絲氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的氨基酸序列和包含以下至少一個的第二多肽的分子，具體地說是多肽，更具體地說是融合蛋白：Fc多肽或來源于Fc多肽的氨基酸序列、細(xì)胞因子靶向多肽或來源于細(xì)胞因子靶向多肽的序列、含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽或來源于含有WAP的多肽的序列和白蛋白多肽或來源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在各種治療和診斷適應(yīng)癥中使用所述分子的方法，以及生產(chǎn)所述分子的方法。
【專利說明】絲氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法
[0001]相關(guān)申請
本申請要求2011年6月28日提交的美國臨時申請?zhí)?1/502055、2011年12月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/570394、2011年12月19日提交的美國臨時申請?zhí)?1/577204和2012年4月25日提交的美國臨時申請?zhí)?1/638168的權(quán)益。這些申請每一個的內(nèi)容均通過引用以其整體結(jié)合到本文中。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列和第二多肽的分子，具體地說是多肽，更具體地說是融合蛋白。另外，本發(fā)明涉及包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列、第二多肽和第三多肽的融合蛋白。準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及包括至少一個絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽的融合蛋白或包括至少一個絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、第二多肽和第三多肽的融合蛋白，其中本發(fā)明融合蛋白的第二多肽和第三多肽可以是以下的至少一個:Fc多肽或來源于Fe多肽的氨基酸序列；細(xì)胞因子靶向多肽或來源于細(xì)胞因子靶向多肽的序列；含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽或來源于含有WAP的多肽的序列；或白蛋白多肽或來源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在各種治療和診斷適應(yīng)癥中使用所述分子的方法以及生產(chǎn)所述分子的方法。
[0003]發(fā)明背景
絲氨酸蛋白酶活性異?；虻鞍酌笇Φ鞍酌敢种苿┦Ш饪蓪?dǎo)致蛋白酶介導(dǎo)的組織破壞和炎性反應(yīng)。因此，存在對靶向絲氨酸蛋白酶活性異常和/或蛋白酶對蛋白酶抑制劑失衡的治療劑和療法的需要。此外，可通過減少異常細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和絲氨酸蛋白酶活性獲得增強(qiáng)的治療效果。另外，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白質(zhì)顯示抗感染活性，而靶向炎性細(xì)胞因子顯示增加感染風(fēng)險。本發(fā)明的融合蛋白具有減少炎性細(xì)胞因子活性和限制感染風(fēng)險的潛力。
[0004]發(fā)明概述
本文所述融合蛋白包括至少絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽I)和第二多肽(多肽2)。另外，本文所述融合蛋白包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列(多肽I)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。本文可互換使用的術(shù)語“融合蛋白”和“融合多肽”是指與至少第二多肽或來源于至少第二多肽的氨基酸序列有效連接的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽或來源于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽的氨基酸序列。融合蛋白的個別元素可以多種方式的任一種連接，包括例如直接連接、使用中間體或間隔肽、使用接頭區(qū)、使用鉸鏈區(qū)或使用接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)兩者。在一些實施方案中，接頭區(qū)可落入鉸鏈區(qū)的序列內(nèi)，或者，鉸鏈區(qū)可落入接頭區(qū)的序列內(nèi)。優(yōu)選接頭區(qū)是肽序列。例如，接頭肽約包括0-40個氨基酸，例如0-35個氨基酸、0-30個氨基酸、0-25個氨基酸或0_20個氨基酸。優(yōu)選鉸鏈區(qū)為肽序列。例如，鉸鏈肽約包括0-75個氨基酸，例如0-70個氨基酸、0-65個氨基酸或0_62個氨基酸。在融合蛋白包括接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)兩者的實施方案中，優(yōu)選接頭區(qū)和鉸鏈區(qū)各自為肽序列。在這些實施方案中，鉸鏈肽和接頭肽合起來約包括0-90個氨基酸，例如0-85個氨基酸或0-82個氨基酸。
[0005]在一些實施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和第二多肽可通過中間體結(jié)合蛋白連接。在一些實施方案中，融合蛋白的基于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的部分和第二多肽部分可為非共價連接的。
[0006]在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可具有自N端至C端方向或自C端至N端方向的下式之一:
多肽l(a)-鉸鏈1-多肽2(b)
多肽l(a)-接頭λ -多肽2(b)
多妝l(a) _接頭λ _絞鏈《 _多妝2(b)
多妝l(a) _絞鏈? "接頭λ _多妝2(b)
多肽l(a)-多肽2(b)_多肽3(。)
多肽l(a)-鉸鏈w -多肽2(b)_鉸鏈w -多肽3(。)
多妝l(a) _接頭λ _多妝2(b)-接頭-多妝3(。)
多妝l(a) _絞鏈? "接頭λ _多妝2(b)-絞鏈w -接頭λ _多妝3(。)
多妝l(a) _接頭λ _絞鏈《 _多妝2(b)-接頭-絞鏈多妝3(。)
其中η為0-20的整數(shù)，其中m為1_62的整數(shù)，其中a、b和c為至少I的整數(shù)。這些實施方案包括上式及其任何變化或組合。例如，式中多肽的順序還包括多肽3(。)-多肽l(a)-多肽2(b)、多肽2(b)-多肽3(。)-多肽I(a)或其任何變化或組合。
[0007]在一些實施方案中，多肽I序列包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是一類具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，最初被鑒定為一組能夠抑制蛋白酶的蛋白質(zhì)。以非限制性實例的方式，適用于本文提供的融合蛋白的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白質(zhì)包括α-l抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰蛋白酶相關(guān)蛋白(SERPINA2)、α 1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)、kallistatin (SERPINA4)、單核細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(SERPINB1)、P1-6 (SERPINB6)、抗凝血酶(SERPINC1)、纖溶酶原激活物抑制劑I(SERPINE1)、α 2-抗纖溶酶(SERPINF2)、補(bǔ)體1-抑制劑(SERPING1)和神經(jīng)絲抑蛋白(SERPINI1)。
[0008]在一些實施方案中，多肽I序列包括α -1抗胰蛋白酶(AAT)多肽序列或來源于AAT的氨基酸序列。在一些實施方案中，多肽I序列包括AAT蛋白的一部分。在一些實施方案中，多肽I序列至少包括AAT蛋白的反應(yīng)部位環(huán)部分。在一些實施方案中，AAT蛋白的反應(yīng)部位環(huán)部分至少包括氨基酸序列:GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK (SEQ ID NO:1)。
[0009]在一個優(yōu)選的實施方案中，AAT多肽序列或來源于AAT的氨基酸序列是或來源于人AAT多肽序列。
[0010]在一些實 施方案中，融合蛋白包括具有下列氨基酸序列的全長人AAT多肽序列:
【權(quán)利要求】
1.一種分離的融合蛋白，其包含與第二多肽有效連接的至少一個人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一種: 免疫球蛋白Fe多肽或來源于免疫球蛋白Fe多肽的氨基酸序列； 細(xì)胞因子靶向多肽或來源于細(xì)胞因子靶向多肽的序列； 含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽或來源于含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽的序列；或 白蛋白多肽或來源于血清白蛋白多肽的氨基酸序列。
2.一種分離的融合蛋白，其包含與以下的至少一種的第二多肽有效連接的至少一個α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽: 免疫球蛋白Fe多肽； 細(xì)胞因子靶向肽； 人分泌白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)多肽；和 免疫球蛋白Fe多肽和人SLPI多肽，其中SLPI多肽包含人SLPI的WAP2結(jié)構(gòu)域；或 人血清白蛋白(HSA)多肽。
3.一種分離的融合蛋白，其包含與以下的至少一種的第二多肽有效連接的至少一個α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽: 免疫球蛋白Fe多肽； 細(xì)胞因子靶向肽； 人抑彈性蛋白酶蛋白多肽； 人抑彈性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽，其中抑彈性蛋白酶蛋白多肽包含人抑彈性蛋白酶蛋白的WAP結(jié)構(gòu)域；或人血清白蛋白(HSA)多肽。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽是人α-l抗胰蛋白酶(AAT)多肽或來源于人AAT多肽。
5.權(quán)利要求2-4中任一項的分離融合蛋白，其中所述AAT多肽包含SEQID NO: 2的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求2-4中任一項的分離融合蛋白，其中所述AAT多肽包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的AAT的反應(yīng)部位環(huán)或含有SEQ ID NO: 32或33的氨基酸序列的AAT的突變反應(yīng)部位環(huán)。
7.權(quán)利要求2-4中任一項的分離融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽是人Fe多肽。
8.權(quán)利要求7的分離融合蛋白，其中所述人Fe多肽是人IgM多肽或人IgGFe多肽。
9.權(quán)利要求8的分離融合蛋白，其中所述人IgGFe多肽是人IgGl多肽、人IgG2 Fe多肽、人IgG3 Fe多肽或人IgG4 Fe多肽。
10.權(quán)利要求1-3中任一項的分離融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含選自SEQID NO: 3、4、5、6和7的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者有效連接。
12.權(quán)利要求2-4中任一項的分離融合蛋白，其中所述AAT多肽和免疫球蛋白Fe多肽通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者有效連接。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的分離融合蛋白，其中鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者包含肽序列。
14.權(quán)利要求1-3中任一項的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自SEQID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21 的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1-6中任一項的分離融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子靶向多肽是人細(xì)胞因子受體多肽或人細(xì)胞因子受體多肽的衍生物、結(jié)合細(xì)胞因子受體的細(xì)胞因子靶向多肽或結(jié)合人細(xì)胞因子的細(xì)胞因子靶向多肽。
16.權(quán)利要求15的分離融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子受體多肽包含多個亞基。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的分離融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子受體是TNFa、IgE, IL-12、IL-23、IL-6、IL-1 a、IL-1 β、IL-17、IL-13、IL-12 和 IL-23 的 p40 亞基、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27 或 IL-32 的受體。
18.權(quán)利要求17的分離融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子受體是人TNFa的受體。
19.權(quán)利要求15的分離融合蛋白，其中所述人細(xì)胞因子是TNFa、IgE,IL-12、IL-23、 IL-6.1L-1 a、IL-1 β、IL-17、IL-13、IL-12 和 IL-23 的 p40 亞基、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27 或 IL-32。
20.權(quán)利要求19的分離融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子是人TNFa。
21.權(quán)利要求15的分離融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子靶向多肽是抗體或抗體片段。
22.權(quán)利要求21的分離融合蛋白，其中所述抗體或抗體片段是嵌合的、人源化的或完全人的。
23.權(quán)利要求1-6的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自SEQID NO: 22、SEQID NO: 23,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 27 的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽序列包含含有選自SEQ ID NO: 8、9和10的氨基酸序列的SLPI多肽序列。
25.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽序列包含含有選自SEQ ID NO: 11、12和13的氨基酸序列的抑彈性蛋白酶蛋白多肽序列。
26.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得絲氨酸蛋白酶抑制蛋白多肽、含有WAP結(jié)構(gòu)域的多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少兩個通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者有效連接。
27.權(quán)利要求2的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少兩個通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者有效連接。
28.權(quán)利要求3的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、抑彈性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽，使得AAT多肽、抑彈性蛋白酶蛋白多肽和免疫球蛋白Fe多肽的至少兩個通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者有效連接。
29.權(quán)利要求2-4中任一項的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含兩個AAT多肽和一個免疫球蛋白Fe多肽。
30.權(quán)利要求29的分離融合蛋白，其中所述兩個AAT多肽的每一個通過鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者與免疫球蛋白Fe多肽有效連接，使得融合蛋白具有如下的從N端到C端的結(jié)構(gòu)排列:AAT多肽-免疫球蛋白Fe多肽-AAT多肽。
31.權(quán)利要求26-30中任一項的分離融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)、接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)和接頭區(qū)兩者包含肽序列。
32.權(quán)利要求2的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 28的氨基酸序列。
33.權(quán)利要求2的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 29的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述白蛋白多肽是人血清白蛋白(HSA)多肽或來源于HSA多肽。
35.權(quán)利要求2、3或34中任一項的分離融合蛋白，其中HSA多肽包含SEQID NO: 14的氨基酸序列或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求2、3或34中任一項的分離融合蛋白，其中所述HSA多肽包含HSA的結(jié)構(gòu)域3。
37.權(quán)利要求34的分離融 合蛋白，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白通過白蛋白結(jié)合多肽與HSA有效連接。
38.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的分離融合蛋白，其中所述AAT多肽通過白蛋白結(jié)合多肽與HSA有效連接。
39.權(quán)利要求37或38的分離融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是抗體或抗體片段或來源于抗體或抗體片段。
40.權(quán)利要求39的分離融合蛋白，其中所述抗體或抗體片段是嵌合的、人源化的或完全人的。
41.權(quán)利要求37或38的分離融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是肽。
42.權(quán)利要求47的分離融合蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域3或來源于鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域3的序列。
43.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與HSA多肽共價連接。
44.權(quán)利要求1的分離融合蛋白，其中所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白與HSA多肽非共價連接。
45.權(quán)利要求1-3中任一項的分離融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 30或31的氨基酸序列。
46.權(quán)利要求1-3中任一項的分離融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽經(jīng)修飾以提高FcRn結(jié)合。
47.權(quán)利要求1-3中任一項的分離融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fe多肽包含下列突變中的至少一個:Met252Tyr、Ser254Thr> Thr256Glu> Met428Leu 或 Asn434Ser。
48.一種治療或減輕有需要的受試者中與絲氨酸蛋白酶表達(dá)或活性異常有關(guān)的疾病或病癥的癥狀的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項的融合蛋白。
49.一種治療或減輕有需要的受試者中炎癥或炎性疾病或病癥的癥狀同時降低感染風(fēng)險的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項的融合蛋白。
50.一種降低有需要的受試者中感染風(fēng)險的方法，所述方法包括給予前述權(quán)利要求中任一項的融合蛋白。
51.權(quán)利要求48-51中任一項的方法,其中所述受試者是人。
52.49的方法，其中所述炎性疾病或病癥選自:氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、變應(yīng)性哮喘、囊性纖維化、肺癌、缺血再灌注損傷、心臟移植術(shù)后缺血/再灌注損傷、心肌梗死、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病、銀屑病、I型和/或II型糖尿病、肺炎、膿毒癥、移植物抗宿主病(GVHD)、傷口愈合、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。
53.50的方法，其中所述感染選自細(xì)菌感染、真菌感染或病毒感染。
【文檔編號】C07K16/46GK103917563SQ201280041956
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月28日
【發(fā)明者】B.P.?？藸柭? J.C.蒂默, P.L.恩蓋, G.B.京瑟, Q.德弗勞瓦 申請人:英伊布里克斯有限責(zé)任公司