針對(duì)gpcr:g蛋白復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及來(lái)自其的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和信號(hào)傳遞的領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及針對(duì)和／或特異性結(jié)合GPCR：G蛋白復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。還提供了編碼這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列，和表達(dá)或能夠表達(dá)這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞。本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用作G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)和功能表征的通用工具，所述G蛋白偶聯(lián)受體與下游的異源三聚體G蛋白復(fù)合，并與多種天然或合成配體結(jié)合，用于研究G蛋白活化的動(dòng)力學(xué)特征，以及用于利用GPCR：G蛋白復(fù)合物的篩選和藥物發(fā)現(xiàn)工作。
【專利說(shuō)明】針對(duì)GPCR:G蛋白復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及來(lái)自其的用途 發(fā)明領(lǐng)域
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和信號(hào)傳遞的領(lǐng)域。本發(fā)明特別 涉及針對(duì)和/或特異性結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。還提供了編碼這類結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的核酸序列，和表達(dá)或能夠表達(dá)這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞。本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用作 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)和功能表征的通用工具，所述G蛋白偶聯(lián)受體與下游的異源三聚體G 蛋白復(fù)合，并與各種天然或合成配體結(jié)合，所述工具用于研究G蛋白活化的動(dòng)力學(xué)特征，以 及用于利用GPCR :G蛋白復(fù)合物的篩選和藥物發(fā)現(xiàn)工作。
[0002] 背景
[0003] 7次跨膜受體（7TMR)，也被稱為G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)是人基因組中的最大類的 受體，是用于醫(yī)學(xué)治療的最常見(jiàn)靶向蛋白質(zhì)類型。在過(guò)去60年間，從藥理學(xué)至體內(nèi)功能表 征，對(duì)不同GPCR的理解發(fā)生了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。目前高分辨率的結(jié)構(gòu)研究為GPCR活化和構(gòu)成 的活性的分子機(jī)制提供了深入觀察（例如，Rasmussen等人，2011)。然而，尚缺乏GPCR如 何與其下游靶標(biāo)相互作用并調(diào)控其活性的分子細(xì)節(jié)。與其下游蛋白質(zhì)復(fù)合的GPCR的結(jié)構(gòu) 令人非常感興趣，不僅因?yàn)檫@類相互作用是藥理學(xué)相關(guān)的，而且因?yàn)閷?duì)分子間相互作用的 原子水平的理解是破解功能選擇性的秘密、不同激動(dòng)劑使一種受體產(chǎn)生不同下游效應(yīng)的能 力的關(guān)鍵。現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即，即使尺寸小，GPCR也是具有多種信號(hào)傳遞 輸出的復(fù)雜變構(gòu)組織。
[0004] 一旦激活，GPCR就以GTP依賴性的方式，通過(guò)三種蛋白質(zhì)的復(fù)合物傳達(dá)信號(hào)，所述 復(fù)合物被稱為異源三聚體G蛋白或Ga β Y。胞外配體與GPCR的結(jié)合調(diào)控了催化Ga β Y 中的GDP-GTP交換的能力，從而調(diào)控了第二信使的胞內(nèi)水平。失活的Ga β Υ異源三聚體 包括2個(gè)王要兀件：G ct · GDP和G β γ異源_聚體。γ隔尚Gc[上的switch II兀件， 使其不能與第二信使系統(tǒng)相互作用，所述第二信使系統(tǒng)例如涉及cAMP、二?；视秃外}的 那些。活化的GPCR催化從G a釋放⑶P，允許GTP結(jié)合和釋放活化的G a -GTP亞基。在這 一狀態(tài)下，switch II形成了被GTP的γ磷酸穩(wěn)定的螺旋，使其能夠與效應(yīng)子，如腺苷酸環(huán) 化酶相互作用。雖然關(guān)于Ga亞基如何與其下游靶標(biāo)相互作用并調(diào)控其活性的理解取得了 較大進(jìn)展，但尚不清楚活化的GPCR如何通過(guò)催化Ga β γ上的核苷酸交換而啟動(dòng)該過(guò)程。
[0005] 藥物研發(fā)的工作一般集中在與特定催化位點(diǎn)或活性位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的小分子配 體上，利用靶的靜態(tài)模型作為起點(diǎn)。該方法已鑒別和驗(yàn)證了多個(gè)目前正在使用的可行的活 性位點(diǎn)治療劑。然而，新藥化合物的高失敗率（僅約8%的I期臨床治療劑最終獲得食品 藥品監(jiān)管局（Food and Drug Administration)批準(zhǔn)，每種藥物的保守成本為8億美元）反 映出多數(shù)工作是不成功的，通常一旦靶被視為不可用于藥物研發(fā)（undrugable)就會(huì)被放 棄（Lee&Craik,2009)。相當(dāng)一部分的這類失敗是由于所討論的祀的最主要的構(gòu)象不對(duì)應(yīng) 可用于藥物研發(fā)（drugable)的構(gòu)象，后者是對(duì)治療適應(yīng)癥而言藥物必須結(jié)合才有效的構(gòu) 象。例如，已經(jīng)證實(shí)了獲得結(jié)合激動(dòng)劑的活性狀態(tài)的GPCR結(jié)構(gòu)的嘗試是非常困難的，因?yàn)?在缺少G蛋白的條件下，該狀態(tài)是內(nèi)在不穩(wěn)定的。目前，利用構(gòu)象選擇性穩(wěn)定的納米抗體或 Xaperones--開(kāi)始能夠獲得活性狀態(tài)的gpcr的結(jié)構(gòu)，所述納米抗體或Xaperones?· 模擬G蛋白并且增加了激動(dòng)劑在orthosteric位點(diǎn)的親和力（Rasmussen等人，2011)。 這證實(shí)了 Xaperones?使最有挑戰(zhàn)性的藥物靶的結(jié)構(gòu)鎖定在治療相關(guān)構(gòu)象中的能力 (Steyaert&Kobilka，2011)，及其用于定向藥物研發(fā)的用途，所述定向藥物研發(fā)允許特異性 的篩選對(duì)特定的靶具有較高靈敏度和選擇性的潛在藥物（W02012007593)。該技術(shù)方法的一 個(gè)限制是需要為每個(gè)GPCR靶鑒別特定的穩(wěn)定化納米抗體，這不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)錢，而且暗示要利 用不同的工具，如用于免疫和選擇目的的生物學(xué)材料等。
[0006] 因此，需要研發(fā)新的直接的工具，用于GPCR藥物靶的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)分析。
[〇〇〇7] 發(fā)明概述
[0008] 闡明與其下游異源三聚化G蛋白復(fù)合且結(jié)合至多種天然和合成配體的GPCR的結(jié) 構(gòu)和功能特征，對(duì)于理解GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制以及藥物研發(fā)工作都是有價(jià)值的。例如，迄 今為止尚未成功獲得活性狀態(tài)的三元復(fù)合物（包含激動(dòng)劑、GPCR和G蛋白）的結(jié)構(gòu)，由于 對(duì)其生物學(xué)的理解貧乏，獲得該結(jié)構(gòu)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)非常需要的。該復(fù)合物的晶 體生成被證實(shí)是非常困難的，因?yàn)橐粋€(gè)伙伴部分（受體）需要去垢劑使其溶解，而G蛋白在 去垢劑中則是不穩(wěn)定的。此外，復(fù)合物形成所需要的核苷酸也在瞬時(shí)過(guò)程中使復(fù)合物解離。
[0009] 因此，同時(shí)也是非常令人意外的是，本發(fā)明人鑒別了使GPCR和G蛋白的復(fù)合物穩(wěn) 定的工具，該工具能夠捕獲和純化這類復(fù)合物，最終使這類復(fù)合物結(jié)晶。這有利于通過(guò)例如 基于病毒篩選或設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)、高通量篩選或基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)，鑒別配體或藥物化合物 (參見(jiàn)例如，實(shí)施例10)。更具體而言，本發(fā)明人鑒別了適用于活性狀態(tài)的復(fù)合物（包含激 動(dòng)劑、GPCR和G蛋白）的結(jié)構(gòu)和功能分析的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域 (參見(jiàn)例如，實(shí)施例4-7)。令人感興趣的是，證實(shí)了一些上述GPCR :G蛋白復(fù)合物-選擇性 結(jié)合結(jié)構(gòu)域是特異性針對(duì)G蛋白的，而不針對(duì)GPCR。例如，在不與β-腎上腺素能受體接 觸的條件下，鑒別了結(jié)合位于的Ga s和γ界面上的Gs的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（參見(jiàn)例如，實(shí)施 例3)，因此所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于捕獲和穩(wěn)定其他的Gs偶聯(lián)受體，如對(duì)精氨酸血管加壓素 受體2 (V2R)證實(shí)的（參見(jiàn)例如，實(shí)施例9)。因此，特別有利的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域針對(duì)GPCR :G 蛋白復(fù)合物中的G蛋白，因?yàn)檫@類結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用作穩(wěn)定和捕獲與特定G蛋白相互作用的 GPCR范圍的活性狀態(tài)復(fù)合物的一般工具。
[〇〇1〇] 因此，根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的 復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更具體而言，相比分別單獨(dú)與G蛋白和/或與GPCR結(jié)合，本文所述 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以更高的親和力結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù)合物。此外，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域增強(qiáng) 了 G蛋白對(duì)GPCR的親和力。因此，本發(fā)明提供了針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋 白的復(fù)合物的構(gòu)象表位的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?fù)合物穩(wěn)定或鎖定在特定的構(gòu)象 狀態(tài)，更具體而言是活性構(gòu)象狀態(tài)。
[〇〇11] 一般而言，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合任何由GPCR和G蛋白的復(fù)合物可利用或 可接近的構(gòu)象表位。這些構(gòu)象表位可以由包含在復(fù)合物中的單個(gè)蛋白質(zhì)呈遞，和/或僅在 形成復(fù)合物時(shí)呈遞。此外，這些構(gòu)象表位可以或可以不由單個(gè)蛋白質(zhì)單獨(dú)呈遞。根據(jù)一個(gè) 特定的實(shí)施方案，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合包含在復(fù)合物中的G蛋白，而不結(jié)合 GPCR。
[0012] 通常，G蛋白本質(zhì)上是結(jié)合核苷酸的形式。更具體而言，G蛋白（或至少a亞基） 結(jié)合GTP或GDP，這取決于特定GPCR的活化狀態(tài)，如本文中另外描述的。結(jié)合GPCR的激動(dòng) 劑促進(jìn)與結(jié)合了⑶P的Ga β Y異源三聚體相互作用，導(dǎo)致Ga上的⑶P交換為GTP和G蛋 白功能性解離為Ga-GTP和Gi3 γ亞基，這是進(jìn)一步的胞外信號(hào)傳遞所需的。在特定的實(shí) 施方案中，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域在缺少核苷酸的條件下特異性結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù)合物， 并使其穩(wěn)定，更具體的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合和穩(wěn)定這樣的GPCR:G蛋白復(fù)合物，其中G蛋白處 于不合核苷酸的形態(tài)。在特定的實(shí)施方案中，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合位于所述G 蛋白的a和β-Υ亞基之間的界面上的構(gòu)象表位，并由此阻斷⑶P / GTP結(jié)合位點(diǎn)，和干 擾GDP / GTP結(jié)合。由此且令人驚訝的，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域在存在核苷酸（特別是鳥(niǎo) 嘌呤核苷酸或其類似物，例如GTP γ S)的條件下阻止或抑制GPCR :G蛋白復(fù)合物解離。本文 所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域還阻止或抑制核苷酸與G蛋白的結(jié)合。
[0013] 優(yōu)選的，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR、G蛋白和一個(gè) 或多個(gè)受體配體的復(fù)合物。通常，受體配體是激動(dòng)劑、或正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑、或其組合。
[0014] 根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含 Gs蛋白偶聯(lián)受體和Gs蛋白的復(fù)合物；或包含Gi蛋白偶聯(lián)受體和Gi蛋白的復(fù)合物；或包含 Gt蛋白偶聯(lián)受體和Gt蛋白的復(fù)合物；或包含Ggust蛋白偶聯(lián)受體和Ggust蛋白的復(fù)合物； 或包含Gz蛋白偶聯(lián)受體和Gz蛋白的復(fù)合物；或包含Golf蛋白偶聯(lián)受體和Golf蛋白的復(fù) 合物；或包含Gq蛋白偶聯(lián)受體和Gq蛋白的復(fù)合物；或包含G12偶聯(lián)受體和G12蛋白的復(fù)合 物；或包含G13偶聯(lián)受體和G13蛋白的復(fù)合物。包含在復(fù)合物中的GPCR和/或G蛋白可來(lái) 自相同或不同的物種，特別是來(lái)自哺乳動(dòng)物物種。優(yōu)選的，GPCR是人蛋白質(zhì)。
[0015] 一般而言，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是能夠特異性結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù)合物的任 何非天然存在的分子或其部分。特別的是，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含這樣的氨基酸序 列的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述氨基酸序列包含根據(jù)下列通式（1)的4個(gè)框架區(qū)（FR1 至FR4)和3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R3):
[0016] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)。
[〇〇17] 優(yōu)選的，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是源自駱駝科物種的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域， 特別是納米抗體或VhH。
[0018] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含這樣的氨基酸序列的免疫球 蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述氨基酸序列包含根據(jù)下列通式（1)的4個(gè)框架區(qū)（FR1至FR4)和 3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R3):
[0019] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)，
[0020] 并且其中⑶R1選自：
[0021] a) SEQ ID NO :13-18,
[0022] b)與SEQ ID NO :13-18具有至少80%氨基酸同一性的多肽，
[0023] c)與SEQ ID NO :13-18具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽，
[0024] 并且其中CDR2選自：
[0025] a) SEQ ID NO :25-30,
[0026] b)與SEQ ID NO :25-30具有至少80%氨基酸同一性的多肽，
[0027] c)與SEQ ID NO :25-30具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽，
[0028] 并且其中CDR3選自：
[0029] a) SEQ ID NO :37-42,
[0030] b)與SEQ ID NO :37-42具有至少80%氨基酸同一性的多肽，
[0031] c)與SEQ ID NO :37-42具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽。
[0032] 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含這樣的氨基酸序列的免疫球蛋白單 可變結(jié)構(gòu)域，所述氨基酸序列包含根據(jù)下列通式（1)的4個(gè)框架區(qū)（FR1至FR4)和3個(gè)互 補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R3):
[0033] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1);
[0034] 其中 CDR1 是 SEQ IDNO :13 ;其中 CDR2 是 SEQ IDNO :25 ;且其中 CDR3 是 SEQ IDN0 : 37〇
[0035] 根據(jù)非常特定的實(shí)施方案，結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有選 自SEQ ID N0 :1至6的氨基酸序列。
[0036] 此外，本文描述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可以包含在多肽中。此外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可以固定 在固體支持物上。
[0037] 在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明涉及針對(duì)和/或特異性結(jié)合G蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0038] 本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想了包含本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物。復(fù)合物特別包 含GPCR、G蛋白，和任選的受體配體。在某些應(yīng)用中，本文所述的復(fù)合物是晶體。
[0039] 本發(fā)明還提供了核酸序列，特別是編碼任何本文所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何氨基酸序 列的核酸序列，以及包含任何本文所述核酸序列的重組載體。本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面是 包含任何本文所述載體或核酸的細(xì)胞，所述細(xì)胞可以表達(dá)或能夠表達(dá)GPCR和/或G蛋白。 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物及其來(lái)源的膜制品也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0040] 本文描述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、復(fù)合物和細(xì)胞可用于多種上下文和應(yīng)用中。因此，本發(fā)明 的一個(gè)方面相應(yīng)的涉及本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途，用于使包含GPCR和G蛋白，和任選 的受體配體的復(fù)合物穩(wěn)定化，所述受體配體處于功能構(gòu)象狀態(tài)，更具體的處于活性構(gòu)象狀 態(tài)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于阻止復(fù)合物在存在核苷酸的 條件下解離，所述核苷酸特別是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸或其類似物，如GTP γ S。因此，作為工具穩(wěn)定 GPCR :G蛋白復(fù)合物和阻斷功能構(gòu)象狀態(tài)（優(yōu)選活性構(gòu)象狀態(tài)）的GPCR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域在一 系列應(yīng)用中是非常有效的，如下文概括的。
[0041] 本發(fā)明的目標(biāo)是使用本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域使復(fù)合物結(jié)晶和/或解析復(fù)合物結(jié) 構(gòu)，所述復(fù)合物包含GPCR和G蛋白和任選的受體配體。
[〇〇42] 還認(rèn)為落入本發(fā)明范圍內(nèi)的是使用本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或本文所述的其來(lái)源 的細(xì)胞或模制品，來(lái)篩選調(diào)控GPCR的信號(hào)傳遞活性的化合物。
[〇〇43] 此外，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于捕獲一個(gè)或多個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)，特別是 與G蛋白和/或GPCR相互作用的蛋白質(zhì)。
[0044] 根據(jù)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于捕獲和/或純化包含GPCR和G蛋白的復(fù) 合物的方法，方法包括步驟：
[0045] a)提供本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和
[0046] b)允許結(jié)合結(jié)構(gòu)域與包含GPCR和G蛋白，和任選受體配體的復(fù)合物結(jié)合，和
[0047] c)任選的分離步驟b)中形成的復(fù)合物。
[0048] 在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及確定包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的晶體 結(jié)構(gòu)的方法，方法包括步驟：
[0049] a)提供本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和
[0050] b)允許結(jié)合結(jié)構(gòu)域與包含GPCR和G蛋白，和任選受體配體的復(fù)合物結(jié)合，和
[0051] c)使步驟b)中形成的復(fù)合物結(jié)晶。
[0052] -些本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有治療用途。因此，本發(fā)明的目標(biāo)還是使用本文 所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域調(diào)控GPCR受體信號(hào)傳遞，特別是G蛋白介導(dǎo)的GPCR受體信號(hào)傳遞。
[0053] 本發(fā)明還涵蓋了生產(chǎn)針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的方法，方法包括步驟：
[0054] a)在合適的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)本文所述的核酸，和任選的
[0055] b)分離和/或純化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0056] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及篩選針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合 物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，方法包括步驟：
[0057] a)提供多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和
[0058] b)在所述多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，篩選與包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu) 域，和
[0059] c)分離與復(fù)合物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0060] 根據(jù)本文的其他描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)也是顯而易見(jiàn)的。
[0061] 附圖簡(jiǎn)述
[0062] 圖1 : β 2AR :Gs復(fù)合物的G蛋白循環(huán)。a，與β 2AR結(jié)合的胞外激動(dòng)劑導(dǎo)致跨膜區(qū)段 的細(xì)胞質(zhì)端的構(gòu)象重排，所述區(qū)段使Gs異源三聚體（α、β和Y)結(jié)合受體（R、R*)。⑶P 是在形成R:G復(fù)合物時(shí)從α亞基釋放的。GTP結(jié)合不合核苷酸的α亞基，導(dǎo)致α和β Υ 亞從受體解離。亞基調(diào)控其相應(yīng)的效應(yīng)子蛋白--腺苷酸環(huán)化酶（AC)和Ca2+通道。在α 亞基中的GTP水解為GDP后，自α和β Υ亞基重新裝配為Gs異源三聚體。b，維持在去垢 劑微團(tuán)中的純化的不含核苷酸的02AR:Gs蛋白質(zhì)復(fù)合物。Gsa亞基由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成： Ras結(jié)構(gòu)域（a Ras)和a -螺旋狀結(jié)構(gòu)域（a AH)。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都參與核苷酸結(jié)合。在不合 核苷酸的狀態(tài)下，相對(duì)于a Ras結(jié)構(gòu)域，a AH結(jié)構(gòu)域具有可變的位置。
[0063] 圖2 :形成穩(wěn)定的β 2AR :Gs復(fù)合物。通過(guò)下述的組合效應(yīng)：1)以非常緩慢的解離 速率使高親和力激動(dòng)劑與受體結(jié)合（如Rasmussen等人，2011所述）：2)在存在腺苷三磷 酸雙磷酸酶的條件下，形成不含核苷酸的復(fù)合物，該酶水解釋放的GDP，阻止它重新結(jié)合和 導(dǎo)致較不穩(wěn)定的R :G相互作用；和3)將DDM去垢劑交換為穩(wěn)定復(fù)合物的MNG-3,實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定 的β 2AR :Gs復(fù)合物。
[0064] 圖3 :核苷酸類似物、pH和納米抗體對(duì)β 2AR :Gs復(fù)合物穩(wěn)定性的效應(yīng)。a)分析凝 膠過(guò)濾顯示了核苷酸⑶P和GTP γ S(0. ImM)導(dǎo)致β 2AR-365 :Gs復(fù)合物的解離。b)模擬核 苷酸磷酸基的磷酸鹽-焦磷酸鹽和三鈉磷酸甲酸鹽（forcarnet) (5mM使用）不導(dǎo)致復(fù)合 物解構(gòu)。作為添加劑，它們改善了兩種T4L- β 2AR :Gs復(fù)合物（不含納米抗體），T4L- β 2AR : Gs :Nb37和T4L-P 2AR :Gs :Nb35的晶體生長(zhǎng)。c)確定pH上下限，指導(dǎo)結(jié)晶篩選的制備。出 于相同的目的，使用各種濃度的NaCl確定離子強(qiáng)度的效應(yīng)（數(shù)據(jù)未顯示）。復(fù)合物在20、 100和500mM中是穩(wěn)定的，而在2. 5M NaCl中解離。d)納米抗體35(Nb35,紅色虛線）結(jié)合 T4L-0 2AR:Gs :B1167107三元復(fù)合物（藍(lán)色實(shí)線），形成R:G:Nb35復(fù)合物（紅色實(shí)線）， 與處理過(guò)的R :G復(fù)合物（綠色虛線）相反，R :G :Nb35復(fù)合物對(duì)GTP γ S處理不敏感（綠色 實(shí)線）。Nb35和Nb37結(jié)合位于Gs異源三聚體上的獨(dú)立表位，形成R :G :Nb35 :Nb37復(fù)合物 (紫色實(shí)線）。e)納米抗體36 (Nb36,紅色虛線）結(jié)合R :G復(fù)合物（黑色實(shí)線），形成R :G : Nb36復(fù)合物（紅色實(shí)線），后者對(duì)GTP γ S處理較不敏感（綠色實(shí)線）。Nb36和Nb37結(jié)合 位于Gs異源三聚體上的獨(dú)立表位，形成R :G :Nb36 :Nb37復(fù)合物（紫色實(shí)線）。f)納米抗 體37 (Nb37,綠線）結(jié)合R :G復(fù)合物（黑色實(shí)線），形成R :G :Nb37復(fù)合物（紅色實(shí)線）。g) R :G :Nb37復(fù)合物對(duì)GTP γ S處理較不敏感（藍(lán)色實(shí)線），與處理過(guò)的R :G復(fù)合物相反（藍(lán) 色虛線）。
[0065] 圖4 :MNG-3對(duì)R :G復(fù)合物的穩(wěn)定效應(yīng)。a)在4°C孵育48hr后，對(duì)在DDM (黑色）、 MNG-3 (藍(lán)色）或2種MNG-3類似物（紅色和綠色）中純化的β 2AR-365 :Gs復(fù)合物進(jìn)行分 析凝膠過(guò)濾。與DDM相反，R:G復(fù)合物在MNG去垢劑中是穩(wěn)定的。b)通過(guò)3H-二氫阿普洛 爾（3H-DHA)飽和結(jié)合測(cè)定的，稀釋未結(jié)合配體的純化3 2AR在低于去垢劑的臨界微團(tuán)濃度 (CMC)的DDM或MNG-3中的效應(yīng)。20sec后，稀釋維持在低于CMC1000倍的DDM中的β 2AR 導(dǎo)致喪失3H-DHA結(jié)合（黑色數(shù)據(jù)點(diǎn)）。相反，24hr后，在稀釋至低于CMC1000倍的MNG-3 中的P2AR仍保持了全部與放射性配體結(jié)合的能力。
[0066] 圖5 :R :G復(fù)合物的純度和均質(zhì)性。a)在T4L_ β 2AR :G純化的各個(gè)階段獲得的樣 品的分析性SDS-PAGE /考馬斯藍(lán)染色。在過(guò)量的異源三聚體中的B1167107激動(dòng)劑結(jié)合的、 去磷酸化的，和去糖基化的受體用于與G-蛋白的功能性部分的最佳偶聯(lián)效率。通過(guò)與固定 在Ml樹(shù)脂上的受體的相互作用，實(shí)現(xiàn)Gs的功能純化，同時(shí)洗去無(wú)功能/未結(jié)合的Gs。b)4 次連續(xù)預(yù)備的凝膠過(guò)濾之一的代表性洗脫曲線，紅色指出了分級(jí)。在所示短劃線內(nèi)合并含 有R :G復(fù)合物的級(jí)分，旋轉(zhuǎn)濃縮，并分析純度和均質(zhì)性，通過(guò)SDS-PAGE /考馬斯藍(lán)（a，倒數(shù) 第2道至右側(cè)），在c)凝膠過(guò)濾，和通過(guò)d)陰離子交換層析。上圖顯示了在形成復(fù)合物前 用λΡΡ酶處理過(guò)的0 2AR-365:Gs復(fù)合物的分析性IEC的洗脫曲線，與未脫磷酸化的復(fù)合 物相比，獲得異質(zhì)的制品（下圖）。在存在多種化學(xué)品的條件下（圖1中的例子），使用b) 中的所示虛線外側(cè)的級(jí)分中的較不均質(zhì)的材料進(jìn)行R :G復(fù)合物的分析凝膠過(guò)濾實(shí)驗(yàn)。
[0067] 圖6 :制備與Nb35的R :G復(fù)合物的純化過(guò)程的流程圖。
[0068] 圖7 :純化Nb35,和確定R :G :Nb的混合比例。a)在鎳親和層析純化納米抗體 35 (Nb35)后的預(yù)備離子交換層析。將作為小峰和均質(zhì)大峰洗脫在兩群中的納米抗體（顯示 為紅色）收集、旋轉(zhuǎn)濃縮并且在如（b)所示確定與R :G復(fù)合物的適當(dāng)混合比后，用于晶體學(xué) 分析。b)基于蛋白質(zhì)濃度，將激動(dòng)劑結(jié)合的T4L-i3 2AR :Gs復(fù)合物與略微過(guò)量的Nb35混合 (R :G復(fù)合物比Nb35為1-1. 2摩爾比），并通過(guò)分析性凝聚過(guò)濾驗(yàn)證所述混合物。
[0069] 圖8 :海綿樣中間相中的T4L-3 2AR :Gs :Nb35復(fù)合物晶體。
[0070] 圖9 : β 2AR :Gs復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。a)復(fù)合物的晶格堆積顯示了晶體內(nèi)受體和G 蛋白的交替疊層。在含水層的蛋白之間形成了豐富的接觸。b)不對(duì)稱單元內(nèi)容的整體結(jié)構(gòu) 顯示i32AR(綠色）與激動(dòng)劑（黃色球）結(jié)合，并參與和Gsa (桔色）的廣泛的相互作用。 Gas以及Gi3 (青色）和GY (紫色）構(gòu)成了異源三聚體G蛋白Gs。結(jié)合Gs的納米抗體 (Nb35,紅色）在a和β亞基之間結(jié)合G蛋白。納米抗體（Nb35)促進(jìn)結(jié)晶，與i3 2AR的氨 基末端融合的T4溶菌酶（紫紅色）也促進(jìn)結(jié)晶。c)省略了結(jié)晶幫助的生物學(xué)復(fù)合物，顯示 了它在細(xì)胞膜中的位置和方向。
[0071] 圖 10 :在結(jié)合了 BI-167107 的 T4L-P 2AR :Gs :Nb35 復(fù)合物的 BI-167107 中的 Nb35 和Gs的相互作用。a)對(duì)Nb35 (紅色）的CDR1 (填充表示）與G β (填充表示，青色）的相 互作用的兩幅代表性圖。b)對(duì)Nb35 (紅色）的CDR3 (填充表示）與G a S (填充表示，桔色） 和Gi3 (填充表示，青色）的相互作用的兩幅代表性圖。通過(guò)與GaS和Gi3相互作用，Nb35 可以降低復(fù)合物的構(gòu)象柔性。c)對(duì)Nb35(填充表示，紅色）與GaS(桔色）的框架區(qū)的相 互作用的兩幅代表性圖。
[0072] 圖11 :Nb35與相鄰復(fù)合物的Ga S亞基之間的晶體接觸。涉及-X，y-Ι / 2, -z+1 對(duì)稱的相關(guān)復(fù)合物（a)和X，y-1，z對(duì)稱的相關(guān)復(fù)合物（b)的Nb35(紅色，填充表示）和 Ga S(桔色）的晶體接觸。
[0073] 圖12 :比較活性和失活的β 2AR結(jié)構(gòu)。a)與失活的結(jié)合卡拉洛爾（carazolol)的 β 2AR結(jié)構(gòu)（藍(lán)色；Rosenbaum等人，2007)相比，β 2AR :Gs結(jié)構(gòu)（綠色）的側(cè)面圖和胞質(zhì)視 圖。對(duì)于TM5和TM6的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可見(jiàn)顯著的結(jié)構(gòu)改變。如兩種結(jié)構(gòu)中的Glu268的α-碳 (黃色箭頭）測(cè)量的，ΤΜ5延伸出兩條螺旋轉(zhuǎn)角，而ΤΜ6則向外移動(dòng)了 14Λ。b)與納米抗 體-穩(wěn)定的活性狀態(tài)的P2AR:Nb80結(jié)構(gòu)（桔色，Rasmussen等人，2011)比較的P2AR:Gs。 c)從胞質(zhì)側(cè)觀察到的E / DRY和NPxxY基序中的殘基位置，以及β 2AR :Gs和β 2AR :Nb80 結(jié)構(gòu)的其他關(guān)鍵殘基位置。除了在P2AR:Nb80結(jié)構(gòu)中與納米抗體相互作用的Argl31夕卜， 所有殘基都占據(jù)了非常相似的位置。
[0074] 圖13 :R:G界面中的殘基的電子密度圖。a)TM3的胞質(zhì)末端的D / ERY基序。b) 在E / DRY基序的Argl31和C末端G a S的Tyr391之間的堆積相互作用。c) TM7的胞質(zhì)末 端的NpxxY。d)Thr68和Tyrl41與E / DRY基序的Aspl30的相互作用。IL2的Phel39包 埋在GaS的疏水口袋中。e)GaS的β 1-α 1環(huán)（P環(huán)）參與核苷酸結(jié)合。電子密度圖是以 lsigma勾畫(huà)輪廓的2Fo_Fc圖。
[0075] 圖14 :受體：G蛋白相互作用。a，b)通過(guò)打開(kāi)跨膜螺旋5和6，G a S的α 5-螺旋進(jìn) 入了在受體胞內(nèi)側(cè)形成的空穴中。a)在跨膜核心中，相互作用主要是非極性的。一個(gè)例外 涉及α 5-螺旋的Tyr391倚靠 TM3的保守DRY序列的Argl31堆積（也參見(jiàn)圖13)。Argl31 還倚靠 TM7的保守NPxxY序列的Tyr堆積。b)由于存在α 5螺旋，受體與TM5和TM3形成 了極性相互作用的網(wǎng)絡(luò)。c)受體殘基Thr68和Aspl30通過(guò)Tyrl41與β 2AR的IL2螺旋相 互作用，擺放螺旋的位置，使得受體的Phel39進(jìn)入（dock) G蛋白表面的疏水口袋中，從而在 結(jié)構(gòu)上關(guān)聯(lián)了受體-G蛋白與β 2AR的高保守DRY基序相互作用。
[0076] 圖15 :Ga s的構(gòu)象改變。a)比較@2AR:Gs復(fù)合物中的Ga s (桔色）與結(jié)合GTPyS 的G a s (灰色）（PDB ID :1AZT ;Sunahara等人，1997)。GTP y S顯示為球形。相對(duì)于在結(jié)合 GTP YS的狀態(tài)下的位置，Ga s的螺旋狀結(jié)構(gòu)域（Ga SAH)表現(xiàn)出劇烈的移位。b)旋轉(zhuǎn)Ga s 的a 5螺旋，將其替換為β 2AR，干擾（perturb) β 6- a 5環(huán)，所述環(huán)另外形成GTP γ S結(jié)合 口袋的一部分。c)Ga s的β 1-a 1環(huán)（P環(huán)）和β6_α 5環(huán)分別與GTP YS-Ga s結(jié)構(gòu)中的 GTPYS的磷酸和嘌呤環(huán)相互作用。d)在不合核苷酸的i32AR:Gs結(jié)構(gòu)中，β 1-a 1和β6_α5 環(huán)被重排。
[0077] 圖 16 :Nb37 抑制 GTP γ S 與 G a s 結(jié)合。孵育 Bodipy-GTP γ S (ΙΟΟηΜ)與 1 μ Μ 純化 的G a s，在存在遞增濃度的Nb37的條件下，實(shí)時(shí)測(cè)量的熒光增加。
[0078] 圖 17 :Nb35 不影響 GTP γ S 與 G a s 結(jié)合。孵育 Bodipy-GTP γ S (ΙΟΟηΜ)與 1 μ Μ 純 化的G a s，在存在遞增濃度的Nb35的條件下，實(shí)時(shí)測(cè)量的熒光增加。
[0079] 圖18 :Nb35抑制GTPyS與Gsa β Y異源三聚體結(jié)合。孵育 Bodipy-GTPYS(lOOnM)與ΙμΜ純化的Gsa β γ異源三聚體，在存在遞增濃度的Nb35的條 件下，實(shí)時(shí)測(cè)量的熒光增加。
[0080] 圖19 :純化穩(wěn)定的AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物。a)在FLAG標(biāo)簽親和純化后，使用 Ni-NTA純化AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物的示意圖。b)親和純化的AVP :NT4LV2R :Gs的SEC色 譜圖。c)監(jiān)控純化方案的SDS-page。道1 :經(jīng)過(guò)FLAG標(biāo)簽親和柱的流過(guò)物；道2 :純化前 的AVP、NT4LV2R和Gs的混合物；道3 :分子標(biāo)志物；道4 :SEC洗脫的AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合 物；道5 :FLAG-標(biāo)簽親和純化后的Ni-NTA后的AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物。
[0081] 圖20 :SEC監(jiān)控的AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物的穩(wěn)定性。短劃線：冰上孵育24hr后， AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物的SEC色譜圖。藍(lán)線：冰上孵育48hr后，AVP :NT4LV2R :Gs復(fù)合物 的SEC色譜圖。紅線：用ΙΟμΜ拮抗劑SR121463孵育復(fù)合物后，AVP :NT4LV2R :Gs的SEC色 譜圖。
[0082] 發(fā)明詳述
[0083] 定義
[0084] 本發(fā)明將就一些特定實(shí)施方案并參考附圖進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不限于此，而僅 受權(quán)利要求限制。權(quán)利要求中的任何提及表示都不應(yīng)解釋為限制范圍。本文描述的附圖僅 是示意性而非限制性的。在附圖中，為了舉例說(shuō)明目的，一些元素的尺寸可能被夸大，并非 按比例繪制。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"包括/包含"在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他元素或 步驟。在使用不定冠詞或定冠詞的地方，當(dāng)提及單數(shù)名稱例如"一個(gè)/ 一種"、"所述/該" 時(shí)，除非另有具體說(shuō)明，否則這涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)形式。此外，在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中的術(shù) 語(yǔ)第一、第二、第三等用于區(qū)分相似元素，而不一定用于描述順序或時(shí)間次序。應(yīng)當(dāng)理解，如 此使用的術(shù)語(yǔ)在合適環(huán)境下是可互換的，并且本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠以與本文 描述或舉例說(shuō)明不同的其他順序操作。
[0085] 除非本文中另外定義，否則本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)和詞匯都應(yīng)具有本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員通常理解的含義。一般而言，本文使用的命名法，和本文所述的分子和細(xì)胞生 物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交的技術(shù)是本領(lǐng)域普遍已知和常規(guī)使用的。除非另 外指出，否則一般根據(jù)本領(lǐng)域普遍已知的常規(guī)方法和本說(shuō)明書(shū)全文引用和討論的各種常見(jiàn) 和更具體的參考文獻(xiàn)所述，實(shí)施本發(fā)明的方法和技術(shù)。參見(jiàn)例如，Sambrook等人，Mo 1 ecu 1 ar Cloning ：A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. y . (1989) :Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992,和 2002 年增刊）。
[0086] 術(shù)語(yǔ)"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域"一般指任何能夠使用特定的分子間相 互作用，結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的非天然存在的分子，或其部分。多種分子可作為蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu) 域發(fā)揮作用，包括但不限于蛋白質(zhì)性分子（蛋白質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)樣或含蛋白質(zhì)的）、核酸分子 (核酸、核酸樣或含核酸的）和碳水化合物分子（碳水化合物、碳水化合物樣、含碳水化合物 的）。說(shuō)明書(shū)中還可見(jiàn)更詳細(xì)的描述。
[〇〇87] 術(shù)語(yǔ)"多肽"、"蛋白質(zhì)"、"肽"在本文中可互換的使用，指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合 形態(tài)，可包括編碼的和非編碼的氨基酸，化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸，和具有相 似的肽骨架的多肽。
[0088] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)復(fù)合物"或簡(jiǎn)單的"復(fù)合物"指一類兩條或多條相 關(guān)的多肽鏈。蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)是通過(guò)非共價(jià)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用連接的。 "四級(jí)結(jié)構(gòu)"是蛋白質(zhì)復(fù)合物中的相關(guān)折疊蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)排列。可理解，復(fù)合物可以是包含 2、3、4、5、6或更多個(gè)多肽的多聚復(fù)合物。復(fù)合物還可以額外的包含非蛋白質(zhì)性分子。
[〇〇89] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"核酸分子"、"多核苷酸"、"多聚核酸"、"核酸"可互換的使 用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形態(tài)，不論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。 多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，可實(shí)施任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包 括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重 組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、控制區(qū)、任何序列的分離的 RNA、核酸探針和引物。核酸分子可以是線性或環(huán)狀的。
[0090] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"配體"或"受體配體"意指胞內(nèi)或胞外特異性結(jié)合GPCR的 分子。在不是限制性目的的條件下，配體可以是蛋白質(zhì)、（多）肽、脂類、小分子、蛋白質(zhì)支 架、抗體、抗體片段、核酸、碳水化合物。配體可以是合成的或天然存在的。術(shù)語(yǔ)"配體"包 括"天然配體"，這是天然GPCR的內(nèi)源性的、天然的配體。在絕大部分情況下，配體是與細(xì)胞 表達(dá)的GPCR接觸（例如結(jié)合）時(shí)，增加或減少胞內(nèi)應(yīng)答的"調(diào)節(jié)劑"。作為調(diào)節(jié)劑的配體例 子包括激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、逆激動(dòng)劑和拮抗劑，說(shuō)明書(shū)中還可見(jiàn)對(duì)其更詳細(xì)的描述。
[0091] 術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的"構(gòu)象"或"構(gòu)象狀態(tài)"一般指在任何瞬間，蛋白質(zhì)可能采用的結(jié)構(gòu) 范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)的決定因素包括反映在蛋白質(zhì)的氨基酸 序列（包括修飾的氨基酸）的蛋白質(zhì)初級(jí)結(jié)構(gòu)，和蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境。蛋白質(zhì)的構(gòu)象或構(gòu) 象狀態(tài)還涉及結(jié)構(gòu)特征，如蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（例如，α -螺旋、β -片層等）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（例 如，多肽鏈的三維折疊）和四級(jí)結(jié)構(gòu)（例如，多肽鏈與其他蛋白質(zhì)亞基的相互作用）。對(duì)多 肽鏈的翻譯后修飾和其他修飾（如配體結(jié)合、磷酸化、硫酸化、糖基化或連接疏水基等）可 影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象。此外，環(huán)境因素（如周圍溶液的pH、鹽濃度、離子強(qiáng)度和重量摩爾滲透 壓濃度、與其他蛋白質(zhì)和輔助因子的相互作用等）可影響蛋白質(zhì)構(gòu)象?？梢酝ㄟ^(guò)針對(duì)活性 或與另一種分子的結(jié)合的功能測(cè)定，或通過(guò)物理學(xué)方法（如X射線晶體學(xué)、NMR或自旋標(biāo)記 等），以及其它方法，確定蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)。關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象和構(gòu)象狀態(tài)的一般討論，可參 考Cantor和 Schimmel,Biophysical Chemistry,Part I :The Conformation of Biological. Macromolecules, · W. H. Freeman and Company, 1980,和 Creighton, Proteins :Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company, 1993。"特定構(gòu)象"或"特定構(gòu)象狀 態(tài)"是蛋白質(zhì)可采用的一系列構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)的任何子集。
[0092] 如本文中使用的，"功能性構(gòu)象"或"功能性構(gòu)象狀態(tài)"指這樣的事實(shí)，S卩，蛋白質(zhì) 具有不同的構(gòu)象狀態(tài)，所述構(gòu)象狀態(tài)具有動(dòng)態(tài)的活性范圍，特別是從無(wú)活性至最大活性的 范圍。功能性構(gòu)象狀態(tài)的例子包括活性構(gòu)象和失活構(gòu)象。應(yīng)明確，"功能性構(gòu)象狀態(tài)"意在 覆蓋GPCR的任何具有任何活性的構(gòu)象狀態(tài)，包括無(wú)活性；而并非意在覆蓋蛋白質(zhì)的變性狀 態(tài)。本文考慮的一類特殊的功能性構(gòu)象是"可用于藥物研發(fā)的構(gòu)象"，一般指靶蛋白的獨(dú)特 的治療相關(guān)的構(gòu)象狀態(tài)。作為示例，β2腎上腺素能受體的活性構(gòu)象對(duì)應(yīng)于該受體用于治 療哮喘的可用于藥物研發(fā)的構(gòu)象。因此，可理解，可用于藥物研發(fā)的能力受到取決于治療的 適應(yīng)癥的特定構(gòu)象的限制。
[0093] 如本文中使用的，詞語(yǔ)"鎖定（locking) "或"捕捉（trapping) "或"固定（fixing) " 或"凍結(jié)（freezing) "當(dāng)涉及（本文定義的）GPCR的功能性構(gòu)象狀態(tài)時(shí)，指將GPCR保持或 保留在其能夠另外呈現(xiàn)的可能的構(gòu)象子集中，這是由于GPCR :G蛋白復(fù)合物與根據(jù)本發(fā)明 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用的效應(yīng)而產(chǎn)生的。相應(yīng)的，如本文中使用的，"構(gòu)象捕捉的"或"構(gòu) 象固定的"或"構(gòu)象鎖定的"或"構(gòu)象凍結(jié)的"蛋白質(zhì)是由于GPCR :G蛋白復(fù)合物與根據(jù)本 發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用的效應(yīng)，保持在其能夠另外呈現(xiàn)的可能的構(gòu)象子集中的蛋白 質(zhì)。在該上下文中，特異性或選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域指這 樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)子集中的蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力比與所 述蛋白質(zhì)可呈現(xiàn)的其他構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)結(jié)合的親和力更高。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到特異 性或選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象或構(gòu)象狀態(tài)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑹乖撎囟ǖ臉?gòu)象或構(gòu)象狀 態(tài)穩(wěn)定。
[0094] 如本文中使用的，在抗體上下文中的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"指Η(重）或 L (輕）鏈的可變區(qū)（也分別縮寫為νΗ和VJ，含有能夠特異性結(jié)合抗原性靶標(biāo)的氨基酸序 列。這些⑶R區(qū)負(fù)責(zé)抗體對(duì)特定抗原決定子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)特異性。這類區(qū)域也被稱為"超變 區(qū)"。CDR代表了可變區(qū)內(nèi)不連續(xù)的氨基酸區(qū)段，而不論物種如何，發(fā)現(xiàn)重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi) 的這些關(guān)鍵氨基酸序列的位置定位在可變鏈的氨基酸序列中具有相似的位置。所有規(guī)則抗 體的可變重鏈和可變輕鏈都具有3個(gè)CDR區(qū)，對(duì)于各的輕鏈（L)和重鏈（H)而言，所述CDR 彼此互不連續(xù)（被稱為L(zhǎng)I、L2、L3、HI、H2、H3)。特別的是，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域（如 納米抗體（如本文別處定義的））一般包括單條氨基酸鏈，其包含4個(gè)"框架序列或框架區(qū)" 或 FR(被稱為？1?1、？1?2、？1?3、？1?4)和3個(gè)"互補(bǔ)決定區(qū)"或0)1?(被稱為0)1?1、0)1?2、0)1?3)， 彼此不連續(xù)。CDR序列（以及FR序列）的描述是基于對(duì)V-結(jié)構(gòu)域和V樣結(jié)構(gòu)域的MGT 特有的編號(hào)系統(tǒng)（Lefranc等人，2003)。
[〇〇95] 如本文中使用的，"表位"指多肽的抗原決定子。表位可包括對(duì)于表位而言獨(dú)有的 空間構(gòu)象中的3個(gè)氨基酸。一般而言，表位由至少4、5、6、7個(gè)這類氨基酸組成，更常見(jiàn)的是 由至少8、9、10個(gè)這類氨基酸組成。確定氨基酸的空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例 如X射線晶體學(xué)和多維核磁共振。
[0096] 如本文中使用的，"構(gòu)象表位"指包含空間構(gòu)象中的氨基酸的表位，所述空間構(gòu)象 對(duì)于多肽的折疊3維構(gòu)象是獨(dú)一無(wú)二的。一般而言，構(gòu)象表位由線性序列中不連續(xù)的氨基 酸組成，這些氨基酸在蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)中聚集在一起。然而，構(gòu)象表位還可以由采用多肽 的折疊3維構(gòu)象所特有（且不存在于變性狀態(tài)中）的構(gòu)象的氨基酸線性序列組成。在蛋白 質(zhì)復(fù)合物中，構(gòu)象表位由一條或多條多肽的線性序列中的不連續(xù)的氨基酸組成，所述氨基 酸在不同的折疊多肽折疊并在特有的四級(jí)結(jié)構(gòu)中聯(lián)結(jié)時(shí)聚集在一起。相似的，構(gòu)象表位在 本文中還可以由一條或多條多肽的氨基酸線性序列組成，所述氨基酸聚集在一起并采用了 四級(jí)結(jié)構(gòu)特有的構(gòu)象。
[0097] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"特異性"指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是免疫球蛋白（如抗體）或免 疫球蛋白片段（如納米抗體）相對(duì)于不同的抗原，優(yōu)先結(jié)合一種抗原的能力，不必然暗示了 高親和力（如本文中別處定義的）?？梢蕴禺愋越Y(jié)合特定抗原或抗原決定子（例如，表位） 和/或?qū)μ囟乖蚩乖瓫Q定子（例如，表位）具有親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是免疫球蛋 白（如抗體）或免疫球蛋白片段（如納米抗體）被稱為"抗"或"針對(duì)"所述抗原或抗原決 定子。如果對(duì)兩種不同的抗原或抗原決定子都是特異性的，則根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域被 稱為與兩種不同的抗原或抗原決定子是"交叉反應(yīng)性的"。
[0098] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"親和力"指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是免疫球蛋白（如抗體）或 免疫球蛋白片段（如納米抗體）結(jié)合抗原的程度，所述程度使抗原和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的平衡移 向存在通過(guò)其結(jié)合而形成的復(fù)合物。因此，例如，當(dāng)抗原和抗體（片段）以相對(duì)相等的濃度 組合時(shí)，高親和力的抗體（片段）將結(jié)合可利用的抗原，使平衡移向所得到的復(fù)合物的高濃 度。解離常數(shù)（K d)通常用于描述在蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原靶標(biāo)之間的親和力。通常，解 離常數(shù)小于1(Γ5Μ。優(yōu)選的，解離常數(shù)小于1(Γ 6Μ，更優(yōu)選的小于1(Γ7Μ。最優(yōu)選的，解離常數(shù) 小于1(Γ8Μ。
[0099] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"或"特異的結(jié)合" 一般指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，特別是 免疫球蛋白（如抗體）或免疫球蛋白片段（如納米抗體）優(yōu)先結(jié)合存在于不同抗原的均質(zhì) 混合物中的特定抗原的能力。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合的相互作用將區(qū)分樣品中想 要的和不想要的抗原，在一些實(shí)施方案中大于約10至100倍或更多（例如，大于約1000或 10, 000 倍）。
[0100] 術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"、"選擇性結(jié)合"、"優(yōu)先結(jié)合"及其語(yǔ)法等價(jià)物在本文中可互換 的使用。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)象特異性"或"構(gòu)象選擇性"在本文中也可互換的使用。
[0101] "缺失"在本文中定義為氨基酸或核苷酸序列的改變，其中相比親代多肽或核酸的 氨基酸序列或核苷酸序列，分別缺少了一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基。在蛋白質(zhì)或其片 段的上下文中，缺失可涉及缺失約2、約5、約10個(gè)，多達(dá)約20、多達(dá)約30或多達(dá)約50個(gè)或 更多個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)或其片段可含有一個(gè)以上的缺失。在GPCR的上下文中，缺失可特別 是環(huán)缺失，或Ν-和/或C-末端缺失。
[0102] "插入"或"添加"是氨基酸或核苷酸序列的這樣的改變，即，相比親代蛋白質(zhì)的氨 基酸序列或核苷酸序列，分別導(dǎo)致添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸殘基。"插入" 一般指 在多肽的氨基酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，而"添加"可以是插入，或指在Ν-或 C-末端、或兩端增加氨基酸殘基。在蛋白質(zhì)或其片段的上下文中，插入或添加通常是約1、 約3、約5、約10個(gè)，多達(dá)約20、多達(dá)約30或多達(dá)約50個(gè)或更多個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)或其片段 可含有一個(gè)以上的插入。
[0103] 如本文中使用的，"取代"是相比親代蛋白質(zhì)或其片段的氨基酸序列或核苷酸序 列，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸分別被不同的氨基酸或核苷酸替換的結(jié)果?？衫斫?，蛋白質(zhì) 或其片段可具有保守性氨基酸取代，其對(duì)蛋白質(zhì)的活性基本沒(méi)有影響。保守性取代是有意 的組合，如 gly、ala ;val、ile、leu、met ;asp、glu ;ash、gin ;ser、thr ;Iys、arg ;cys、met ; 和 phe、tyr、trp〇
[0104] 術(shù)語(yǔ)"序列同一性"在本文中用于指在比較窗口中，序列基于核苷酸-核苷酸或氨 基酸-氨基酸的相同的程度。因此，"序列同一性百分比"如下計(jì)算的：通過(guò)在比較窗口比 較兩條最佳比對(duì)的序列，確定兩條序列中存在的相同核酸堿基（例如，A、T、C、G、I)或相同 氨基酸殘基（例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、 Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)的位置數(shù)，獲得匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗口中 的位置總數(shù)（即，窗口大?。?，將結(jié)果乘以100,生成序列同一性百分比?？梢允止さ拇_定序 列同一性百分比，或利用本領(lǐng)域可得到的計(jì)算機(jī)程序。
[0105] 如本文中使用的，"晶體"或"晶體狀結(jié)構(gòu)"指這樣的固體材料，其組成原子、分子 或離子以在伸展在所有的三維空間中的有序重復(fù)的模式排列。從液體或溶解在液體中的物 質(zhì)形成晶體狀結(jié)構(gòu)的過(guò)程通常被稱為"結(jié)晶"或"晶體發(fā)生"。蛋白質(zhì)晶體幾乎只在溶液中 生長(zhǎng)。最常見(jiàn)的方法是逐漸降低其組分分子的溶解度。溶液中的晶體生長(zhǎng)的特征是2個(gè)步 驟：微觀級(jí)微晶（可能僅具有100個(gè)分子）的成核，然后是所述微晶的生長(zhǎng)，理想的生長(zhǎng)為 衍射-質(zhì)量的晶體。
[0106] 如本文中使用的，"X射線晶體學(xué)"是確定晶體內(nèi)的原子排列的方法，其中一 束X射線轟擊晶體，并向多個(gè)特定方向衍射。根據(jù)這些衍射束的角度和強(qiáng)度，檢晶器 (crystallographer)可以產(chǎn)生晶體內(nèi)的電子密度的三維圖像。根據(jù)該電子密度,可以確 定晶體內(nèi)的原子的平均位置，及其化學(xué)鍵，其混亂和多種其他信息，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的。
[0107] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"原子坐標(biāo)"指分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的原子三維坐標(biāo)組。在一個(gè)實(shí)施 方案中，根據(jù)生物物理學(xué)領(lǐng)域的普遍技術(shù)人員普遍已知的方法，使用X射線晶體學(xué)獲得原 子坐標(biāo)。簡(jiǎn)要的描述如下，可以通過(guò)從晶體衍射X射線，獲得X射線衍射模式。衍射數(shù)據(jù)用 于計(jì)算包含所述晶體的晶胞的電子密度圖；所述圖用于建立晶胞內(nèi)的原子位置（即，原子 坐標(biāo)）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，通過(guò)X射線晶體學(xué)確定的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)組合有標(biāo)準(zhǔn)差。在其他 實(shí)施方案中，可以使用其他的實(shí)驗(yàn)生物物理學(xué)結(jié)構(gòu)確定方法，獲得原子坐標(biāo)，所述方法可包 括電子衍射（也稱為電子晶體學(xué)）和核磁共振（NMR)方法。在其他實(shí)施方案中，可以使用 分子建模工具獲得原子坐標(biāo)，所述工具可基于一種或多種的從頭開(kāi)始的蛋白質(zhì)折疊算法、 能量最小化和基于同源性的建模。這些技術(shù)是生物物理學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域的普遍技術(shù)人 員普遍已知的。
[0108] "解析結(jié)構(gòu)"在本文中用于指確定蛋白質(zhì)的原子排列或原子坐標(biāo)，通常是通過(guò)生物 物理學(xué)方法進(jìn)行的，如X射線晶體學(xué)。
[〇1〇9] 術(shù)語(yǔ)"化合物"或"測(cè)試化合物"或"候選化合物"或"藥物候選化合物"在本文中 用于描述在測(cè)定中測(cè)試的任何天然存在的或合成的分子，所述測(cè)定如篩選測(cè)定或藥物發(fā)現(xiàn) 測(cè)定。同樣地，這類化合物包括有機(jī)和無(wú)機(jī)的化合物。化合物包括特征是低分子量的多核苷 酸、脂類或激素類似物。其他生物聚合的有機(jī)測(cè)試化合物包括包含約2至約40個(gè)氨基酸的 小肽或肽樣分子（肽模擬物），和包含約40至約500個(gè)氨基酸的較大的多肽，如抗體、抗體 片段或抗體綴合物。測(cè)試化合物還可以是蛋白質(zhì)支架。出于高通量的目的，可使用測(cè)試化 合物文庫(kù)，如提供充分多樣性的組合文庫(kù)或隨機(jī)文庫(kù)。例子包括但不限于天然化合物文庫(kù)、 變構(gòu)化合物文庫(kù)、肽文庫(kù)、抗體片段文庫(kù)、合成的化合物文庫(kù)、基于片段的文庫(kù)、噬菌體展示 文庫(kù)等。更詳細(xì)的描述可見(jiàn)于說(shuō)明書(shū)的其它部分。
[0110] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"確定"、"測(cè)量"、"評(píng)估"、"監(jiān)控"和"測(cè)定"在本文中可互換 的使用，包括定量和定性的確定。
[0111] 術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)活性"涉及GPCR時(shí)指具有天然存在的GPCR的生物化學(xué)功能（例如， 結(jié)合功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能或由于配體結(jié)合的改變構(gòu)象的能力）的GPCR。
[0112] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"治療有效量"、"治療有效劑量"和"有效量"意指實(shí)現(xiàn)理想 結(jié)果所需的量。
[0113] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"可藥用的"意指不是生物學(xué)或其他方式不理想的材料，即 所述材料可以與化合物一起施用給個(gè)體，而不導(dǎo)致任何不理想的生物學(xué)效應(yīng)或與包含其的 藥物組合物中的任何其他組分以有害的方式相互作用。
[0114] 發(fā)明詳述
[0115] 盡管可以激活GPCR的配體極其多樣，但它們只與相對(duì)少數(shù)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作 用，誘導(dǎo)深?yuàn)W的生理學(xué)變化。異源三聚體G蛋白、β-抑制蛋白和GPCR激酶在其活化狀態(tài) 特異性識(shí)別GPCR的能力是普遍已知的，但從結(jié)構(gòu)和功能的觀點(diǎn)出發(fā)則對(duì)其理解有限。因 此，令人驚訝且有利的是，鑒別了特異性結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù)合物并能夠?qū)?fù)合物穩(wěn)定或鎖 定在功能性構(gòu)象狀態(tài)（特別是活化構(gòu)象狀態(tài)的）結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是用于穩(wěn) 定和捕獲處于結(jié)合G蛋白狀態(tài)中的想要的GPCR的一般性工具，這類GPCR -般被認(rèn)為代表 GPCR的活性狀態(tài)（如本文定義）。
[0116] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合 物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0117] 本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是任何能夠特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的 非天然存在的分子或其部分（如上文定義）。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域 是蛋白質(zhì)支架。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)支架" 一般指形成結(jié)構(gòu)的折疊單元，特別是蛋白質(zhì)或肽結(jié)構(gòu)， 其包括用于結(jié)合另一種分子，例如蛋白質(zhì)，的框架（參見(jiàn)例如，Skerra(2000)，綜述）。結(jié)合 結(jié)構(gòu)域可源自天然存在的分子，例如源自先天性或適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組分，或者可以完全 是人為設(shè)計(jì)的。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是基于免疫球蛋白的，或者可以基于蛋白質(zhì)中存在的結(jié)構(gòu) 域，包括但不限于微生物蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、毒素、纖連蛋白、脂籠蛋白、單鏈反平行卷 曲螺旋蛋白或重復(fù)基序蛋白。本領(lǐng)域已知的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于：抗體、重鏈 抗體（hcAb)、單結(jié)構(gòu)域抗體（sdAb)、微抗體（minibody)、源自胳§它重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域 (VHH或納米抗體）、源自S魚(yú)抗體的新抗原受體的可變結(jié)構(gòu)域（VNAR)、alphabody、蛋白A、 蛋白G、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域（DARPin)、III型纖連蛋白重復(fù)、anticalin、knottin、改 造的CH2結(jié)構(gòu)域（納米抗體）、肽和蛋白質(zhì)、脂肽（例如，pepducin)、DNA和RNA(參見(jiàn)例如， Gebauer&Skerra，2009 ;Skerra，2000 ;Starovasnik 等人，1997 ;Binz 等人，2004 ;Koide 等 人，1998 ;Dimitrov，2009 ;Nygren 等人，2008 ;W02010066740)。通常，當(dāng)使用選擇方法生成 特定類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，使用包含共同序列或框架序列的組合文庫(kù)篩選與目標(biāo)分子（如 蛋白質(zhì)）的結(jié)合，所述共同序列或框架序列含有隨機(jī)的、潛在的相互作用殘基。
[0118] 本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以針對(duì)和/或特異性結(jié)合任何選定的GPCR :G蛋白復(fù)合 物。優(yōu)選的靶復(fù)合物是天然存在的GPCR和G蛋白的復(fù)合物，或可選的在例如GPCR和G蛋 白的非天然存在的變體（本文另外所述）的情況下，是這樣的復(fù)合物，其中的GPCR和G蛋 白將在恰當(dāng)?shù)纳項(xiàng)l件下關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，GPCR和G蛋白之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系決 定了是否可以形成特定的GPCR :G蛋白復(fù)合物，這將在下文關(guān)于G蛋白家族成員和GPCR家 族成員中進(jìn)一步詳述。
[0119] "G蛋白"意指鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白的家族，該家族參與將化學(xué)信號(hào)傳遞到細(xì)胞 夕卜，并且導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的改變。G蛋白是配體與GPCR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān) 鍵分子組分。它們也被稱為"異源三聚體G蛋白"或"大型G蛋白"。G蛋白由3個(gè)亞基組成： α、β和Y，其分類大部分基于不同α亞基的同一性和后續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的性質(zhì)。G蛋白的其 他分類來(lái)自cDNA序列同源性分析。G蛋白結(jié)合鳥(niǎo)苷二磷酸（GDP)或鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP)，具 有高同源性的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和用于與受體和效應(yīng)子相互作用的不同結(jié)構(gòu)域。不 同的Ga蛋白亞類（如Gas、Gai、Gaq和Gal2等）通過(guò)不同的通路傳遞信號(hào)，所述通路 涉及第二信使分子，如cAMP、肌醇三磷酸（IP3)、二酰甘油、胞內(nèi)Ca2+和RhoA GTP酶。為了 進(jìn)一步示例，α亞基（39_46kDa)合有鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，具有GTP酶活性；β (37kDa) 和Y (8kDa)亞基緊密關(guān)聯(lián)，并作為β γ異二聚體發(fā)揮功能。目前描述，有23種類型的α 亞基（包括一些剪接同種型）、6種β亞基和11種Υ亞基。G蛋白和亞基的類型是下標(biāo) 的：因此，例如，Gs蛋白的α亞基（其活化腺苷酸環(huán)化酶）是Gsa ;其他G蛋白包括Gi，其 結(jié)構(gòu)上不同于Gs(不同的α亞基類型）并抑制腺苷酸環(huán)化酶。表1提供了其他實(shí)施例。
[0120] 通常，G蛋白本質(zhì)上是結(jié)合核苷酸的類型。更具體而言，根據(jù)特定GPCR的激活狀 態(tài)，G蛋白（至少α亞基）結(jié)合GTP或⑶Ρ。結(jié)合GPCR的激動(dòng)劑促進(jìn)與⑶Ρ結(jié)合的Ga β Υ 異源三聚體的相互作用，導(dǎo)致G a上的⑶Ρ交換為GTP，和G蛋白功能上解離為G a -GTP和 Gi3 γ亞基。分離的Ga-GTP和Gi3 γ亞基可以獨(dú)立或平行的調(diào)節(jié)下游的細(xì)胞效應(yīng)子（通 道、激酶或其他酶，參見(jiàn)表1)。G γ的內(nèi)在GTP酶活性導(dǎo)致GTP水解為⑶Ρ，和G a -GDP與 Gi3 γ亞基重新關(guān)聯(lián)，和信號(hào)傳遞的終止。因此，G蛋白作為調(diào)控分子開(kāi)關(guān)發(fā)揮作用，能夠通 過(guò)a和β γ亞基效應(yīng)觸發(fā)分叉（bifurcating)信號(hào)。開(kāi)關(guān)通過(guò)受體開(kāi)啟，再在數(shù)秒內(nèi)自 身關(guān)閉，所述時(shí)間足以顯著放大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0121] 如本文中使用的，"G蛋白偶聯(lián)受體"或"GPCR"是享有共同結(jié)構(gòu)基序的多肽，具有7 個(gè)在22至24個(gè)疏水氨基酸之間的區(qū)域，所述區(qū)域形成7個(gè)α螺旋，每個(gè)螺旋跨越細(xì)胞膜。 通過(guò)編號(hào)鑒別每個(gè)跨越，即，跨膜-1 (ΤΜ1)、跨膜-2 (ΤΜ2)等。還通過(guò)在細(xì)胞膜外部或"胞外" 側(cè)的跨膜-2和跨膜_3、跨膜-4和跨膜-5,以及跨膜-6和跨膜-7之間的氨基酸區(qū)域連接 跨膜螺旋，所述區(qū)域分別被稱為"胞外"區(qū)1、2和3(EC1、EC2和EC3)。還通過(guò)在細(xì)胞膜內(nèi)部 或"胞內(nèi)"側(cè)的跨膜-1和跨膜-2、跨膜_3和跨膜-4、以及跨膜-5和跨膜-6之間的氨基酸 區(qū)域連接跨膜螺旋，所述區(qū)域分別被稱為"胞內(nèi)"區(qū)1、2和3(IC1、IC2和IC3)。受體的"羧 基"（"C"）末端位于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)空間，受體的"氨基"（"N"）末端位于細(xì)胞外的胞外空 間。任何上述區(qū)域都可以通過(guò)分析GPCR的一級(jí)氨基酸序列來(lái)方便的鑒別。
[0122] GPCR結(jié)構(gòu)和分類是本領(lǐng)域普遍已知的，關(guān)于GPCR的其他討論可見(jiàn)于Probst等 人，1992 ;Marchese 等人，1994 ; Lagerstr·腿 & SchiiHh,，2008 ;Rosenbaum 等人，2009 ; 和下列書(shū)籍：Wiley-Liss 出版的 Jurgen Wess (編著）Structure-Function Analysis of G Protein-Coupled Receptors (第 1 版；1999 年 10 月 15 日）；John Wiley&Sons 出版的 Kevin R. Lynch (編著）Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors (1998 年 3 月）；和 CRC Press 出版的 Tatsuya Haga (編著），G Protein-Coupled Receptors (1999 年 9 月 24 日）；和 Academic Press 出版的 Steve Watson (編著）G_Protein Linked Receptor Factsbook(第1版；1994)。可以根據(jù)序列同源性，將GPCR分為若干不同家族的類型。雖然 所有的GPCR具有相似的7次跨膜α -螺旋的結(jié)構(gòu)，該受體類型中的不同家族彼此沒(méi)有表現(xiàn) 出任何序列同源性，因此提示其跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的相似性可定義共同的功能需求。當(dāng)可獲 得人基因組的第一份草圖時(shí)，則可能對(duì)GPCR儲(chǔ)庫(kù)進(jìn)行全面理解。Fredriksson及其同事將 802個(gè)人GPCR基于系統(tǒng)發(fā)生規(guī)則分類。這顯示絕大部分人GPCR可見(jiàn)于五大主要家族，被稱 為視紫紅質(zhì)、黏附素（Adhesion)、分泌素（Secretin)、谷氨酸型（Glutamate)、Frizzled / Taste2 (Fredriksson 等人，2003)。
[0123] 視紫紅質(zhì)家族的成員（對(duì)應(yīng)于A類（Kolakowski，1994)或原分類體系中的1類 (Foord等人（2005))僅具有小的胞外環(huán)，并且配體與跨膜豁口（cleft)中的殘基發(fā)生相 互作用。這是迄今為止最大的一類（占>90%的GPCR)，含有氣味物、小分子（如兒茶酚胺 和胺）、（神經(jīng)）肽和糖蛋白激素的受體。視紫紅質(zhì)是該家族的代表物質(zhì)，是第一個(gè)結(jié)構(gòu)被 解析的GPCR(Palczewski等人，2000)。第一個(gè)結(jié)構(gòu)被解析的與擴(kuò)散型配體相互作用的受 體--0 2-AR(Rosenbaum等人，2007)也屬于該家族?；谙到y(tǒng)發(fā)生的分析，B類GPCR或 2類（Foord等人，2005)受體最近被細(xì)分為2個(gè)家族：黏附素和分泌素（Fredriksson等人， 2003)。黏附素和分泌素受體的特征是參與配體結(jié)合的、相對(duì)較長(zhǎng)的氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域。 關(guān)于跨膜結(jié)構(gòu)域的方向所知甚少，但該方向很可能與視紫紅質(zhì)的方向迥異。這類GPCR的 配體是激素，如胰高血糖素、分泌素、促性腺激素釋放激素和甲狀旁腺激素。谷氨酸家族受 體（C類或3類受體）也具有大的胞外結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮與"捕蠅草（Venus fly trap) "類似的功 能，因?yàn)槠浯蜷_(kāi)并且將所結(jié)合的激動(dòng)劑關(guān)閉在內(nèi)。家族成員是代謝型谷氨酸、Ca2+_敏感型 和Y _氨基丁酸（GABA) -B受:體。
[0124] GPCR包括但不限于血清素嗅覺(jué)受體、糖蛋白激素受體、趨化因子受體、腺苷受體、 生物胺受體、黑皮質(zhì)素受體、神經(jīng)肽受體、趨化性受體、促生長(zhǎng)素抑制素受體、阿片樣物質(zhì)受 體、褪黑激素受體、降鈣素受體、PTH / PTHrP受體、胰高血糖素受體、分泌素受體、黑寡婦蜘 蛛毒素受體、代謝型谷氨酸受體、鈣受體、GABA-B受體、信息素受體、蛋白酶活化型受體、視 紫紅質(zhì)和其他與G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜區(qū)段受體。GPCR還包括這類彼此關(guān)聯(lián)作為同源或異 源二聚體或作為更高階的寡聚體的GPCR受體。GPCR的氨基酸序列（及編碼其的cDNA的核 苷酸序列）是可以方便獲得的，例如參考GenBank(http ： / / www.ncbi.nlm.nih.gov / entrez)。
[0125] 因此，根據(jù)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了針對(duì)和/或特異性結(jié)合GPCR :G蛋白復(fù) 合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中G蛋白選自Gs、Gi、Go、Gt、Ggust、Gz、Golf、Gq、G12和G13。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，G蛋白是Gs。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，G蛋白是Gi。在仍然另一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，G蛋白是Gt，更具體的是轉(zhuǎn)導(dǎo)素（transducin)。與其對(duì)應(yīng)的是，包含 在復(fù)合物中的GPCR選自Gs偶聯(lián)受體、Gi偶聯(lián)受體、Go偶聯(lián)受體、Gt偶聯(lián)受體、Ggust偶聯(lián) 受體、Golf偶聯(lián)受體、Gq偶聯(lián)受體、G12偶聯(lián)受體和G13偶聯(lián)受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，GPCR是Gs偶聯(lián)受體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GPCR是Gi偶聯(lián)受體。在仍然另一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GPCR是Gt偶聯(lián)受體，更具體的是視紫紅質(zhì)。表1提供了特定的非限 制性例子。
[0126] 表1. G蛋白偶聯(lián)受體和信號(hào)傳遞通路的關(guān)系的非限制性例子。
[0127]
[0128]
[0129]
【權(quán)利要求】
1. 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，相比分別與異源三聚體G蛋白單獨(dú)和/或與GPCR單 獨(dú)結(jié)合，其與復(fù)合物結(jié)合的親和力更高。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性結(jié)合G蛋白，而不結(jié)合GPCR。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中復(fù)合物還包含受體配體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中復(fù)合物由GPCR、G蛋白和受體配體組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述受體配體是激動(dòng)劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中G蛋白處于不含核苷酸的形態(tài)中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性結(jié)合位于所述G蛋白的α和 β亞基之間的界面上的構(gòu)象表位。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其 a) 在存在核苷酸的條件下阻止或抑制復(fù)合物解離，或 b) 阻止或抑制核苷酸與G蛋白結(jié)合，或 c) 能替換G蛋白的核苷酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7至9的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述核苷酸是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，例 如⑶P或GTP，或其類似物，如GTP γ S。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中GPCR處于活性構(gòu)象中。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中G蛋白選自Gs、Gi、Go、Gt、 Ggust、Gz、Golf、Gq、G12、G13。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中GPCR選自Gs偶聯(lián)受體、Gi偶 聯(lián)受體、Go偶聯(lián)受:體、Gt偶聯(lián)受：體、Ggust偶聯(lián)受：體、Golf偶聯(lián)受：體、Gq偶聯(lián)受：體、G12偶聯(lián) 受體、G13偶聯(lián)受體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述GPCR是人蛋白質(zhì)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含這樣的 氨基酸序列的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，所述氨基酸序列包含根據(jù)下列通式（1)的4個(gè)框 架區(qū)（FR1至FR4)和3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R3): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含這樣的氨基酸 序列，所述氨基酸序列包含根據(jù)下列通式（1)的4個(gè)框架區(qū)（FR1至FR4)和3個(gè)互補(bǔ)決定 區(qū)（CDR1 至 CDR3): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)， 并且其中⑶R1選自： a) SEQ ID NO :13-18, b) 與SEQ ID NO :13-18具有至少80%氨基酸同一性的多肽， c) 與SEQ ID NO :13-18具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽， 并且其中⑶R2選自： a) SEQ ID NO :25-30, b) 與SEQ ID NO :25-30具有至少80%氨基酸同一性的多肽， c) 與SEQ ID NO :25-30具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽， 并且其中⑶R3選自： a) SEQ ID NO :37-42, b) 與SEQ ID NO :37-42具有至少80 %氨基酸同一性的多肽， c) 與SEQ ID NO :37-42具有3、2或1個(gè)氨基酸差異的多肽。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是納米抗體（VhH)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中納米抗體具有選自SEQ ID NO :1至6的氨基 酸序列或其變體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在多肽中。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域被固定在固體 支持物上。
21. 包含根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的復(fù)合物，其還包含GPCR、G蛋白和任選的受體配體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21至22的任一項(xiàng)的復(fù)合物，其是結(jié)晶的。
24. 核酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
25. 重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求24的核酸序列。
26. 細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求25的載體或根據(jù)權(quán)利要求24的核酸序列。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的細(xì)胞，其表達(dá)或能夠表達(dá)GPCR和/或G蛋白。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26至27的任一項(xiàng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26至27的任一項(xiàng)的細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求28的細(xì)胞培養(yǎng)物的膜制 品。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途，用于使復(fù)合物穩(wěn)定化，所述復(fù) 合物包含GPCR和G蛋白和任選的處于功能構(gòu)象狀態(tài)的受體配體。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其用于阻止復(fù)合物在存在核苷酸的條件下解離，所述核 苷酸特別是鳥(niǎo)嘌呤核苷酸或其類似物，如GTP γ S。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途，用于使復(fù)合物結(jié)晶和/或解 析復(fù)合物結(jié)構(gòu)，所述復(fù)合物包含GPCR和G蛋白和任選的受體配體。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或根據(jù)權(quán)利要求26至27的任一項(xiàng) 的細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求29的膜制品的用途，用于篩選調(diào)控GPCR的信號(hào)傳遞活性的化合 物。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30至33的任一項(xiàng)的用途，其中GPCR處于活性構(gòu)象中。
35. 根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途，用于捕獲一個(gè)或多個(gè)相互作 用的蛋白質(zhì)。
36. 捕獲和/或純化包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的方法，方法包括步驟： a) 提供根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和 b) 允許結(jié)合結(jié)構(gòu)域與包含GPCR和G蛋白以及任選地受體配體的復(fù)合物結(jié)合，和 c) 任選的分離步驟b)中形成的復(fù)合物。
37. 確定包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的方法，方法包括步驟： a) 提供根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和 b) 允許結(jié)合結(jié)構(gòu)域與包含GPCR和G蛋白和任選地受體配體的復(fù)合物結(jié)合，和 C)使步驟b)中形成的復(fù)合物結(jié)晶。
38. 根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的用途，用于調(diào)控GPCR受體信號(hào)傳 遞，特別是G蛋白介導(dǎo)的GPCR受體信號(hào)傳遞。
39. 生產(chǎn)針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，方 法包括步驟： a) 在合適的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求24的核酸，和任選的 b) 分離和/或純化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
40. 篩選針對(duì)和/或特異性結(jié)合包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，方 法包括步驟： a) 提供多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和 b) 在所述多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，篩選與包含GPCR和G蛋白的復(fù)合物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 和 c) 分離與復(fù)合物結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK104053667SQ201280040585
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月21日
【發(fā)明者】J·斯泰亞特, E·帕頓, T·拉爾曼斯, B·科比爾卡, S·拉斯穆森, S·格拉涅爾, R·K·蘇娜哈拉 申請(qǐng)人:非營(yíng)利性組織佛蘭芒綜合大學(xué)生物技術(shù)研究所, 布魯塞爾自由大學(xué), 利蘭斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì), 密執(zhí)安大學(xué)董事會(huì)