)記物以及包含其抗原的肝癌診斷用組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種與ATIC (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribon ucleotideformyltransferase/IMP cyclohydrolase, 5_氨基咪唑_4_羧胺核苷酸甲酸轉(zhuǎn)移酶/IMP環(huán)化水解酶)特異性結(jié)合的自身免疫抗體(auto antibody)或者包含其抗原結(jié)合部位(antigen-binding site, Paratope)的片段；一種與所述自身免疫抗體特異性結(jié)合的抗原片段；一種包括測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物；一種生產(chǎn)所述自身免疫抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及一種包含本發(fā)明組合物的肝癌診斷用試劑盒。并且，本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明組合物的肝癌診斷方法以及利用所述自身免疫抗體的肝癌治療劑的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在韓國(guó)、日本、臺(tái)灣、中國(guó)、大部分的東南亞國(guó)家中，包括肝炎、肝硬變、肝癌等的肝臟疾病是患病患者最多的單一疾??；而在韓國(guó)，以不同臟器為基準(zhǔn)時(shí)，肝癌在所有癌癥中位列第5位(9.2%)(衛(wèi)生福利部，2007)，且韓國(guó)男性的肝癌死亡率位列全世界首位。
[0003]到目前為止，為診斷肝癌通常要實(shí)施組織學(xué)檢查或檢測(cè)甲胎蛋白(Alpfa fetalprotein,AFP)等肝癌標(biāo)記物。并且，有幾種生物標(biāo)記物用于所述診斷、預(yù)后判定，其中最為熟知的是所述APF以及PIVKA-1I，但其仍存在很多涉及敏感性的缺陷。最近，還隨著基因組學(xué)(G enomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)的研究,報(bào)道出了幾種新種類(lèi)的肝癌標(biāo)記物候選蛋白質(zhì)和基因，其中所報(bào)道出的基因主要是將組織作為對(duì)象的基因，且現(xiàn)狀為仍不能明確闡明其能否由血液分泌以及通過(guò)血液進(jìn)行診斷。其原因是由于在所述生物標(biāo)記物的本質(zhì)特性方面，大部分腫瘤標(biāo)記物的發(fā)掘是以不同組織的基因表達(dá)差異為中心進(jìn)行的；在生物標(biāo)記物的性質(zhì)方面，即使生物標(biāo)記物可能在組織中的基因表達(dá)量很高，但也不說(shuō)明通過(guò)尿液或者血清對(duì)其進(jìn)行診斷。因此，為了診斷的便利，發(fā)掘一種能夠由血液或者尿液分泌的腫瘤標(biāo)記物非常重要，且還需要與之前方法不同的，分析生物標(biāo)記物，診斷包括肝癌的肝臟疾病的診斷方法。
[0004]為解決所述問(wèn)題，已有多種從血液、組織、排泄物開(kāi)發(fā)出的腫瘤標(biāo)記物，但大多數(shù)腫瘤標(biāo)記物會(huì)出現(xiàn)沒(méi)有癌癥時(shí)還能被檢測(cè)出的情況。因此，利用這些診斷標(biāo)記物的癌癥診斷方法，只能作為輔助手段，其本身不能單獨(dú)作為診斷道具而使用。
[0005] 并且，免疫系統(tǒng)在形成個(gè)體的初期構(gòu)建了一種能區(qū)分自體(self)和非自體(non-self)的獨(dú)特的系統(tǒng)，其結(jié)果發(fā)育成在個(gè)體的正常狀態(tài)下，僅對(duì)暴露于免疫系統(tǒng)的外源性抗原，誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)(hu moral immune response)、免疫細(xì)胞反應(yīng)(cellularimmune response)的免疫系統(tǒng)。然而,還確認(rèn)了在患有特定疾病時(shí),其對(duì)來(lái)源于自身的抗原(self-antigen)也會(huì)生成抗體，其原因是此時(shí)與正常時(shí)不同，相關(guān)抗原的表達(dá)部位的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，向細(xì)胞外分泌，或表現(xiàn)出變形的形態(tài)，或者表現(xiàn)出的一些特征與正常個(gè)體不同所致。1970年之后，連續(xù)報(bào)道出發(fā)生癌癥時(shí)，會(huì)隨著癌癥細(xì)胞的非正常生長(zhǎng)，產(chǎn)生對(duì)于來(lái)源于癌癥細(xì)胞的抗原的自身免疫抗體，并將所述抗原稱(chēng)為癌癥相關(guān)抗原(tumor-associated antigen ;TAA)。至目前為止,確認(rèn)的癌癥相關(guān)抗原的種類(lèi)非常多,其中HER-2/neu oncoprotein被報(bào)道出作為存在于細(xì)胞膜的受體蛋白質(zhì),可誘導(dǎo)自身免疫抗體；也有報(bào)道稱(chēng)P53作為具有抑制癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)功能的蛋白質(zhì)，也能誘導(dǎo)自身免疫抗體。從以上結(jié)果，可推測(cè)有可能存在更多的對(duì)于癌癥相關(guān)抗原的自身免疫抗體，因此不斷的有人試圖篩選出大量的癌癥相關(guān)自身免疫抗體。
[0006]并且，有結(jié)果表明相比于檢測(cè)出一種自身免疫抗體，一次檢測(cè)出多種不同的自身免疫抗體的癌癥診斷方法可能更為有效，因此對(duì)自身免疫抗體的多重檢測(cè)成為了檢測(cè)的重要課題。例如，有報(bào)道稱(chēng)可通過(guò)一次性共同檢測(cè)出對(duì)ASB-9、SERACU RELT的自身免疫抗體，可以以100%的特異性以及80%的敏感性診斷出乳腺癌(L.Zhong et al.Breast CancerReslO:3 (2008) R40);還確認(rèn)了可通過(guò)一次性共同檢測(cè)出對(duì)PMl、MAPKAPK3、ACVR2B的自身免疫抗體，可以以74%的特異性、83%的敏感性診斷出大腸癌(1.Babel et al.Mol CellPr oteomics8::1 (2009)2382-2395)。如上所述，隨著利用癌癥相關(guān)自身免疫抗體的癌癥診斷顯示出非常高的有效性，發(fā)掘新型癌癥相關(guān)自身免疫抗體成為了探索癌癥生物標(biāo)記物的重要領(lǐng)域。
[0007]為鑒定自身免疫抗體，使用的是將癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)文庫(kù)作為對(duì)象，分析癌癥患者的血液反應(yīng)性，從而尋找自身免疫抗體的重組cDNA表達(dá)文庫(kù)的血清學(xué)分析(serological analysis of recombinant c DNA expression libraries of human tumorswith autologous serum, S EREX)技術(shù)。然而,所述方法在文庫(kù)水平上,在使癌癥細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)至具備最大限度的多樣性方面較有限，并且由于蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄(transcription)后也會(huì)經(jīng)過(guò)多個(gè)翻譯后修飾過(guò)程(post translational modification,PTM)，由于不能反映這一點(diǎn)，蛋白質(zhì)表達(dá)文庫(kù)存在明顯不能用于自身免疫抗原的檢測(cè)的缺陷。
[0008]為應(yīng)對(duì)所述問(wèn)題，最近進(jìn)行著以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的發(fā)掘自身免疫抗體的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是指包括將癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)利用雙向電泳(2D-PAGE)分開(kāi)之后，將癌癥患者的血漿作為自身免疫抗體的樣品，確認(rèn)顯示反應(yīng)性的蛋白質(zhì)點(diǎn)后，再用質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)行鑒定過(guò)程的技術(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析(serological proteome anal ysis,SERPA)技術(shù)。并且,還有制備結(jié)合從患者血液分離出的抗體的親和層析樹(shù)脂(affinitychromatography resin),后使蛋白質(zhì)流經(jīng)所述層析樹(shù)脂,從而用色譜分析法對(duì)獲取的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的多重親和蛋白分析(Multiple affinity protein profiling, MAPPING)技術(shù)。并且，還有通過(guò)制備將癌癥細(xì)胞的勻漿分成數(shù)千個(gè)流分的蛋白質(zhì)芯片，后檢測(cè)其對(duì)患者血液的反應(yīng)性，探尋自身免疫抗體的方法。
[0009]如上所述的多種蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)具有能直接確認(rèn)對(duì)仍然維持翻譯后修飾(PTM)特性的癌癥細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體反應(yīng)性的優(yōu)點(diǎn)，因此能確認(rèn)出很多使用SEREX技術(shù)無(wú)法探尋到的自身免疫抗體，但其也還是比較有限。首先是由于抗體的含量少。欲分析的的對(duì)象為兩個(gè)以上的混合物時(shí)，會(huì)對(duì)其中含量多的一個(gè)首先進(jìn)行分析，因此其余的有可能從可檢測(cè)的范圍中排除掉?；颊叩难鍨楹芏嗫贵w的混合物，由于構(gòu)成其的自身免疫抗體的含量差異以及對(duì)抗原的親和力差異決定可進(jìn)行分析的水平，因此有可能無(wú)法對(duì)目的自身免疫抗體進(jìn)行分析。其次，由于進(jìn)行分析時(shí)的自身免疫抗體樣品依賴(lài)于患者，因此對(duì)由癌癥的發(fā)生而產(chǎn)生的自身免疫抗體進(jìn)行系統(tǒng)地分析比較有限，并且為了實(shí)驗(yàn)大量采集患者的血液是非常困難的，因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)本身就有受到很大的限制。最后是關(guān)于抗體進(jìn)行反應(yīng)的抗原決定簇的保存的問(wèn)題。根據(jù)目前所知的免疫學(xué)知識(shí)，抗原反應(yīng)部位可分成兩種:一種是依賴(lài)蛋白質(zhì)序列的順序表位(sequential epitope),另一種是依賴(lài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位(conformational epitope)。在生物體內(nèi)，對(duì)特定抗原誘導(dǎo)出抗體時(shí),反映免疫細(xì)胞抗體首次接觸的抗原的狀態(tài)，其說(shuō)明抗原-抗體反應(yīng)在溶液狀態(tài)下進(jìn)行，且抗原蛋白質(zhì)具備能維持在血液內(nèi)溶解狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)體外進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在溶液狀態(tài)下反應(yīng)能較好的反映原來(lái)的結(jié)合狀態(tài)，因此是比較優(yōu)選的抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)條件。然而使用所述SERPA分析方法時(shí)，為了對(duì)蛋白質(zhì)混合液的分析采用在雙向電泳，即將待分析的蛋白質(zhì)利用十二烷基硫酸鈉(SDS)和尿素(urea)變形后鋪開(kāi)的狀態(tài)下檢測(cè)與抗體的反應(yīng)的方法。因此，存在抗原決定簇是依賴(lài)蛋白質(zhì)序列的順序表位時(shí)可以檢測(cè)出，但如果為依賴(lài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)想表位時(shí)就無(wú)法檢測(cè)出的問(wèn)題。
[0010]如上所述的可作為現(xiàn)有的癌癥發(fā)生相關(guān)標(biāo)記物使用的自身免疫抗體的研究，由于其實(shí)用性不高、診斷效果甚微，因此要將自身免疫抗體作為癌癥診斷用生物標(biāo)記物使用，仍存在一定的問(wèn)題。并且自身免疫抗體的檢測(cè)方法還無(wú)法囊括那么多情況，并還需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，其實(shí)施仍受限，因此仍無(wú)法發(fā)掘診斷肝癌的自身免疫抗體的標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0012]本發(fā)明人為開(kāi)發(fā)用 于肝癌診斷的自身免疫抗體不斷努力的結(jié)果，開(kāi)發(fā)出了在肝癌模型小鼠中有效的癌癥相關(guān)自身免疫抗體的鑒定方法，并確認(rèn)了與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體可在肝癌模型小鼠中被誘導(dǎo)。并且，從肽庫(kù)篩選出與其發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原結(jié)合部位(表位)表達(dá)噬菌體，設(shè)計(jì)出了用于檢測(cè)自身免疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法，并確認(rèn)了利用所述方法可診斷人體肝癌個(gè)體，從而完成了本發(fā)明。
[0013]技術(shù)方案
[0014]本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段。
[0015]本發(fā)明的另一目的在于，提供與本發(fā)明自身免疫抗體特異性結(jié)合的抗原片段。
[0016]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種包括測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物。
[0017]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種生產(chǎn)所述自身免疫抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0018]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種包含本發(fā)明組合物的肝癌診斷用試劑盒。
[0019]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種利用本發(fā)明組合物的肝癌診斷方法。
[0020]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種利用本發(fā)明自身免疫抗體的肝癌治療劑的篩選方法。
[0021]有益效果
[0022]使用本發(fā)明的抗-ATIC特異反應(yīng)性自身免疫抗體作為肝癌診斷標(biāo)記物，可避免使用侵襲性的診斷方法，而是采用非侵蝕性的血液、血漿、血清、淋巴液等生物樣品，以約87%的敏感性和約88%的特異性診斷肝癌的的發(fā)生與否。并且，本發(fā)明鑒定了與所述標(biāo)記物反應(yīng)的序列，從而無(wú)需為鑒定標(biāo)記物設(shè)計(jì)復(fù)雜的反應(yīng)物質(zhì)，僅利用已鑒定的氨基酸序列便可簡(jiǎn)單診斷出肝癌，因此對(duì)于肝癌診斷用試劑盒的開(kāi)發(fā)非常有效。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1表示肝癌小鼠來(lái)源的XC154自身免疫抗體的獲得以及利用其的癌癥診斷方法的方案。通過(guò)確認(rèn)從HBx肝癌模型小鼠來(lái)源的B細(xì)胞雜交瘤克隆獲得的自身免疫抗體對(duì)于肝癌癥細(xì)胞的反應(yīng)性，從而獲得了 XC154抗體。固定肝癌癥細(xì)胞株H印G2、H印alclc7細(xì)胞，并將細(xì)胞膜通透化后，用肝癌模型小鼠來(lái)源的自身免疫抗體進(jìn)行了處理，與標(biāo)有熒光標(biāo)記物的二抗反應(yīng)后，采用流式細(xì)胞分析法(flow cytometric ananlysis)進(jìn)行確認(rèn)。設(shè)計(jì)出了一種利用形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的卩遼菌體表達(dá)環(huán)肽庫(kù)(Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Librarykit ;新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室有限公司)，篩選出模擬對(duì)應(yīng)于通過(guò)淘選方法獲得的XC154抗體表位的噬菌體，并利用篩選出的噬菌體確認(rèn)肝癌患者和正常人的差異的方法。
[0024]圖2a以及2b是TAB-XC154自身免疫抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydetermining regions, Q)R)序列,表示獲得的XC154抗體的重鏈可變區(qū)(VH,圖2a)和輕鏈可變區(qū)('，圖2b)的互補(bǔ)決定區(qū)的分析結(jié)果。對(duì)從XC154抗體生成B細(xì)胞雜交瘤提取的總RNA的cDNA進(jìn)行合成，并利用重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)引物和輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后，連接(ligation)于pTOP Blunt V2載體，從而制備重組質(zhì)粒。在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增重組質(zhì)粒后，進(jìn)行提取，然后對(duì)相應(yīng)部位進(jìn)行堿基序列分析。通過(guò)分析的堿基序列確認(rèn)蛋白質(zhì)序列后，以卡巴特(Kabat) CDR的定義為基礎(chǔ)，決定CDR序列。
[0025]圖3是為確認(rèn)XC154對(duì)于各種癌癥細(xì)胞的反應(yīng)性而進(jìn)行的流式細(xì)胞分析(a)以及細(xì)胞內(nèi)染色(b)的結(jié)果。進(jìn)行癌癥細(xì)胞內(nèi)染色后，利用流式細(xì)胞分析方法分析XC154抗體對(duì)于各種癌癥細(xì)胞的反應(yīng)性 的結(jié)果，確認(rèn)不僅在H印G2，SK-Hepl等肝癌癥細(xì)胞株，還在其他多種癌癥細(xì)胞中顯示出較高的反應(yīng)性。并且，通過(guò)熒光染色方法確認(rèn)XC154抗體識(shí)別的抗原蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置的結(jié)果，確認(rèn)了在癌癥細(xì)胞株H印G2，Hepa-lclc7中，主要集中到了細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞膜側(cè)，而與此相比，確認(rèn)了在正常人的肝臟細(xì)胞Chang細(xì)胞株中則主要集中于細(xì)胞質(zhì)中。
[0026]圖4是為確認(rèn)XC154自身免疫抗體的特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白免疫印跡結(jié)果。對(duì)多種種類(lèi)的癌癥細(xì)胞株的細(xì)胞勻漿以及未添加血清的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行定量，每50 Ug的樣品在10%的SDS-PAGE上展開(kāi)后，利用XC154抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果確認(rèn)了其識(shí)別64KDa左右分子量的蛋白質(zhì)(M，分子量標(biāo)記物；1，Hepalclc7 ;2，H印G2 ;3，HT-29)。
[0027]圖5為篩選TAB-XC154抗體的特異反應(yīng)性表位表達(dá)噬菌體的結(jié)果，表示利用XC154抗體對(duì)噬菌體環(huán)肽庫(kù)進(jìn)行篩選，從而篩選出XC154抗體特異反應(yīng)性抗原表達(dá)噬菌體的結(jié)果。圖5a是分五次進(jìn)行了利用XC154抗體的淘選，并篩選出了 4種具有不同肽序列的噬菌體(XC154pl、XC154p2、XC154p4、XC154p9)。圖 5b 是利用 ELISA 法確認(rèn)了其對(duì)于 XC154 抗體的反應(yīng)性的結(jié)果，從而確認(rèn)了 XC154pl噬菌體對(duì)TAB-XC154抗體的特異反應(yīng)性最高。
[0028]圖6表示由XC154pl表位表達(dá)噬菌體引起的TAB-XC154抗體的細(xì)胞反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。確認(rèn)了篩選出的XC154pl噬菌體能夠模擬與TAB-XC154抗體結(jié)合的抗原的表位結(jié)構(gòu)，從而可競(jìng)爭(zhēng)性抑制TAB-XC154抗原-抗體的結(jié)合。固定肝癌癥細(xì)胞株H印G2，前列腺癌癥細(xì)胞株LNcap/LN3細(xì)胞，并將細(xì)胞膜通透化后，使用與XC154pl噬菌體預(yù)先進(jìn)行反應(yīng)的XC154抗體進(jìn)行處理，與標(biāo)有熒光標(biāo)記物的二抗反應(yīng)后，采用流式細(xì)胞分析法進(jìn)行確認(rèn)。從結(jié)果中確認(rèn)了 XC154pl噬菌體幾乎完全抑制了細(xì)胞表達(dá)抗原的抗體反應(yīng)，從而確認(rèn)了噬菌體表達(dá)的表位很好的模擬了原有抗原的抗原決定簇的結(jié)構(gòu)。
[0029]圖7表示利用XC154pl表位表達(dá)噬菌體診斷肝癌的結(jié)果。使用TAB-XC154抗體特異反應(yīng)性肽表達(dá)噬菌體XC154pl作為包被抗原的ELISA法，對(duì)肝癌患者和正常人的血清進(jìn)行分析。從而結(jié)果可確認(rèn)，將臨界值(cutoff)定為0.059時(shí)，其可以以86.96%的敏感性(sensitivity)和88.24%的特異性(specificity)區(qū)別出肝癌患者。
[0030]圖8表示利用XC154pl表位表達(dá)噬菌體診斷乳腺癌的結(jié)果。使用XC154抗體特異反應(yīng)性肽表達(dá)噬菌體XC154pl作為包被抗原的ELISA法，進(jìn)行對(duì)乳腺癌患者以及正常人的血清分析時(shí)，無(wú)法將乳腺癌患者的血清與正常人的血清區(qū)分開(kāi)，這與肝癌時(shí)明顯不同。
[0031]圖9表示對(duì)XC154抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的鑒定。圖9a表示XC154抗體反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的純化。制備TAB-XC154抗體反應(yīng)性抗原過(guò)表達(dá)的LnCap-LN3細(xì)胞勻漿，利用陰離子交換樹(shù)脂HitrapQ-sepharose進(jìn)行分級(jí)提取,純化所述抗原部分。對(duì)所述抗原過(guò)量存在的流分進(jìn)行濃縮，在SDS-PAGE上進(jìn)行展開(kāi)，后提取XC154抗原的相應(yīng)部位，進(jìn)行膠內(nèi)酶切(in-gel digestion)后,利用質(zhì)譜分析法進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。圖9b表示XC154抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析結(jié)果。對(duì)XC154抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果，確認(rèn)了 ATIC具有最高的分值。ATIC與嘌呤的合成相關(guān)，被認(rèn)為是對(duì)癌癥細(xì)胞增殖發(fā)揮最主要功能的蛋白質(zhì)，計(jì)算出的蛋白質(zhì)分子量為64.5KDa，其與XC154抗原的分子量類(lèi)似。
[0032]圖10表示經(jīng)鑒定的XC154抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的驗(yàn)證。圖1Oa表示利用siRNA抑制ATIC的表達(dá)。將特異性地作用于A(yíng)TIC的siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)，48小時(shí)后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確認(rèn)相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，確認(rèn)了抑制50%以上的表達(dá)。圖1Ob表示抑制ATIC基因表達(dá)后，為確認(rèn)XC154抗體反應(yīng)而進(jìn)行的流式細(xì)胞分析的結(jié)果。通過(guò)上述與上述相同的方法，確認(rèn)XC154抗體對(duì)處理了 siRNA的細(xì)胞的反應(yīng)性的確認(rèn)結(jié)果，確認(rèn)了抗體反應(yīng)性降低了 20%左右。圖1Oc表示抑制ATIC基因表達(dá)后，為確認(rèn)XC154抗體的反應(yīng)性而進(jìn)行的蛋白免疫印跡的結(jié)果。為確認(rèn)表達(dá)受到抑制的蛋白質(zhì)是否為XC154抗體反應(yīng)蛋白質(zhì)，進(jìn)行了蛋白免疫印跡。結(jié)果確認(rèn)了 ATIC表達(dá)受到抑制的細(xì)胞中，XC154抗體反應(yīng)也消失，從而確認(rèn)了 XC154抗原是ATIC。
[0033]最佳實(shí)施方式
[0034]為實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明一方面，提供一種與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段。
[0035]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“ATIC(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribon ucleotideformyltransferase/IMP cyclohydrolase, 5_ 氨基咪唑-4-羧胺核苷酸甲酸轉(zhuǎn)移酶 /IMP環(huán)化水解酶)”是催化嘌呤從頭(de novo)合成過(guò)程中的最后兩個(gè)步驟反應(yīng)的，具備兩種功能的蛋白質(zhì)。嘌呤和嘧啶的合成過(guò)程是生成DNA以及RNA合成所必須的核苷酸的反應(yīng)，雖然在正常細(xì)胞中基本不會(huì)發(fā)揮作用，但在癌癥細(xì)胞等分裂較快的細(xì)胞中則非?；钴S。但是，ATIC和癌癥發(fā)生相關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果幾乎還沒(méi)有被報(bào)道過(guò)。本發(fā)明中首次在肝癌患者血液中確認(rèn)了抗-ATIC自身免疫抗體，并闡明了利用與其發(fā)生特異性反應(yīng)的新型表位結(jié)構(gòu)可診斷肝癌。[0036]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫抗體(autoantibody)”指能與自體成分發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，還稱(chēng)為自身抗體或者自體抗體。一般，由于個(gè)體不會(huì)對(duì)自身原有的本質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)，因此不會(huì)產(chǎn)生抗體。但在特定情況下，有可能將自身原有的物質(zhì)識(shí)別成抗原，并生成抗體，從而引起全身型紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)等自身免疫性疾病(autoimmune di sease)。與上述不同的是，本發(fā)明的自身免疫抗體是指對(duì)于與伴隨著異常的癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)一同產(chǎn)生的癌癥細(xì)胞來(lái)源的抗原而產(chǎn)生的抗體，具體為對(duì)于癌癥來(lái)源抗原，即對(duì)ATIC生成的抗體，在本發(fā)明中與“抗-ATIC自身免疫抗體”或“與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體”混用。
[0037]本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，確認(rèn)了從肝癌模型小鼠來(lái)源的雜交瘤克隆獲得的自身免疫抗體對(duì)于肝癌癥細(xì)胞的反應(yīng)性，并命名為“XC154自身免疫抗體”或“TAB-XC154自身免疫抗體”。之后，鑒定對(duì)于所述抗體的特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的結(jié)果，最終確認(rèn)為是具有64.5KDa分子量的ATIC，并可確認(rèn)所述自身免疫抗體為抗-ATIC自身免疫抗體(圖9以及圖10)。
[0038]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合部位(antigen-binding site,paratope)”是指抗體中與抗原結(jié)合的部位。所述抗原結(jié)合部位是抗體的Fv部位中小的部位，其包括抗體重鏈和輕鏈的一部分，并與抗原的抗原決定簇(antigenic determinant, epitope)結(jié)合。
[0039]本發(fā)明中所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，優(yōu)選可識(shí)別選自SEQ N0.17至SEQ N0.20的氨基酸序列，更優(yōu)選識(shí)別SEQ N0.17的氨基酸序列。
[0040]本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，為鑒定所述自身免疫抗體的具體抗原決定簇的序列，從肽表達(dá)文庫(kù)中篩選XC154抗體特異反應(yīng)性抗原的結(jié)果，確認(rèn)了其可與選自CLPSWFHRC (Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SEQ N0.17)> CAPSffLHRC(Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys ；SEQ N0.18)、CSPSGLFSC (Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys ；SEQN0.19)、CTPSffFHRC (Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SEQ N0.20)的一個(gè)以上的氨基酸序列特異性發(fā)生反應(yīng)，還確認(rèn)了與其中的CLPSWFHRC(Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SEQ N0.17)的氨基酸序列顯示出最高的反應(yīng)性(圖5)。
[0041]一般，一個(gè)抗體分子中包括兩個(gè)重鏈(heavy chain)和兩個(gè)輕鏈(lightchain)，每個(gè)重鏈和輕鏈在其N(xiāo)-末端包含可變區(qū)。每個(gè)可變區(qū)包括3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity determining region:CDR)和 4 個(gè)骨架區(qū)(framework regions:FRs),互補(bǔ)決定區(qū)決定抗體的抗原結(jié)合特異性，由可變區(qū)的骨架區(qū)所維持，其以非常短的肽序列的形式存在。作為優(yōu)選的本發(fā)明自身免疫抗體重鏈可變區(qū)的一部分，其可包括SEQ N0.3的⑶Rl序列、SEQ N0.4的⑶R2序列或者SEQ N0.5的⑶R3序列組成的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，可以是同時(shí)包括所述CDRl、CDR2以及CDR3序列的自身免疫抗體或者其片段。并且，作為本發(fā)明自身免疫抗體輕鏈可變區(qū)的一部分，其可包括SEQ N0.6的⑶Rl序列、SEQ N0.7的⑶R2序列或者SEQ N0.8的⑶R3序列組成的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段 ，可以是同時(shí)包括所述CDRl、CDR2以及CDR3序列的自身免疫抗體或者其片段。并且，本發(fā)明顯然還包括編碼所述序列的核酸序列。
[0042]本發(fā)明的自身免疫抗體中，作為重鏈可變區(qū)序列，優(yōu)選由SEQ N0.1的氨基酸序列構(gòu)成的自身免疫或者包含其抗原結(jié)合部位的片段；作為輕鏈可變區(qū)序列，優(yōu)選包括由SEQN0.2構(gòu)成的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段。并且，所述重鏈以及輕鏈可根據(jù)需要分別使用或同時(shí)使用，并且可根據(jù)技術(shù)人員的目的，通過(guò)通常的基因工程方法，對(duì)多種CDR序列以及輕鏈和重鏈進(jìn)行自由組合。
[0043]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，為研究所述自身免疫抗體的特性而分析互補(bǔ)決定區(qū)序列，結(jié)果確認(rèn)了本發(fā)明的自身免疫抗體包括:包含SEQ N0.3的重鏈⑶Rl ；SEQ N0.4的重鏈CDR2 ；SEQ N0.5的重鏈CDR3的重鏈可變區(qū)；和包含SEQ N0.6的輕鏈CDRl ；SEQ N0.7的輕鏈C DR2 ；SEQ N0.8的輕鏈⑶R3的輕鏈可變區(qū)，并確認(rèn)了自身免疫抗體包含SEQ N0.1的重鏈氨基酸序列以及SEQ N0.2的輕鏈氨基酸序列(圖2)。
[0044]本發(fā)明的自身免疫抗體包括:編碼包含兩個(gè)全長(zhǎng)的重鏈或?qū)崿F(xiàn)抗體-抗原結(jié)合并具有抗體分子的免疫學(xué)活性片段的多聚核苷酸。并且，本發(fā)明的抗體還包括:編碼包含兩個(gè)全長(zhǎng)的輕鏈或?qū)崿F(xiàn)抗體-抗原結(jié)合并具有抗體分子的免疫學(xué)活性的片段的多聚核苷酸。具有抗體分子免疫活性的片段是指保留抗原結(jié)合功能的片段，抗體片段的例子包括:(i)由輕鏈的可變區(qū)(')以及重鏈的可變區(qū)(Vh)和輕鏈的恒定區(qū)(CJ以及重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(Cm)構(gòu)成的Fab片段；(ii)由Vh以及Chi結(jié)構(gòu)域夠成的Fd片段；(iii)由單克隆抗體的Vl以及Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv)由Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段；(v)分離的CDR域；(vi)包含兩個(gè)連接的Fab片段的2價(jià)片段F(ab’)2片段；(vii)通過(guò)肽連接將Vh結(jié)構(gòu)域以及\結(jié)構(gòu)域以形成抗原結(jié)合部位的方式進(jìn)行結(jié)合的單鏈Fv分子(scFv); (viii)雙特異性單鏈Fv 二聚體；以及(i X)通過(guò)基因融合制備的多價(jià)或者多特異性片段，即雙特異抗體(dia body)等,但并不僅限于此。
[0045]本發(fā)明的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，優(yōu)選由保藏編號(hào)為KCTCl 1873BP的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段。
[0046]本發(fā)明另一方面，提供一種與所述ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體特異性結(jié)合的抗原片段。
[0047]本發(fā)明的“與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體特異性結(jié)合額抗原片段”包括所有能與所述自身免疫抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，而不僅限于特定的蛋白質(zhì)或者多肽。所述抗原如果能被抗-ATIC自身免疫抗體所識(shí)別，可優(yōu)選包括其片段或者其變形體等。所述抗原至少由9個(gè)氨基酸構(gòu)成，優(yōu)選包括12個(gè)以上的氨基酸。
[0048]所述抗原可以是能被本發(fā)明自身免疫抗體標(biāo)記物識(shí)別的抗原決定簇的序列。如果所述序列是能被本發(fā)明自身免疫抗體識(shí)別的序列，則不會(huì)被序列的大小或種類(lèi)所限制，所述序列優(yōu)選為7個(gè)氨基酸末端有半胱氨酸的多肽序列。所述7個(gè)氨基酸末端有半胱氨酸的序列可為選自:CLPSWFHRC (Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SEQ N 0.17),CAPSffLHRC (Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys ；SEQ N0.18)、CSPSGLFSC (Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys ；SEQ N0.19),CTPSffFHRC(Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SE Q N0.20)的一種以上的氨基酸序列，且由于所述半胱氨酸的存在，形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，從而使自身免疫抗體的識(shí)別更為有效。但是，本發(fā)明的自身免疫抗體可識(shí)別的序列的種類(lèi)不限于所述例子。
[0049]本發(fā)明另一方面，提供一種包含測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物。
[0050]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“診斷”是指確認(rèn)病理狀態(tài)的存在或者特征，而本發(fā)明的目的不僅在于確認(rèn)肝癌的發(fā)病與否，還包括判斷經(jīng)過(guò)肝癌的治療后，對(duì)應(yīng)個(gè)體是否發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、藥物反應(yīng)性、耐藥性等。利用本發(fā)明的與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體時(shí)，優(yōu)選從肝癌疑似個(gè)體的樣品中確認(rèn)ATIC表達(dá)水平，從而不僅可預(yù)測(cè)該個(gè)體的肝癌發(fā)病與否，還可預(yù)測(cè)預(yù)后的好壞與否。
[0051 ] 本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“樣品”可為選自全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、痰、淋巴液、腦脊液以及細(xì)胞間液中的一種以上的樣品，其肝癌診斷指標(biāo)，即抗-ATIC自身免疫抗體的表達(dá)水平顯示出差異。但所述“樣品”并不僅限于此。
[0052]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“診斷標(biāo)記物、診斷用標(biāo)記、為進(jìn)行診斷的標(biāo)記或診斷標(biāo)記(diagnosis marker)”是指能將癌癥細(xì)胞與正常細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分,從而進(jìn)行診斷的物質(zhì),其可包括相比于正常細(xì)胞或者預(yù)后較好的癌癥細(xì)胞，預(yù)后較差的細(xì)胞中顯示增加或減少的多肽或者核酸(例:mRNA等)、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白或者糖(單糖、雙糖、寡糖等)等有機(jī)生物分子等。根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的肝癌診斷標(biāo)記物是抗-ATIC自身免疫抗體，其相比于具備正常肝臟個(gè)體的全血、血液、血清或者血漿等，在患有肝癌的個(gè)體的全血、血液、血清或者血漿等中特異性地顯示出更高的表達(dá)。
[0053]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“肝癌(liver cancer)”是指起源于肝細(xì)胞的癌癥。肝癌包括最初從肝臟發(fā)病的原發(fā)性肝癌，以及在其他組織發(fā)病的癌癥轉(zhuǎn)移至肝臟而發(fā)病的轉(zhuǎn)移性肝癌。對(duì)于發(fā)病原因，目前還不明確，但大多患者患有肝硬變，且表明在患有肝硬變的患者和慢性活動(dòng)性乙型肝炎、或乙型肝炎帶菌者(carrier)中易發(fā)生肝癌。本發(fā)明人還確認(rèn)了使用本發(fā)明自身抗體標(biāo)記物時(shí)，可以以非常高的敏感性以及特異性診斷出個(gè)體是否得了肝癌。
[0054]本發(fā)明中測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑，是指通過(guò)確認(rèn)在肝癌發(fā)病或者疑似個(gè)體的全血、血清、血液、血漿、淋巴液以及細(xì)胞間液等中表達(dá)增加的標(biāo)記物，即抗-ATIC自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平，從而可用于檢測(cè)的分子，優(yōu)選為可與所述自身免疫抗體特異性結(jié)合的多肽。所述與自身免疫抗體特異性結(jié)合的多肽選自CLP SffFHRC (Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys ；SEQ N0.17)、CA PSffLHRC (Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys ；SEQ N0.18)、CSPSGLFSC (Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys ；SEQ N0.19)、CTPSffFHRC (Cys-Thr-Pro-Ser-`Trp-Phe-Hi s-Arg-Cys ； SEQ N0.20)中的氨基酸序列。對(duì)此進(jìn)行分析的方法的例子包括蛋白免疫印跡法(Western blot)、ELISA法、放射免疫分析法(radioimmunoassay)、放射免疫擴(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、流式細(xì)胞分析法(FACS)以及蛋白質(zhì)芯片法等，但并不僅限于此。通過(guò)所述分析方法，可比較正常對(duì)照組的抗原-抗體復(fù)合體的生成量和肝癌發(fā)病或疑似個(gè)體中的抗原-抗體復(fù)合體的生成量，并可通過(guò)其分析結(jié)果對(duì)實(shí)際的肝癌疑似個(gè)體中是否發(fā)生肝癌進(jìn)行診斷。
[0055]診斷肝癌的方法可通過(guò)本發(fā)明的抗-ATIC自身免疫抗體以及與其發(fā)生特異性結(jié)合的抗原間的抗體-抗原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“抗原-抗體復(fù)合體”是指肝癌標(biāo)記物，即自身免疫抗體和對(duì)其特異性的抗原的結(jié)合物，而抗原-抗體復(fù)合體的生成量可通過(guò)檢測(cè)標(biāo)簽(detect ion label)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量。
[0056]所述檢測(cè)標(biāo)簽可選自酶、突光物、配體、發(fā)光物、微粒(micro particle)、氧化還原反應(yīng)分子(剖號(hào)土吾:4)以及放射性同位素組成的組中，但并不僅限于此。
[0057]使用酶作為檢測(cè)標(biāo)簽時(shí)可利用的酶，例如可為β -葡萄糖醛酸酶，β -D-葡萄糖苷酶，β -D-半乳糖苷酶，脲酶，過(guò)氧化物酶或者堿性磷酸酶，乙酰膽堿酯酶，葡萄糖氧化酶，己糖激酶和GDPase、RNa se，葡萄糖氧化酶和熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶(星厶砷眘詞早砷叫H砷外岑召珅砷)、β_內(nèi)酰胺酶等，但并不僅限于此。熒光物可為例如熒光素、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛、熒光胺等，但并不僅限于此。配體可為例如生物素衍生物等，但并不僅限于此。發(fā)光物可為例如吖啶酯、熒光素、熒光素酶等，但并不僅限于此。微粒可為例如膠體金、著色的乳膠等，但并不僅限于此。氧化還原反應(yīng)分子可為例如二茂鐵、釕絡(luò)合物、紫羅堿、苯醌、鈦離子、銫離子、二酰亞胺、1，4-苯醌、氫醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、[MO(CN)8]4-等，但并不僅限于此。放射性同位素可為例如3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、1251、1311、186Re 等，但并不僅限于此。
[0058]本發(fā)明人為鑒定與本發(fā)明自身免疫抗體結(jié)合的表位序列，使用在7個(gè)氨基酸序列末端存在半胱氨酸而形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的噬菌體呈現(xiàn)環(huán)肽庫(kù)體系，優(yōu)選在篩選與抗-ATIC自身免疫抗體特異性結(jié)合的噬菌體的同時(shí)，從篩選出的噬菌體中純化與本發(fā)明抗體，即抗-ATIC自身免疫抗體具有良好反應(yīng)性的組，用包被抗原處理后，確認(rèn)了與結(jié)合于所述抗原的免疫抗體的反應(yīng)性，從而確認(rèn)了這些氨基酸序列(表1)。 [0059]本發(fā)明另一方面，提供一種包括測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物的診斷肝癌的用途。
[0060]所述包括測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的制劑的肝癌診斷用組合物如上所述，本發(fā)明中可利用與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段本身，或者包括測(cè)定其表達(dá)水平的制劑的組合物，用于診斷肝癌的用途。
[0061]本發(fā)明另一方面，提供一種生產(chǎn)本發(fā)明自身免疫抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0062]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“雜交瘤”是指將兩種細(xì)胞人工融合而制備成的細(xì)胞，即利用聚乙二醇等可引起細(xì)胞融合的物質(zhì)或使用某些種類(lèi)的病毒使兩個(gè)以上的同種細(xì)胞或異種細(xì)胞發(fā)生融合的細(xì)胞。雜交瘤將不同細(xì)胞具有的不同的功能整合至一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，雜交瘤中最有代表性的是淋巴細(xì)胞。特別是在骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)或存在于脾臟或者淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞中，融合抗體生成細(xì)胞的前體細(xì)胞(B細(xì)胞)而得的雜種細(xì)胞，可制備出單克隆抗體，故廣泛應(yīng)用于研究和臨床中。此外，還有制備淋巴因子(生理活性物質(zhì))的T細(xì)胞與其腫瘤細(xì)胞(雜交瘤)等也被普遍使用。本發(fā)明中的生產(chǎn)自身免疫抗體的雜交瘤，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本領(lǐng)域已公知的細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖冃魏笫褂谩１景l(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將以HBx轉(zhuǎn)染的小鼠中，確認(rèn)為發(fā)生了肝癌的個(gè)體的脾臟細(xì)胞確保為B細(xì)胞群，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞群，篩選出生成TAB-XC154克隆分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并于2011年2月21日將其保藏于韓國(guó)生命工學(xué)研究院典型培養(yǎng)物保藏中心，獲得保藏編號(hào)KCTCl 1873BP。所述細(xì)胞株優(yōu)選保藏編號(hào)為KCTCl 1873BP的細(xì)胞株。
[0063]本發(fā)明另一方面，提供一種包含本發(fā)明組合物的肝癌診斷用試劑盒。
[0064]本發(fā)明的肝癌診斷用試劑盒可包括:用于測(cè)定診斷肝癌的標(biāo)記物，即抗-ATIC自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的引物、探針或者選擇性識(shí)別標(biāo)記物的抗體，以及適用于分析方法的一種或者一種以上的其他組成成分的組合物、溶液或者裝置。[0065]并且，本發(fā)明中用于測(cè)定由編碼所述診斷標(biāo)記物ATIC的基因來(lái)編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的試劑盒，為了實(shí)現(xiàn)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)，還可包括適當(dāng)?shù)木彌_溶液、顯色酶或者用熒光物質(zhì)標(biāo)記的二抗以及顯色基質(zhì)等。作為所述基質(zhì)，可利用由硝酸纖維素膜、聚乙烯樹(shù)脂合成的96孔板，由聚苯乙烯樹(shù)脂合成的96孔板以及由玻璃制成的載玻片等；作為顯色酶可使用過(guò)氧化物酶(peroxidase)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)等；作為突光物質(zhì)可使用FITC、RITC等；作為顯色基底液可使用2，2’ -氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸_6)銨鹽(ABTS )或者鄰苯二胺(OPD )、四甲基聯(lián)苯胺(TMB )。
[0066]所述試劑盒中，為測(cè)定蛋白質(zhì)水平而進(jìn)行的分析方法包括:蛋白免疫印跡法(Western blot)、ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)、放身寸免疫分析法(radioimmunoassay )、放射免疫擴(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、流式細(xì)胞分析法以及蛋白質(zhì)芯片法等，但并不僅限于此，且本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選為使用ELISA方法的試劑盒。
[0067]為測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行的ELISA方法包括:利用識(shí)別附著于固體支持體的抗原的標(biāo)記抗體的直接ELISA ;利用在識(shí)別附著于支持體的抗原的抗體復(fù)合體中，識(shí)別捕獲抗體的標(biāo)記抗體的間接ELISA ;在附著于固體支持體的抗體和抗原的復(fù)合體中，利用識(shí)別抗原的另一種標(biāo)記抗體的直接夾心ELISA ;在附著于固體支持體的抗體和抗原復(fù)合體中，與識(shí)別抗原的另一種抗體反應(yīng)后，利用能識(shí)別該抗體的二抗的間接夾心ELISA等多種ELISA方法。例如，可通過(guò)在固體支持體上附著上抗體，與樣品反應(yīng)后，再附著能識(shí)別抗原-抗體復(fù)合物的抗原的標(biāo)記抗體，利用酶進(jìn)行顯色；或?qū)ψR(shí)別抗原-抗體復(fù)合體的抗體，附著標(biāo)記的二抗，再利用酶進(jìn)行顯色的夾心ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)確認(rèn)診斷標(biāo)記物抗-ATIC自身免疫抗體的表達(dá)程度，確認(rèn)肝癌的發(fā)生與否。優(yōu)選使用選自SEQ N0.17至20中的氨基酸序列用作捕獲 抗-ATIC自身免疫抗體的捕獲子時(shí)，更優(yōu)選使用SEQ N0.17的氨基酸序列，可以以較高的敏感性和特異性診斷癌癥。
[0068]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用肽噬菌體文庫(kù)對(duì)與本發(fā)明自身免疫抗體反應(yīng)的表位序列進(jìn)行鑒定，并利用所述鑒定的序列與樣品中的自身免疫抗體，即一抗進(jìn)行反應(yīng)，再將其與二抗(抗-人IgGAM-HRP)進(jìn)行反應(yīng)，從而確認(rèn)抗原-抗體復(fù)合體的生成與否以及其生成量，結(jié)果從正常個(gè)體和肝癌個(gè)體的血清中可觀(guān)察到明顯不同的圖案(圖7)。利用所述方法檢測(cè)抗-ATIC自身免疫抗體以及利用其診斷肝癌時(shí)，可以以較高的特異性和敏感性診斷出肝癌。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中利用ELISA進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，確認(rèn)了其可以以約87%的敏感性和約88%的特異性，區(qū)分以及診斷出正常個(gè)體和肝癌個(gè)體(圖7)。并且，利用相同的方法對(duì)乳腺癌患者血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，顯示所述方法無(wú)法將乳腺癌患者的血清與正常個(gè)體區(qū)分開(kāi)，從而確認(rèn)了本發(fā)明的方法對(duì)于診斷肝癌顯示出特異性(圖8)。
[0069]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“敏感性”，是指對(duì)患有疾病的個(gè)體能檢測(cè)出是陽(yáng)性的比例，其是使用診斷方法時(shí)，實(shí)際能多好的檢測(cè)出相關(guān)個(gè)體的基準(zhǔn)。并且，術(shù)語(yǔ)“特異性”是指將正常個(gè)體檢測(cè)出是陰性的比例，其是能多好的區(qū)分出未患有相關(guān)疾病的個(gè)體的基準(zhǔn)。
[0070]并且，還可利用對(duì)所述診斷標(biāo)記物使用一種以上的抗體的蛋白免疫印跡。從樣品中分離總蛋白質(zhì)，利用電泳將蛋白質(zhì)以大小進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并與抗體反應(yīng)。對(duì)生成的抗原-抗體復(fù)合體的量，利用標(biāo)記抗體確認(rèn)的方法，確認(rèn)由基因表達(dá)生成的蛋白質(zhì)的量，從而確認(rèn)肝癌的發(fā)生與否。并且，還可利用所述標(biāo)記物的一種以上的抗體進(jìn)行組織免疫染色。從發(fā)生肝癌或者疑似個(gè)體中采集組織并進(jìn)行固定后，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備石蠟包埋塊兒。將其制備成幾μπι厚度的切片，貼至載玻片后，通過(guò)公知的方法，將其與本發(fā)明的包含自身免疫抗體的抗原結(jié)合部位的片段進(jìn)行反應(yīng)。之后，將未反應(yīng)的抗體洗脫下來(lái)，并用所述記載的檢測(cè)標(biāo)簽中的一種進(jìn)行標(biāo)記，在顯微鏡下解讀抗體的標(biāo)記與否。并且，還可利用將所述標(biāo)記物的一種以上的抗體，以極高的密度，排列于基板上的特定位置的蛋白質(zhì)芯片。利用蛋白質(zhì)芯片分析樣品的方法是，從樣品中分離蛋白質(zhì)，將分離出的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)芯片混合形成抗原-抗體復(fù)合體，并對(duì)其進(jìn)行解讀，確認(rèn)蛋白質(zhì)的存在或者表達(dá)程度，從而確認(rèn)肝癌的發(fā)生與否。
[0071]本發(fā)明另一方面，提供一種利用本發(fā)明組合物的肝癌的診斷方法，其包括檢測(cè)與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的步驟。
[0072]本發(fā)明的肝癌診斷方法優(yōu)選包括以下步驟:a)從肝癌疑似個(gè)體的樣品中，測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的步驟；以及b)將所述表達(dá)水平與正常對(duì)照組樣品中與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平進(jìn)行比較的步驟。
[0073]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”是指包括人的哺乳類(lèi)動(dòng)物，具體包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔子、倉(cāng)鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、羊、牛、魚(yú)以及鳥(niǎo)，優(yōu)選包括人。
[0074]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照組”是指來(lái)源于抗-ATIC自身免疫抗體的表達(dá)較發(fā)生肝癌或者疑似個(gè)體相比較低的個(gè)體的樣品，其為利用本發(fā)明中的抗-ATIC自身免疫抗體的抗原-抗體反應(yīng)診斷肝癌時(shí)，成為基準(zhǔn)的樣品。
[0075]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“樣品”可為選自全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、痰、淋巴液、腦脊液以及細(xì)胞間液中的一種 以上的樣品，其肝癌診斷指標(biāo)，即抗-ATIC自身免疫抗體的表達(dá)水平顯示出差異。但所述“樣品”并不僅限于此。
[0076]本發(fā)明中為測(cè)定所述蛋白質(zhì)表達(dá)水平而使用的方法包括蛋白免疫印跡法、ELISA法、放射免疫分析法、放射免疫擴(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、火箭免疫電泳、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、FACS法以及蛋白質(zhì)芯片法等，但并不僅限于此。對(duì)于所述測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)水平方法的詳細(xì)內(nèi)容如上所述。
[0077]本發(fā)明另一方面，提供一種利用本發(fā)明自身免疫抗體的肝癌治療劑的篩選方法，具體包括:(a)測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的步驟；(b)給予肝癌治療用備選物質(zhì)的步驟；以及(C)確認(rèn)與所述步驟(a)相比，與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平降低的步驟。
[0078]本發(fā)明的所述步驟(a)中，作為測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的步驟，可使用所述常規(guī)測(cè)定表達(dá)水平的方法，不受特別的限制。
[0079]本發(fā)明的所述步驟(b)以及(C)是給予肝癌治療用備選物質(zhì)的步驟，以及確認(rèn)與所述步驟(a)相比，與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平降低的步驟。
[0080]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“肝癌治療用備選物質(zhì)”是指有望具有治療肝癌的作用的物質(zhì)，可使用有望具有直接或間接使肝癌好轉(zhuǎn)或改善肝癌的物質(zhì)，不受特別的限制，可包括化合物、基因或者蛋白質(zhì)等所有有望具有治療功能的物質(zhì)。本發(fā)明的篩選方法中，確認(rèn)給予所述備選物質(zhì)前后，抗-ATIC自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平的同時(shí)，所述表達(dá)水平較給藥前降低時(shí)，可決定相應(yīng)的備選物質(zhì)為肝癌治療劑。
【具體實(shí)施方式】
[0081]以下，將通過(guò)下述實(shí)施例詳述本發(fā)明。下述實(shí)施例僅是為了例示本發(fā)明，而不能解釋為本發(fā)明的保護(hù)范圍僅限于下述實(shí)施例。
[0082]實(shí)施例1:獲得HBx小鼠來(lái)源的XC154自身免疫抗體
[0083]為獲得癌癥發(fā)生時(shí)，一起產(chǎn)生的自身免疫抗體，使用了 HBx轉(zhuǎn)化小鼠，已知其發(fā)生的肝癌與人肝癌具有類(lèi)似的形態(tài)。從飼養(yǎng)中的HBx轉(zhuǎn)化小鼠中，取確認(rèn)發(fā)生了肝癌的個(gè)體的脾臟(spleen)細(xì)胞,將此作為B細(xì)胞,并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行細(xì)胞融合,制備成B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞融合根據(jù)一般的B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的制備方法。融合的細(xì)胞利用次黃嘌呤 _ 氨基蝶呤 _ 胸苷培養(yǎng)基(hypoxanthine-aminopt erin-thymidine medium, HAT培養(yǎng)基)進(jìn)行I次篩選，僅取形成克隆的細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)在細(xì)胞培養(yǎng)液中，能檢測(cè)出癌癥細(xì)胞反應(yīng)抗體的細(xì)胞重新進(jìn)行選擇，繼續(xù)培養(yǎng)。 [0084]自身免疫抗體對(duì)于癌癥細(xì)胞的反應(yīng)性的確認(rèn)，是通過(guò)對(duì)固定以及通透化(f ixation&permeabilization)的癌癥細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色(intracellular staining)后，利用流式細(xì)胞測(cè)定法(flow cytometric ananlysis)進(jìn)行分析。詳細(xì)說(shuō)明如下:將聚集至70-80%的H印G2或者Hepalclc7細(xì)胞用胰蛋白酶處理，從培養(yǎng)板解離下來(lái)，用PBS洗滌后，每2X IO5個(gè)細(xì)胞用100 μ I的固定/破膜(07如打1/^7如?虹111)溶液(80公司)，在41:條件下處理20分鐘，進(jìn)行固定以及通透化。反應(yīng)后分別加入Iml的固定/破膜(Cytofix/Cytoperm)溶液(BD公司)混勻后，以1700rpm離心5分鐘，通過(guò)獲得細(xì)胞沉淀的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌。結(jié)束洗滌后添加50 μ I的一抗溶液(B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或者純化的一抗溶液)，在4°C條件下反應(yīng)40分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，細(xì)胞洗滌三次，用抗小鼠Igs-FITC (DaKo公司)，4°C條件下反應(yīng)40分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，再次將細(xì)胞洗滌三次，用300μ I的PBS重懸細(xì)胞沉淀，并用流式細(xì)胞儀(BD公司)進(jìn)行分析。通過(guò)獲得與抗體反應(yīng)相應(yīng)的熒光數(shù)值的平均值，比較各個(gè)反應(yīng)。作為沒(méi)有抗體反應(yīng)的對(duì)照組，添加了 50 μ I沒(méi)有一抗的DMEM培養(yǎng)基。
[0085]結(jié)果，可從B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞中確認(rèn)多種自身免疫抗體生成的克隆，但本發(fā)明中進(jìn)行了對(duì)于其中之一，即TAB-XC154克隆分泌抗體的分析(圖1)。于2011年2月21日將生成TAB-XC154克隆分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株包藏于韓國(guó)生命工學(xué)研究院(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，并獲得保藏編號(hào)KCTCl 1873ΒΡ。
[0086]實(shí)施例2:對(duì) XC154 抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementary Determi ning Region,⑶R)的分析以及抗體的純化
[0087]確認(rèn)XC154抗體能特異性識(shí)別癌癥細(xì)胞中表達(dá)的抗原后，為得到關(guān)于XC154抗體的抗原識(shí)別特異性的信息，分析了所述抗體的互補(bǔ)決定區(qū)序列。詳細(xì)方法如下:
[0088]收集IO6個(gè)左右的XC154抗體生成細(xì)胞，利用RNA提取試劑盒(Q iagen公司)提取總 RNA。利用互補(bǔ) DNA 合成(complementary DNA (cDNA) synthesis)試劑盒(Invitrogen公司)從5 μ g的總RNA合成出了 cDNA，并利用合成出的IygW cDNA和小鼠重鏈恒定區(qū)引物(Mou se Heavy chain constant region primer) F5，-CTT CCG GAA TTC S AR GTNMAG CTG SAG SAG TCff GG-3’ (SEQ N0.21)、R5’ -GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTGACT CTC-3，(S EQ N0.22)和小鼠輕鏈恒定區(qū)引物(Mouse light chain constant reg ionprimer)F5’-GGG AGC TCG AYAT TGT GMT SAC MCA Rff C TMC A_3’ (SEQ N0.23)、R5’-GGTGCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC_3’(SEQ N0.24)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly merasechain reaction，PCR)擴(kuò)增小鼠重鏈和輕鏈的包含CDR的部位后，又使用TOP Cloner Bluntkit (Enzynomics 公司)連接于 pTOP B Iunt V2 載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(transformation)至E.coli DH5 α ,接種至包含氨節(jié)西林(ampicilin)的LB合成培養(yǎng)基板上,在37°C條件下培養(yǎng)15小時(shí)。將各個(gè)在平板中形成的集落，分別在LB液體合成培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)以上，提取質(zhì)粒，并分析相關(guān)堿基序列。通過(guò)分析出的堿基序列決定蛋白質(zhì)序列，將其利用卡巴特⑶R的定義為基準(zhǔn)進(jìn)行分析，決定XC154抗體的⑶R (圖2)。
[0089]為分析XC154抗體的特異性反應(yīng)，需要純化成單一成分的自身免疫抗體。因此，本發(fā)明中將大量培養(yǎng)XC154抗體形成克隆的細(xì)胞培養(yǎng)液或抗體生成細(xì)胞注射至小鼠腹腔，取得腹水液(ascites fluid)用于抗體的純化。對(duì)XC154抗體分型(isotyping)的結(jié)果，確認(rèn)為是IgM，并且為了純化IgM的親和層析，使用甘露醇結(jié)合蛋白(MBP)-瓊脂糖(Mannose-binding protein immobilized agarose)或者蛋白 L 瓊月旨糖(P rotein Lagarose)。純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE后,利用考馬斯亮藍(lán)染色(comassie staining)進(jìn)行確認(rèn)，并用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)定量后使用。
[0090]實(shí)施例3:確認(rèn)XC154抗體特異反應(yīng)性抗原在各種癌癥細(xì)胞中的表達(dá)
[0091]為確認(rèn)XC154抗體對(duì)于多種癌癥細(xì)胞株的反應(yīng)性，以上述實(shí)施例1的方法對(duì)各種癌癥細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色后，利用流式細(xì)胞測(cè)定方法進(jìn)行分析(圖3)。從結(jié)果中，確認(rèn)了XC154抗體反應(yīng)蛋白質(zhì)在H印G2、SK-Hep-1等肝癌癥細(xì)胞株和HeLa、LNcap_LN3、A549等多種種類(lèi)的癌癥細(xì)胞株中均過(guò)表達(dá)。
[0092]并且，為確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色后利用共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察，在細(xì)胞質(zhì)的位置或者細(xì)胞膜的位置能確認(rèn)比較強(qiáng)的染色(圖3)。
`[0093]實(shí)施例4:XC154自身免疫抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的確認(rèn)
[0094]利用蛋白免疫印跡的方法，在癌癥細(xì)胞株中確認(rèn)了 XC154抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的表達(dá)。收集待分析的細(xì)胞溶于NP40緩沖液(N P40緩沖液:包含1.0%(ν/ν)的NP40，蛋白酶抑制劑混合物(protea se inhibitor cocktail (Roche公司)的PBS)作為蛋白質(zhì)分析樣品使用。利用考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。將準(zhǔn)備好的蛋白質(zhì)樣品，以50 μ g量，在10%還原的SDS-PAGE條件下進(jìn)行展開(kāi)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。結(jié)束轉(zhuǎn)移后，浸潰于5%(w/v)脫脂奶(skim milk)/TBS (三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水，Tris-buffered s aline)進(jìn)行封閉(blocking),后用一抗處理。作為一抗,將純化的XC154抗體，以0.1 μ g/ml的濃度稀釋于封閉溶液后使用。一抗處理完后，利用TBST (包含0.1%(v/v)吐溫-20的TBS)充分洗滌，再用二抗(抗-小鼠IgGAM-辣根過(guò)氧化物酶)進(jìn)行處理，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enha need chemiluminescence,ECL)的方法確認(rèn)抗體反應(yīng)蛋白質(zhì)的條帶。其結(jié)果，確認(rèn)了在H印G2肝癌癥細(xì)胞株以及HT29大腸癌癥細(xì)胞中，XC154抗體特異反應(yīng)性抗原蛋白質(zhì)的條帶是具有64KDa左右分子量的條帶(圖4)。
[0095]從以上結(jié)果，確認(rèn)了肝癌小鼠來(lái)源的自身免疫抗體識(shí)別在人肝癌細(xì)胞中表達(dá)的特定蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)所述結(jié)果，發(fā)明人嘗試著從隨機(jī)的肽表達(dá)文庫(kù)篩選出XC154抗體的抗原決定簇類(lèi)似物，從而推導(dǎo)出一種抗體檢測(cè)法。
[0096]實(shí)施例5:XC154抗體特異反應(yīng)性肽抗原表達(dá)噬菌體(phage)的探索
[0097]XC154抗體特異反應(yīng)性抗原決定簇是在確認(rèn)人體血清中是否含有對(duì)于相同抗原決定簇的自身免疫抗體的檢測(cè)法中最為重要的因素。為了作為XC154抗體特異反應(yīng)部位,使用簡(jiǎn)便的抗原決定簇，而不是使用整個(gè)抗原蛋白質(zhì)，從隨機(jī)肽表達(dá)文庫(kù)中篩選出了 XC154抗體特異反應(yīng)性肽抗原。作為肽表達(dá)文庫(kù)使用了以隨機(jī)序列表達(dá)七個(gè)氨基酸，兩端具有半胱氨酸殘基，從而形成環(huán)形的七個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)的噬菌體呈現(xiàn)環(huán)肽庫(kù)(Ph.D.-C7C PhageDisplay Peptide Library kit ;新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室有限公司),淘選過(guò)程根據(jù)制造商的指示進(jìn)行。
[0098]將300ng的XC154抗體與表達(dá)2X1011個(gè)不同肽的噬菌體病毒體(vi rion)，在200 μ ITBST溶液中混合，在常溫條件下反應(yīng)20分鐘，又與用預(yù)封閉溶液(0.1M NaHCO3,pH8.6，5mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，0.02% (w/v)的NaN3)處理的25 μ I蛋白質(zhì)L瓊脂糖珠(protein L-agar ose bead)混合后,在常溫下反應(yīng)15分鐘?？贵w反應(yīng)曬菌體，以抗體-噬菌體-蛋白質(zhì)L-瓊脂糖結(jié)合體的形態(tài)，通過(guò)離心回收沉淀物，后用TBST洗滌幾次后，利用Iml的ρΗ2.2的溶出液(0.2Μ甘氨酸-鹽酸，ρ Η2.2，lmg/ml的BSA)處理而溶出。后迅速加入PH9.1的IM Tris-HCl溶液，使其變成中性pH。溶出的噬菌體中的一部分，用于滴定(titr ation)噬菌體水，而其余的用于擴(kuò)增噬菌體。對(duì)于擴(kuò)增的噬菌體，重新通過(guò)所述方法進(jìn)行淘選。
[0099] 其結(jié)果，對(duì)XC154抗體進(jìn)行五次淘選過(guò)程之后，獲得了四個(gè)具有不同肽序列的噬菌體。利用XC154抗體進(jìn)行淘選的過(guò)程中，至第4次時(shí)可以觀(guān)察到到隨著次數(shù)的增加，擴(kuò)增的噬菌體數(shù)增加，從而特異性結(jié)合的噬菌體也增加(圖5a)。獲得的噬菌體中隨機(jī)取10個(gè)，利用DN A堿基序列分析方法決定肽部位的序列，并決定由此獲得的氨基酸序列(表1)。比較獲得的抗原類(lèi)似物的序列的結(jié)果，PSffFHR的序列可在6種抗原類(lèi)似物序列中反復(fù)確認(rèn)，從而可預(yù)測(cè)作為抗原類(lèi)似物時(shí)所述序列非常重要。
[0100]表1
[0101]
【權(quán)利要求】
1.與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，其特征在于，所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段識(shí)別選自SEQ N0.17至SEQ N0.20的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，其特征在于，所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段識(shí)別SEQ N0.17的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，其特征在于，所述自身免疫抗體包括包含SEQ N0.3的重鏈CDR1、SEQ N0.4的重鏈CDR2、SEQ N0.5的重鏈CDR3的重鏈可變區(qū)；和包含SEQ N0.6的輕鏈CDR1、SEQ N0.7的輕鏈CDR2、SEQ N0.8的輕鏈⑶R3的輕鏈可變區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，其特征在于，所述自身免疫抗體包含SEQ N0.1的重鏈氨基酸序列以及SEQ N0.2的輕鏈氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段，其特征在于，其由保藏編號(hào)KCTCl 1873BP的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
7.一種與權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體特異性結(jié)合的抗原片段，其特征在于，其具有選自SEQ N0.17至SEQ N0.20的氨基酸序列。
8.一種肝癌診斷用組合物，其特征在于，其包括測(cè)定權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肝癌診斷用組合物，其特征在于，所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段特異性識(shí)別選自SEQ N0.17至SEQ N0.20的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肝癌診斷用組合物，其特征在于，所述制劑是能與所述自身免疫抗體特異性結(jié)合的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肝癌診斷用組合物，其特征在于，與所述自身免疫抗體特異性結(jié)合的多肽是選自SEQ N0.17至SEQ N0.20的氨基酸序列。
12.—種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，其可產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的自身免疫抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株是保藏編號(hào)為KCTCl 1873BP的細(xì)胞株。
14.一種包含權(quán)利要求8至11中任意一項(xiàng)中所述組合物的肝癌診斷用試劑盒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒可使用選自蛋白免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、放射免疫擴(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、流式細(xì)胞分析法以及蛋白質(zhì)芯片法中的一種方法。
16.一種肝癌診斷方法，其特征在于，其包括利用權(quán)利要求8至11中任意一項(xiàng)中所述的組合物，檢測(cè)出與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的肝癌診斷方法，其特征在于，包括: (a)從肝癌疑似個(gè)體的樣品中測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的步驟；以及 (b)將所述表達(dá)水平，與正常對(duì)照組樣品中與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平進(jìn)行比較的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的肝癌診斷方法，其特征在于，所述樣品為從個(gè)體分離的選自全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、痰、淋巴液、腦脊液以及細(xì)胞間液中的一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的肝癌診斷方法，其特征在于，測(cè)定所述自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段表達(dá)水平而使用的方法可以是選自蛋白免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、放射免疫擴(kuò)散法、雙向擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、組織免疫染色法、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體結(jié)合分析法、流式細(xì)胞分析法以及蛋白質(zhì)芯片法中的一種方法。
20.一種肝癌治療劑的篩選方法，其特征在于，其包括: Ca)測(cè)定與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平的步驟； (b)給予肝癌治療用備選物質(zhì)的步驟；以及 (c)確認(rèn)與所述步驟(a)相比，與ATIC特異性結(jié)合的自身免疫抗體或者包含其抗原結(jié)合部位的片段的表達(dá)水平降低的步`驟。
【文檔編號(hào)】C07K16/30GK103732627SQ201280038342
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月2日
【發(fā)明者】趙恩偉, 許昌圭, 高正憲, 禹美京, 兪香淑, 黃海民 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院