使用分選酶安裝用于蛋白質(zhì)連接的點(diǎn)擊化學(xué)柄的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了將點(diǎn)擊化學(xué)柄安裝至靶蛋白上的方法和試劑以及包含點(diǎn)擊化學(xué)柄的修飾蛋白。另外，本文中公開(kāi)了嵌合蛋白，其包含借助點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合的兩種蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗體，以及其產(chǎn)生的方法及應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用分選酶安裝用于蛋白質(zhì)連接的點(diǎn)擊化學(xué)柄
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本發(fā)明權(quán)利根據(jù)35U.S.C.§ 119 (e)要求2011年6月28日提交的名為“使用分選酶安裝用于蛋白質(zhì)連接的點(diǎn)擊化學(xué)柄”的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.S.N.61/502，237和2012年4月13日提交的名為“分選酶修飾的VHH結(jié)構(gòu)域及其用途”的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申U.S.S.N.61/624, 114的優(yōu)先權(quán)，所述文獻(xiàn)的每一篇通過(guò)引用的方式并入本文。 [0003]政府資助
[0004]本發(fā)明借助美國(guó)政府支持在國(guó)家健康研究所(NIH)資助的基金R0IU54A1057159、ROI A1033456和ROI A1087879下做出。美國(guó)政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005]蛋白質(zhì)工程正在變成蛋白質(zhì)生物化學(xué)的許多領(lǐng)域中廣泛使用的工具。一個(gè)工程化方法是受控的蛋白質(zhì)連接。天然化學(xué)的蛋白質(zhì)連接依賴(lài)于合成的肽酯的有效制備，這可能在技術(shù)上難以制備多種蛋白質(zhì)。重組技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生將一種蛋白質(zhì)的C末端與另一種蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)融合物。基于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的蛋白質(zhì)連接系統(tǒng)也可以用來(lái)結(jié)合蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的這種連接方法的前提是將靶蛋白表達(dá)為具有該內(nèi)含子的正確折疊的融合物，這經(jīng)常是具有挑戰(zhàn)性。常規(guī)的天然和重組連接技術(shù)的困難明顯限制蛋白質(zhì)連接法的應(yīng)用。
[0006]由分選酶催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)已經(jīng)顯示出作為用各種形式的修飾衍生化蛋白質(zhì)的通用方法。對(duì)于常規(guī)的分選酶修飾，將靶蛋白工程化以在它們的C-末端附近含有分選酶識(shí)別基序(LPXT)。與含有一個(gè)或多個(gè)N末端甘氨酸殘基的合成肽和重組分選酶孵育時(shí)，這些人工分選酶底物發(fā)生轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，使得C末端殘基到蘇氨酸殘基與合成的寡甘氨酸肽交換，使得蛋白質(zhì)C末端連接至合成肽的N末端。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明的一些方面涉及分選酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)修飾，尤其關(guān)于在蛋白質(zhì)序列上安裝反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，例如，點(diǎn)擊化學(xué)柄。本發(fā)明提供了在蛋白質(zhì)上安裝反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)的方法和試劑，也提供了修飾的蛋白質(zhì)，例如，包含C末端或N末端點(diǎn)擊化學(xué)柄的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明提供了使根據(jù)本發(fā)明多方面修飾的兩種蛋白結(jié)合的方法。這類(lèi)方法可用來(lái)使單聚蛋白質(zhì)二聚化并可用來(lái)產(chǎn)生組合有異源的單一蛋白的特征的嵌合蛋白，例如，雙特異性嵌合抗體。
[0009]本發(fā)明的一些方面提供了利用分選酶轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)向蛋白質(zhì)N末端或C末端添加點(diǎn)擊化學(xué)柄的方法、組合物和試劑。本發(fā)明的一些方面提供了在靠近C末端包含分選酶識(shí)別基序(例如，LPXT)的蛋白質(zhì)的C末端處或與之鄰近安裝點(diǎn)擊化學(xué)柄的方法。本發(fā)明的一些方面提供了在包含一個(gè)或多個(gè)N末端甘氨酸殘基的蛋白質(zhì)的N末端上安裝點(diǎn)擊化學(xué)柄的方法。
[0010]例如，一些實(shí)施方式提供了將靶蛋白與C末端點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括為靶蛋白提供例如，作為C末端融合物的C末端分選酶識(shí)別基序(例如，LPXT)。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括使靶蛋白與包含1-10個(gè)N末端甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)和點(diǎn)擊化學(xué)柄的試劑(例如，肽、蛋白質(zhì)或化合物)接觸。在一些實(shí)施方式中，在分選酶存在的情況下，在適于分選酶使靶蛋白和包含點(diǎn)擊化學(xué)柄的肽轉(zhuǎn)酰胺化的條件下進(jìn)行接觸，因此使靶蛋白與點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合。
[0011 ] 一些實(shí)施方式提供了使靶蛋白與N末端點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括為靶蛋白提供例如作為N末端融合物的1-10個(gè)N末端甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括使靶蛋白與包含分選酶識(shí)別基序(例如，LPXT)和點(diǎn)擊化學(xué)柄的肽接觸。在一些實(shí)施方式中，在分選酶存在的情況下，在適于分選酶使靶蛋白和肽轉(zhuǎn)酰胺化的條件下進(jìn)行接觸，因此使靶蛋白與點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合。
[0012]使用本文所述的方法，可以將任何化學(xué)配基安裝至蛋白質(zhì)上。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，點(diǎn)擊化學(xué)柄是特別有用的。點(diǎn)擊化學(xué)柄是提供可以參與點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)的化學(xué)配基。點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和用于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的合適化學(xué)基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括但不限于末端炔烴、疊氮化物、有張力的炔烴、二烯、親二烯體、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烴。例如，在一些實(shí)施方式中，疊氮化物和炔烴用于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中。
[0013]本發(fā)明的一些方面提供了修飾的蛋白質(zhì)，例如，包含C末端或N末端點(diǎn)擊化學(xué)柄的蛋白質(zhì)。這類(lèi)蛋白質(zhì)可以結(jié)合于其他分子，例如，包括可以與蛋白質(zhì)的點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)的配基的蛋白質(zhì)、核酸、聚合物、脂類(lèi)或小分子。在一些實(shí)施方式中，修飾的蛋白質(zhì)包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，抗體(例如，駱駝抗體、單一結(jié)構(gòu)域抗體、VHH結(jié)構(gòu)域、納米體或scFv)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其抗原結(jié)合片段。
[0014]本發(fā)明的一些方面提供了借助點(diǎn)擊化學(xué)使兩個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)合或連接的方法。在一些實(shí)施方式中，將第一點(diǎn)擊化學(xué)柄安裝至第一蛋白質(zhì)上，并且將第二點(diǎn)擊化學(xué)柄安裝至第二蛋白質(zhì)上，其中第 一點(diǎn)擊化學(xué)柄可以與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄形成共價(jià)鍵。例如，一些實(shí)施方式提供用于翻譯后結(jié)合兩種蛋白質(zhì)以形成嵌合蛋白的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括使得與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的第一蛋白質(zhì)和與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的第二蛋白質(zhì)在適于第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)的條件下接觸，因此產(chǎn)生了包含經(jīng)共價(jià)鍵連接的兩個(gè)蛋白質(zhì)的嵌合蛋白。
[0015]本文中提供的方法允許產(chǎn)生不能通過(guò)重組手段(例如，表達(dá)蛋白質(zhì)融合物)實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)N末端-N末端結(jié)合物和C末端-C末端結(jié)合物。例如，在一些實(shí)施方式中，第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與第一蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合，并且第二點(diǎn)擊化學(xué)柄與第二蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合，并且嵌合蛋白是兩種蛋白質(zhì)的N末端-N末端結(jié)合物。在其他實(shí)施方式中，第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與第一蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合，并且第二點(diǎn)擊化學(xué)柄與第二蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合，并且嵌合蛋白包括兩種蛋白質(zhì)的C末端-C末端結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，點(diǎn)擊柄用來(lái)連接第一多肽和第二多肽的C末端和N-末端，例如，作為重組地產(chǎn)生融合蛋白的替代。這是特別有用的，例如，如果融合蛋白非常大、有毒、難以純化、由難以克隆的核酸序列編碼或?yàn)楸苊饪寺　?br> [0016]本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了嵌合蛋白，例如，根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)方面已經(jīng)通過(guò)翻譯后將兩種蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生嵌合蛋白。一些實(shí)施方式提供雙特異性嵌合抗體，包括借助點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合在一起的兩個(gè)抗原結(jié)合蛋白，例如，單一結(jié)構(gòu)域抗體。一些實(shí)施方式提供雙特異性嵌合抗體，包括包含分選酶識(shí)別序列的第一抗體或抗原結(jié)合抗體片段和包含分選酶識(shí)別序列的第二抗體或抗原結(jié)合抗體片段；并且第一抗體和第二抗體或抗體片段借助點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合在一起。
[0017]應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明不限于抗原結(jié)合蛋白的結(jié)合，反而任何蛋白質(zhì)可以與包含合適點(diǎn)擊化學(xué)柄或可以根據(jù)本文所述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在其上安裝這種柄的任何分子結(jié)合。因此，一些實(shí)施方式提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含具有分選酶識(shí)別基序(例如，LPXT)的靶蛋白和借助點(diǎn)擊化學(xué)與該蛋白質(zhì)結(jié)合的第二分子。在一些實(shí)施方式中，該嵌合蛋白通過(guò)翻譯后在靶蛋白上安裝點(diǎn)擊化學(xué)柄并且使包含點(diǎn)擊化學(xué)柄的靶蛋白與第二分子接觸來(lái)產(chǎn)生，其中所述第二分子包含可以與靶蛋白的點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的第二點(diǎn)擊化學(xué)柄。
[0018]一些實(shí)施方式提供修飾的蛋白質(zhì)，例如，包含分選酶識(shí)別基序(例如，LPXT)和與所述分選酶識(shí)別基序結(jié)合(例如，直接與分選酶識(shí)別基序的氨基酸之一結(jié)合或經(jīng)接頭結(jié)合)的點(diǎn)擊化學(xué)柄的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，修飾的蛋白質(zhì)包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，抗體或抗原結(jié)合抗體片段。本文中提供的示例性修飾的蛋白質(zhì)包括但不限于駱駝抗體或其抗原結(jié)合片段、VHH結(jié)構(gòu)域、單一結(jié)構(gòu)域抗體、納米體、scFv、親和體、模擬抗體Anticalin、DARPin或Adnectin。在一些實(shí)施方式中，點(diǎn)擊化學(xué)柄位于蛋白質(zhì)的C末端處,而在其他實(shí)施方式中，點(diǎn)擊化學(xué)柄位于蛋白質(zhì)的N末端處。在一些實(shí)施方式中，點(diǎn)擊化學(xué)柄選自末端炔烴、疊氮化物、有張力的炔烴、二烯、親二烯 體、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烴。
[0019]本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了試劑盒，所述試劑盒包含可用于實(shí)施本文中提供的方法的一種或多種試劑。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的試劑盒包含與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的第一肽和與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶識(shí)別基序的第二肽，其中第一肽和第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄可以反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒包含與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的第一肽和與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的第二肽，其中第一肽和第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄可以反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒包含與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶識(shí)別基序的第一肽和與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶識(shí)別基序的第二肽，其中第一肽和第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄能夠彼此反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒還包含分選酶。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還包含使用說(shuō)明書(shū)、催化劑(例如金屬催化劑)和/或反應(yīng)緩沖液。
[0020]以上簡(jiǎn)述意在概述本發(fā)明的一些方面，不得以任何方式解釋為限制本發(fā)明。本發(fā)明的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方式在本文中描述，并且其他實(shí)施方式將是本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本公開(kāi)而顯而易見(jiàn)的。以上援引的全部參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。
[0021]附圖簡(jiǎn)述
[0022]圖1.使用分選酶和點(diǎn)擊化學(xué)產(chǎn)生C-C蛋白質(zhì)二聚體和N-N蛋白質(zhì)二聚體。在上面的圖中，術(shù)語(yǔ)“LEPTGG”指分選酶識(shí)別基序，例如，包含LPXT序列如LPETGG (SEQ ID NO:1)的識(shí)別基序。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs XX-XX。
[0023]圖2.A)分選酶催化的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)的示意圖。B)適于產(chǎn)生結(jié)合的蛋白質(zhì)的示例性點(diǎn)擊化學(xué)柄和反應(yīng)。C)在抗體I和2上安裝C末端點(diǎn)擊柄A和B。D)抗體I和2的二聚化。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs XX-XX。
[0024]圖3.A)可以利用點(diǎn)擊化學(xué)并入到蛋白質(zhì)上的示例性其他官能團(tuán)。B)聚乙二醇化雙特異性抗體和蛋白質(zhì)三聚體的合成。[0025]圖4.使用N末端標(biāo)記的泛素類(lèi)似物優(yōu)化點(diǎn)擊化學(xué)。A)用點(diǎn)擊柄標(biāo)記C3Ub_VME。B)確定形成的構(gòu)建體的活性。將UbVME單體和二聚體與UCHL3孵育。DUB的標(biāo)記導(dǎo)致分子量變化。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs XX-XX。
[0026]圖5.使用泛素作為模型蛋白的N末端分選標(biāo)記。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs XX-XX。
[0027]圖6.疊氮化物-Ub和環(huán)辛炔-Ub的點(diǎn)擊化學(xué)N-N 二聚化的動(dòng)力學(xué)。
[0028]圖7.抗-p2M和抗-GFP抗體的C-C 二聚化示意圖。術(shù)語(yǔ)“LEPTGG”指分選酶識(shí)別基序，例如，包含LPXT序列如LPETGG (SEQ ID NO:1)的識(shí)別基序。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOs XX-XX。
[0029]圖8.通過(guò)尺寸排阻色譜純化。
[0030]圖9.抗-GFP納米體的分選標(biāo)記。
[0031]圖10.干擾素α和抗-GFP (抗_eGFP)納米體的分選標(biāo)記。37:C末端疊氮化物；57:C末端環(huán)辛炔；40:N末端環(huán)辛炔；41:N末端疊氮化物；LPETGG:SEQ ID NO:1。
[0032]圖11.1NFA 和抗-GFP 的分選標(biāo)記。LPETGG:SEQ ID NO:1。
[0033]圖12.方法的 示意性概述。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs XX-XX。
[0034]圖13.泛素二聚化的條件。(A)示意性方法。(B)泛素用I或2分選標(biāo)記3小時(shí)并用LC/MS分析。(C、D)泛素二聚化。疊氮化修飾的泛素(2nmol)與等摩爾量的裝配泛素的環(huán)辛炔在13 μ L H2O中孵育。在15%SDS-PAGE上解析二聚體并且通過(guò)針對(duì)泛素的考馬斯(C)和(D)免疫印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)。(E)與DIBAC-泛素(0.1nmol)孵育所指示時(shí)間的疊氮基-泛素(0.1nmol)在TRIS/Tricine凝膠上解析,通過(guò)考馬斯藍(lán)染色,并且通過(guò)ImageJ將所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)定量。如下確定單體和二聚體的相對(duì)量/泳道:二聚體的相對(duì)量=二聚體的強(qiáng)度/總強(qiáng)度；單體的相對(duì)量=單體的強(qiáng)度/總強(qiáng)度。(F)用泛素或UbVME標(biāo)記UCHL3 ；左小圖:考馬斯染色的凝膠，右小圖:針對(duì)his6標(biāo)簽的免疫印跡法。序列從頂部至底部分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOs XX-XX。
[0035]圖14.合成N-N融合的蛋白質(zhì)。(A)所用的N末端探針I(yè)和2的結(jié)構(gòu)。(B、C)用二聚體UbVME標(biāo)記具有His標(biāo)簽的UCHL3。(B)考馬斯亮蘭染色的tris_tricine凝膠。(C)使用抗His抗體的免疫印跡。Ub-UbVME*:與單一 UCHL3結(jié)合的泛素-UbVME。UbVME2*:與單一 UCHL3分子結(jié)合的二聚體UbVME。UbVME2*:與兩個(gè)UCHL3分子結(jié)合的二聚體UbVME。
[0036]圖15.C-C同型二聚抗體。(A)探針3和4的結(jié)構(gòu)。(B)抗GFP的二聚化。(C)顯示兩種抗GFP均結(jié)合GFP的尺寸排阻實(shí)驗(yàn)。紅線(xiàn):抗GFP二聚體，綠線(xiàn):GFP，淺藍(lán)色線(xiàn):抗-GFP二聚體+2.5 μ L GFP,深藍(lán)色線(xiàn):抗GFP+10 μ L GFP,黑線(xiàn):抗-GFP 二聚體+20 μ L GFP (過(guò)量)。
[0037]圖16.(A)純化用探針4分選標(biāo)記的抗GFP?？捡R斯亮蘭染色的凝膠(B)和純化后的用4標(biāo)記的抗-GFP的質(zhì)譜(C)。(D)GFP-3和aGFP-4的二聚化。TRIS (50mM，pH7.4，150mM NaCl)中的aGFP_3 (2.5μ g，0.17nmol)與等摩爾量的aGFP_4在室溫孵育所指示的時(shí)間。在TRIS/tricine SDS-PAGE上將二聚化產(chǎn)物與單體分離。蛋白質(zhì)通過(guò)熒光成像(λ ex=532, λ em=580，左小圖)和考馬斯亮蘭(中部小圖)被可視化并且被定量(右小圖)。如所述對(duì)泛素確定單體對(duì)二聚體的相對(duì)量。(E)在Superdex?7510/30上純化抗-GFP 二聚體。(F)在15%SDS-PAGE上分析濃縮的純化的蛋白質(zhì)。[0038]圖17.在GFP存在和不存在下孵育的單體抗GFP-3和抗GFP-4的Superdex?20010/30 洗脫圖。
[0039]圖18.將以12.5mL (I)和15.5mL (2)與30yL GFP孵育的抗GFP 二聚體洗脫的峰濃縮并加載于天然PAGE上。
[0040]圖19.熒光抗GFP-4-VHH7-3 (A)和非熒光抗GFP-4-VHH7-5 (B)的二聚化和純化。
[0041]圖20.(A)用抗MHC I1-抗GFP抗體對(duì)小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的FACS染色。上面的圖:在野生型細(xì)胞中觀察染色。下面的圖:11類(lèi)MHC缺損細(xì)胞的染色。(B)GFP的體內(nèi)遞送。用50 Ug雙特異性注射小鼠，并且腹內(nèi)直接接受或在靜脈內(nèi)注射50 μ g GFPl小時(shí)后。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞。
[0042]圖21.用抗MHC I1-抗GFP抗體對(duì)小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的FACS染色。上面的小圖:在野生型細(xì)胞中觀察染色。下面的小圖:Π類(lèi)MHC缺損細(xì)胞的染色。
[0043]圖22.產(chǎn)生aGFP與VHH7、IL2和IFN的異二聚體。
[0044]定義
[0045]下文更詳細(xì)地描述特定官能團(tuán)和化學(xué)術(shù)語(yǔ)的定義。出于本發(fā)明的目的，化學(xué)元素根據(jù)CAS版本，化學(xué)和物理學(xué)手冊(cè)，第75版，封面內(nèi)頁(yè)元素周期表確定，并且特定官能團(tuán)通常如其中所述那樣定義。另外，有機(jī)化學(xué)的一般原理以及特定官能配基和反應(yīng)性在有機(jī)化學(xué)(Organic Chemistry) , Thomas Sorrell,大學(xué)科學(xué)書(shū)籍，索薩利托，1999;Smith 和 March 高等有機(jī)化學(xué)(March，s Advanced Organic Chemistry),第 5 版，Johnffiley&Sons 公司，紐約，2001 ；Larock,有機(jī)官能團(tuán)轉(zhuǎn)換(Comprehensive OrganicTransformations), VCH出版社，紐約，1989 ；Carruthers,當(dāng)代有機(jī)合成方法(Some ModernMethods of Organic Synthesis),第3版，英國(guó)劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1987中描述。
[0046]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂族的”包括飽和及不飽和、非芳族的、直鏈(即，非支鏈)、支鏈、非環(huán)和環(huán)狀(即，碳環(huán))烴，它們?nèi)芜x地被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取代。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，在本文中“脂族的”意在包括但不限于烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基和環(huán)炔基配基。因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”包括直鏈、支鏈和環(huán)狀烷基。類(lèi)似的常規(guī)適用于其他類(lèi)屬術(shù)語(yǔ)，如“烯基”、“炔基”等。另外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”、“烯基”、“炔基”等涵蓋取代和未取代的基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，如本文所用，“脂族的”用來(lái)指示具有1-20個(gè)碳原子(C1J脂族)的那些(環(huán)狀、非環(huán)狀、取代、未取代、支鏈或非支鏈)脂族基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-10個(gè)碳原子(C1,脂族)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-6個(gè)碳原子(C^6脂族)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-5個(gè)碳原子(Cm脂族)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-4個(gè)碳原子(Cm脂族)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-3個(gè)碳原子(C^脂族)。在某些實(shí)施方式中，脂族基團(tuán)具有1-2個(gè)碳原子(Cu脂族)。脂族基團(tuán)取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0047]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”指通過(guò)移除單個(gè)氫原子由烴部分衍生的含有I至20個(gè)之間碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的烷基含有1-20個(gè)碳原子(C1J烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-15個(gè)碳原子(Ch5烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-10個(gè)碳原子(C1,烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-8碳原子((V8烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-6個(gè)碳原子(C^6烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-5個(gè)碳原子(Cm烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-4個(gè)碳原子(CV4烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-3個(gè)碳原子(C^烷基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所用的烷基含有1-2個(gè)碳原子((V2烷基)。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、仲戍基、異戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基。烷基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞烷基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的烷基衍生的雙基。亞烷基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的。亞烷基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0048]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烯基”指通過(guò)移除單個(gè)氫原子由具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴部分衍生的單價(jià)基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的烯基含有2-20個(gè)碳原子(C2_20烯基)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的烯基含有2-15個(gè)碳原子(C2_15烯基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用的烯基含有2-10個(gè)碳原子(C2_1(l烯基)。在另外的實(shí)施方式中，烯基含有2-8個(gè)碳原子(C2_8烯基)。在另外的其他實(shí)施方式中，烯基含有2-6個(gè)碳原子(C2_6烯基)。在另外的其他實(shí)施方式中，烯基含有2-5個(gè)碳原子(C2_5烯基)。在另外的其他實(shí)施方式中，烯基含有2-4個(gè)碳原子(C2_4烯基)。在另外的其他實(shí)施方式中，烯基含有2-3個(gè)碳原子(C2_3烯基)。在另外的其他實(shí)施方式中，烯基含有2個(gè)碳原子(C2烯基)。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2- 丁烯-1-基等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基。烯基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞烯基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的烯基衍生的雙基。亞烯基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的。亞烯基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0049]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“炔基”指通過(guò)移除單個(gè)氫原子由具有至少一個(gè)碳-碳叁鍵的直鏈或支鏈烴衍生的單價(jià)基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的炔基含有2-20個(gè)碳原子(C2_2(l炔基)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明中使用的炔基含有2-15個(gè)碳原子(C2_15炔基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用的炔基含有2-10個(gè)碳原子(C2,炔基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2-8個(gè)碳原子(C2_8炔`基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2-6個(gè)碳原子(C2_6炔基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2-5個(gè)碳原子(C2_5炔基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2-4個(gè)碳原子(C2_4炔基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2-3個(gè)碳原子(C2_3炔基)。在另外的實(shí)施方式中，炔基含有2個(gè)碳原子(C2炔基)。代表性炔基包括但不限于，乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基。炔基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞炔基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的炔基衍生的雙基。亞炔基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的。亞炔基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0050]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”或“碳環(huán)基”指含有3-10個(gè)碳環(huán)原子的環(huán)狀脂族基團(tuán)(C3,碳環(huán))。碳環(huán)基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0051]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜脂族”指如本文定義的脂族部分，其包括飽和及不飽和、非芳族的、直鏈(即，非支鏈)、支鏈、非環(huán)和環(huán)狀(即，雜環(huán))或多環(huán)狀烴，它們?nèi)芜x地被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取代，并且進(jìn)一步在碳原子之間含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族配基通過(guò)將其上的一個(gè)或多個(gè)氫原子獨(dú)立置換成一個(gè)或多個(gè)取代基進(jìn)行取代。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，“雜脂族”在本文中意在包括，但不限于雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基和雜環(huán)炔基部分。因而，術(shù)語(yǔ)“雜脂族”包括術(shù)語(yǔ)“雜烷基”、“雜烯基”、“雜炔基”等。另外，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜烷基”、“雜烯基”、“雜炔基”等涵蓋取代和未取代的基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，如本文所用，“雜脂族的”用來(lái)指示具有1-20個(gè)碳原子和1-6個(gè)雜原子(C1J雜脂族)的那些(環(huán)狀、非環(huán)狀、取代、未取代、支鏈或非支鏈)雜脂族基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-10個(gè)碳原子和1-4個(gè)雜原子(C1,雜脂族)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子((V6雜脂族)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-5個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子(CV5雜脂族)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-4個(gè)碳原子和1-2個(gè)雜原子(CV4雜脂族)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-3個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子(Cu雜脂族)。在某些實(shí)施方式中，雜脂族基團(tuán)含有1-2個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子((V2雜脂族)。雜脂族基團(tuán)取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜烷基”指如本文定義的烷基配基，其在碳原子之間含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-20個(gè)碳原子和1-6個(gè)雜原子(C^雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-10個(gè)碳原子和1-4個(gè)雜原子(C1,雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子((V6雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-5個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子((V5雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-4個(gè)碳原子和1-2個(gè)雜原子(CV4雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-3個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子(CV3雜烷基)。在某些實(shí)施方式中，雜烷基含有1-2個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子(Cu雜烷基)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜亞烷基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的雜烷基衍生的雙基。雜亞烷基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的 。雜亞烷基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0053]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜烯基”指如本文定義的烯基部分，其在碳原子之間還含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-20個(gè)碳原子和1-6個(gè)雜原子(C2_2(l雜烯基)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-10個(gè)碳原子和1-4個(gè)雜原子(C2_1(l雜烯基)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子(C2_6雜烯基)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-5個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子(C2_5雜烯基)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-4個(gè)碳原子和1-2個(gè)雜原子(C2_4雜烯基)。在某些實(shí)施方式中，雜烯基含有2-3個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子(C2_3雜烯基)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜亞烯基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的雜烯基衍生的雙基。雜亞烯基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的。
[0054]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜炔基”指如本文定義的炔基配基，其在碳原子之間還含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如，氧、硫、氮、磷或硅原子)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-20個(gè)碳原子和1-6個(gè)雜原子(C2_2(l雜炔基)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-10個(gè)碳原子和1-4個(gè)雜原子(C2_1(l雜炔基)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子(C2_6雜炔基)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-5個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子(C2_5雜炔基)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-4個(gè)碳原子和1-2個(gè)雜原子(C2_4雜炔基)。在某些實(shí)施方式中，雜炔基含有2-3個(gè)碳原子和I個(gè)雜原子(C2_3雜炔基)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜亞炔基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的雜炔基衍生的雙基。雜亞炔基可以是環(huán)狀或非環(huán)的，支鏈或非支鏈的，取代或未取代的。
[0055]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)的”、“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”指環(huán)狀雜脂族基團(tuán)。雜環(huán)基指非芳族、部分不飽和或完全飽和的3-10元環(huán)系統(tǒng)，所述環(huán)系統(tǒng)包括大小3至8個(gè)原子的單環(huán)和雙環(huán)系統(tǒng)及三環(huán)系統(tǒng)，所述雙環(huán)系統(tǒng)和三環(huán)系統(tǒng)可以包括與非芳族環(huán)稠合的芳族五元或六元芳基或雜芳基。這些雜環(huán)包括具有獨(dú)立選自氧、硫和氮的I至3個(gè)雜原子的那些，其中所述氮雜原子和硫雜原子可以任選地被氧化并且氮雜原子可以任選地被季銨化。在某些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)的”指非芳族5元、6元或7元環(huán)或多環(huán)基團(tuán)，其中至少一個(gè)環(huán)原子是選自O(shè)、S和N的雜原子(其中氮雜原子和硫雜原子可以任選地被氧化)，并且剩余的環(huán)原子是碳，基團(tuán)經(jīng)任何環(huán)原子與分子的其余部分連接。雜環(huán)基包括但不限于雙環(huán)基或三環(huán)基，包括具有I個(gè)至3個(gè)之間獨(dú)立選自氧、硫和氮的雜原子的5元、6元或7元環(huán)，其中(i)每個(gè)5元環(huán)具有O至2個(gè)雙鍵，每個(gè)6元環(huán)具有O至2個(gè)雙鍵并且每個(gè)7元環(huán)具有O至3個(gè)雙鍵，(ii )氮雜原子和硫雜原子可以任選地被氧化，(iii)氮雜原子可以任選地被季銨化，并且(iv)前述任一種雜環(huán)可以與芳基或雜芳基環(huán)稠合。示例性雜環(huán)包括氮雜環(huán)丙基、氮雜環(huán)丁基、1，3-二氮雜環(huán)丁基、哌唳基、哌嗪基、氮雜環(huán)辛基(azocanyl)、硫雜環(huán)丙基(thiaranyl)、硫雜環(huán)丁基(thietanyl)、四氫噻吩基、二硫雜環(huán)戍燒(dithioIanyl )、噻環(huán)己基(thiacyc1hexanyl )、環(huán)氧乙烷基、氧雜環(huán)丁烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基(tetrahydropuranyl)、二氧雜環(huán)己基、氧硫雜環(huán)戍基(oxathiolanyl)、嗎啉基、硫氧雜環(huán)己烷基(thioxanyl)、四氫萘基等,它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基取代基。取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0056]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基”指具有3-20個(gè)環(huán)原子的芳族單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)，其中所述環(huán)系統(tǒng)的全部環(huán)原子均是碳并且可以是取代或未取代的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，“芳基”指具有I個(gè)、2個(gè)或3個(gè)芳環(huán)的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)C4-C2tl芳環(huán)系統(tǒng)，所述芳環(huán)包括但不限于苯基、聯(lián)苯基、萘基等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基。芳基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞芳基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的芳基衍生的芳基雙基。亞芳基可以是取代或未取代的。亞芳基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。另外，可以將亞芳基作為接頭基團(tuán)并入如本文定乂的亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜亞烷基、雜亞烯基或雜亞炔基。
[0057]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指具有3-20個(gè)環(huán)原子的芳族單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)，所述環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)環(huán)原子選自S、0和N ;0、I或2個(gè)環(huán)原子是獨(dú)立選自S、0和N的其他雜原子；并且剩余的環(huán)原子是碳，基團(tuán)經(jīng)任何環(huán)原子與分子的其余部分連接。示例性雜芳基包括但不限于吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基、吲哚基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、喹嗪基、噌啉基、喹唑啉基、酞嗪基、萘啶基、喹噁啉基、噻吩基、硫茚基(thianaphthenyl)、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、噻唑啉基(thiazolynyl )、異噻唑基、噻二唑啉基(thiadiazolynyl )、〖惡唑基、異P惡唑基、噁二唑基(oxadiaziolyl)、噁二唑基(oxadiaziolyl)等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基取代基。雜芳基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜亞芳基”指通過(guò)移除兩個(gè)氫原子由如本文定義的雜芳基衍生的雙基。雜亞芳基可以是取代或未取代的。另外，可以將雜亞芳基作為接頭基團(tuán)并入如本文定義的亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜亞烷基、雜亞烯基或雜亞炔基。雜亞芳基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0058]如本文所用、術(shù)語(yǔ)“?；笔侨〈耐榛淖蛹⑶抑妇哂型ㄊ?C (=0)Ra、-C (=0)0Ra、-C (=0)-0-C (=0)Ra、-C (=0)SRa、-C (=0)N (Ra)2、_C (=S)Ra、_C (=S)N (Ra)2 和-C(=S) S (Ra), -C (=NRa) Ra、-C (=NRa) ORa、-C (=NRa) SRa 以及 _C (=NRA) N (Ra) 2 的基團(tuán)，其中Ra是氫；鹵素；取代或未取代的羥基；取代或未取代的硫醇；取代或未取代的氨基；?；蝗芜x取代的脂族；任選取代的雜脂族；任選取代的烷基；任選取代的烯基；任選取代的炔基；任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、脂族氧基、雜脂族氧基、烷氧基、雜烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、脂族硫氧基、雜脂族硫氧基、烷基硫氧基、雜烷基硫氧基、芳基硫氧基、雜芳基硫氧基、單脂族氨基或二脂族氨基、單雜脂族氨基或二雜脂族氨基、單烷基氨基或二烷基氨基、單雜烷基氨基或二雜烷基氨基、單芳基氨基或二芳基氨基、或單雜芳基氨基或二雜芳基氨基；或兩個(gè)Ra基團(tuán)共同形成5元至6元雜環(huán)。示例性?；ㄈ?-CH0)、羧酸(_C02H)、酮、酰鹵、酯、酰胺、亞胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。?；〈幌抻诒疚乃龅膶?dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0059]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酰亞基(acylene)”是以下基團(tuán)的子集:取代的亞烷基、取代的亞烯基、取代的亞炔基、取代的雜亞烷基、取代的雜亞烯基或取代的雜亞炔基，并且指具有以下通式的?；?-R°- (C=X1) -R0-、-R0-X2 (C=X1) -R0-或-R0-X2 (C=X1) X3-R0-,其中 X1、X2和X3獨(dú)立地是氧、硫或NRr，其中Rr是氫或任選取代的脂族基，并且R°是如本文定義的任選取代的亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜亞烷基、雜亞烯基或雜亞炔基。其中Rci是亞烷基的不例性酰基包括-(CH2) T-0 (C=O) - (CH2) T- ；-(CH2) T-NRr (C=O) - (CH2) T- ；-(CH2) T_0 (C=NRr) - (CH2)T_ ；_ (CH2) T_NRr (C=NRr) - (CH2) T_ (CH2) t_ (C=O) - (CH2) τ_ (CH2) τ_ (C=NRr) - (CH2) τ_ (CH2)T-S (C=S) - (CH2) τ- ；-(CH2) T-NRr (C=S) - (CH2) τ- ；-(CH2) T_S (C=NRr) - (CH2) τ- ；-(CH2)χ-0 (C=S) - (CH2) τ- ；-(CH2) τ- (C=S) - (CH2) τ_ ;或-(CH2) T_S (C=O) - (CH2) τ-等，它們可以帶有一個(gè)或多個(gè)取代基；并且其中T的每種例子獨(dú)立地為O至20之間的整數(shù)。酰亞基取代基包含但不限于本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基”指式(-NH2)的基團(tuán)?！叭〈陌被被蛘咧竼稳〈陌?-NHRh)或雙取代的胺(-NRh2)，其中Rh取代基是如本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基(例如，氣基保護(hù)基；脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環(huán)芳基、雜芳基、酸基、氣基、硝基、羥基、硫醇、鹵素，脂族氣基、雜脂族氣基、燒氣基、二雜烷基氣基、芳基氣基、雜芳基氨基、烷基芳基、芳烷基、脂族氧基、雜脂族氧基、烷氧基、雜烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、脂族硫氧基、雜脂族硫氧基、烷基硫氧基、雜烷基硫氧基、芳基硫氧基、雜芳基硫氧基、酸氧基等，每種可以經(jīng)進(jìn)一步取代或可以不經(jīng)進(jìn)一步取代)。在某些實(shí)施方式中，雙取代的氨基(-NRh2)的Rh取代基形成5元至6元雜環(huán)。
[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“羥基的”或“羥基”指式(-0Η)的基團(tuán)?！叭〈牧u基”指式(-ORi)的基團(tuán)，其中Ri可以是產(chǎn)生穩(wěn)定的配基的任何取代基(羥基保護(hù)基；脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環(huán)芳基、雜芳基、?；?、硝基、烷基芳基、芳烷基等，每種可以經(jīng)進(jìn)一步取代或可以不經(jīng)進(jìn)一步取代)。
[0062]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“硫代”或“硫醇”指式(-SH)的基團(tuán)?！叭〈牧虼肌敝甘?-SRD的基團(tuán)，其中Rlr可以是產(chǎn)生穩(wěn)定的配基的任何取代基(硫醇保護(hù)基；脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環(huán)芳基、雜芳基、酸基、烷基芳基、芳烷基等，每種可以經(jīng)進(jìn)一步取代或可以不經(jīng)進(jìn)一步取代)。
[0063]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞氨基”指式(=NIO的基團(tuán)，其中Rlr對(duì)應(yīng)于氫或如本文所述的導(dǎo)致穩(wěn)定的配基形成的任何取代基(例如，氣基保護(hù)基；脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環(huán)芳基、雜芳基、酰基、氨基、羥基、烷基芳基、芳烷基等，每種可以經(jīng)進(jìn)一步取代或可以不經(jīng)進(jìn)一步取代)。
[0064]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“疊氮化物”或“疊氮基”指式(-N3)的基團(tuán)。
[0065]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鹵代”和“鹵素”指選自氟(氟，-F)、氯(氯，-Cl)、溴(溴，-Br)和碘(碘，-1)的原子。
[0066]“離去基團(tuán)”是本領(lǐng)域理解的術(shù)語(yǔ)，指鍵斷裂時(shí)伴隨一對(duì)電子一起離去的分子片段，其中所述分子片段是陰離子或中性分子。見(jiàn)，例如，Smith，高等有機(jī)化學(xué)(March’sAdvanced Organic Chemistry)第6版(501-502)。不例性離去基團(tuán)包括但不限于鹵素(例如，氯、溴、碘)和例如以下式的活化的取代羥基:-0C(=0)SRaa、-0C(=0)Raa、-0C02Raa、-0C(=0)N (Rbb)2^-OC (=NRbb) Raa、-OC (=NRbb) ORaa、-OC (=NRbb) N (Rbb)2^-OS (=0) Raa、-OSO2R'-OP(Rcc)2^-OP (Rcc) 3,-OP (=0)2Raa、-0P (=0) (Raa)2^-OP (=0) (ORcx) 2、-OP (=0)2N (Rbb)2或-OP (=0) (NRbb)2其中Raa是任選取代的脂族、任選取代的雜脂族、任選取代的芳基或任選取代的雜芳基；Rbb是氫、氨基保護(hù)基、任選取代的脂族基、任選取代的雜脂族基、任選取代的芳基或任選取代的雜芳基；和Rcx是氫、任選取代的脂族基、任選取代的雜脂族基、任選取代的芳基或任選取代的雜芳基。
[0067]如本文所用，術(shù)語(yǔ)Xaa指氨基酸，例如，表A的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，或表B的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)Xaa指例如下式的化合物:
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種將點(diǎn)擊化學(xué)柄安裝至靶蛋白的C末端的方法，所述方法包括步驟: Ca)為靶蛋白提供C末端分選酶識(shí)別序列； (b)在分選酶存在時(shí)，在適合于所述分選酶的條件下，使所述靶蛋白與包含1-10個(gè)N末端甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)以及所述點(diǎn)擊化學(xué)柄的肽或試劑接觸，以使所述靶蛋白和包含所述點(diǎn)擊化學(xué)柄的肽轉(zhuǎn)酰胺化，從而使所述靶蛋白與所述點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白與所述分選酶識(shí)別序列在蛋白質(zhì)的C末端處融合。
3.一種將點(diǎn)擊化學(xué)柄安裝至靶蛋白的N末端的方法，所述方法包括: (a)為靶蛋白提供1-10個(gè)N末端甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)； (b)在分選酶酶存在時(shí)，在適合于所述分選酶的條件下，使所述靶蛋白與包含分選酶識(shí)別基序的肽接觸，以使所述靶蛋白和所述肽轉(zhuǎn)酰胺化，從而使所述靶蛋白與所述點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述靶蛋白與所述1-10個(gè)N末端甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)在蛋白質(zhì)的N末端處融合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分選酶識(shí)別基序是分選酶A識(shí)別 基序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分選酶識(shí)別基序包含序列LPXT。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述1-10個(gè)N末端G甘氨酸殘基是3個(gè)N末端甘氨酸殘基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含位于所述點(diǎn)擊化學(xué)基團(tuán)和所述1-10個(gè)甘氨酸殘基或N末端烷基胺基團(tuán)之間，或位于所述點(diǎn)擊化學(xué)基團(tuán)和所述分選酶識(shí)別序列之間的接頭。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述接頭包含具有1-100個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:末端炔烴、疊氮化物、有張力的炔烴、二烯、親二烯體、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇、四嗪和烯烴。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述點(diǎn)擊化學(xué)柄選自環(huán)辛炔和疊氮化物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分選酶識(shí)別序列是LPETG(SEQID N0:4)。
13.一種翻譯后使兩個(gè)蛋白結(jié)合以形成嵌合蛋白的方法，所述方法包括: 在適于第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)的條件下，使與所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的第一蛋白質(zhì)和與所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的第二蛋白質(zhì)接觸，從而產(chǎn)生嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含經(jīng)共價(jià)鍵連接的兩個(gè)蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與所述第一蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄與所述第二蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合，并且所述嵌合蛋白是所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)的N末端-N末端的結(jié)合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄與所述第一蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄與所述第二蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合，并且所述嵌合蛋白包括兩個(gè)蛋白質(zhì)的C末端-C末端的結(jié)合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:末端炔烴、有張力的炔烴、二烯、烷氧基胺、膦、酰肼、四嗪和硫醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:疊氮化物、親二烯體、羰基和烯烴。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中 (i)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是末端炔烴，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (ii)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是具有張力的炔烴，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (iii)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是二烯，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是親二烯體； (iv)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是烷氧基胺，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是擬基； (V)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是膦，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (Vi)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是酰肼，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是擬基；或 (Vii)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是硫醇，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是烯烴； (Viii)所述第一蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是環(huán)辛炔，所述第二蛋白質(zhì)的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物。
19.一種雙特異性嵌合抗體，包括: 包含分選酶識(shí)別序列的第一抗體或抗原結(jié)合抗體片段；和 包含分選酶識(shí)別序列的第二抗體或抗原結(jié)合抗體片段； 其中所述第一抗體和所述第二抗體或抗體片段借助點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合在一起。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和所述第二抗體或抗體片段在它們的C-末端(C-C)或在它們的N-末端(N-N)經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合在一起。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體包括單一結(jié)構(gòu)域抗體或其抗原結(jié)合片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體包括駱駝抗體或其抗原結(jié)合片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體包括VHH結(jié)構(gòu)域或其抗原結(jié)合片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23—項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體包括scFv或其抗原結(jié)合片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24—項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和/或所述第二抗體包括納米體或其抗原結(jié)合片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和所述第二抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合不同的抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和所述第二抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合相同的抗原。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的嵌合抗體，其中所述第一抗體和第二抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合相同抗原的不同表位。
29.一種蛋白質(zhì)，包含具有分選酶識(shí)別基序的靶蛋白和借助點(diǎn)擊化學(xué)與蛋白質(zhì)結(jié)合的第二分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的蛋白質(zhì)，其中所述分選酶識(shí)別基序包含序列LPXT。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)通過(guò)翻譯后在所述靶蛋白上安裝點(diǎn)擊化學(xué)柄并且使所述靶蛋白與所述第二分子接觸來(lái)產(chǎn)生，其中所述第二分子包含在合適條件下可以與所述靶蛋白的所述點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的第二點(diǎn)擊化學(xué)柄。
32.根據(jù)權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述第二分子是第二蛋白質(zhì)、小分子化學(xué)化合物、核酸或脂質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的蛋白質(zhì)，其中所述第二蛋白質(zhì)包含分選酶識(shí)別基序。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的蛋白質(zhì)，其中所述靶蛋白和所述第二蛋白在質(zhì)翻譯后在它們的N-末端(N-N)或在它們的C-末端(C-C)借助點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合。
35.根據(jù)權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述靶蛋白包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
36.根據(jù)權(quán)利要求 29-35中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述第二分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
37.根據(jù)權(quán)利要求32-36中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述靶蛋白和所述第二分子各自包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且其中所述靶蛋白的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述第二分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不同的。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述第二分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合不同的抗原。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或所述第二分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體、抗原結(jié)合抗體片段、Adnectin、親和體、模擬抗體AnticaliruDARPin 或適體。
40.根據(jù)權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或所述第二分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括駱騎抗體、VHH結(jié)構(gòu)域、單一結(jié)構(gòu)域抗體、scFv、納米體或其抗原結(jié)合片段。
41.根據(jù)權(quán)利要求29所述的蛋白質(zhì)，其中所述第二分子包括合成的聚合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)，其中所述合成的聚合物包含PEG配基。
43.根據(jù)權(quán)利要求29所述的蛋白質(zhì)，其中其他的分子包含可檢測(cè)標(biāo)記物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的蛋白質(zhì)，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記物包括熒光團(tuán)、酶或放射性同位素。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的蛋白質(zhì)，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自熒光蛋白、熒光染料、螢光素酶和過(guò)氧化物酶。
46.一種蛋白質(zhì)，包含 分選酶識(shí)別基序；和 與所述分選酶識(shí)別基序結(jié)合的點(diǎn)擊化學(xué)柄。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的蛋白質(zhì)，其中所述分選酶識(shí)別基序包含序列LPXT。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
49.根據(jù)權(quán)利要求46-48中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括抗體或抗原結(jié)合抗體片段。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括駱駝抗體或其抗原結(jié)合片段、VHH結(jié)構(gòu)域、單一結(jié)構(gòu)域抗體、納米體、scFv、親和體、模擬抗體Anticalin、DARPin或Adnectin。
51.根據(jù)權(quán)利要求29-50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含位于所述點(diǎn)擊化學(xué)基團(tuán)和所述分選酶識(shí)別序列之間的接頭。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，其中所述接頭包含具有1-100個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求46-50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述點(diǎn)擊化學(xué)柄在所述蛋白質(zhì)的C末端。
54.根據(jù)權(quán)利要求46-50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述點(diǎn)擊化學(xué)柄在所述蛋白質(zhì)的N末端。
55.根據(jù)權(quán)利要求46-50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:末端炔烴、疊氮化物、有張力的炔烴、二烯、親二烯體、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烴。
56.—種試劑盒,包含: Ca)與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的第一肽；和 (b)與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶識(shí)別基序的第二肽；其中所述第一肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄和所述第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄可以在合適條件下反應(yīng)；以及，任選地， (c)分選酶。
57.一種試劑盒，包含: Ca)與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的第一肽；和 (b)與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含1-10個(gè)甘氨酸殘基或末端烷基胺的的第二肽；其中所述第一肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄和所述第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄可以在合適條件下反應(yīng)；以及，任選地， (c)分選酶。
58.—種試劑盒,包含: Ca)與第一點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶A識(shí)別基序的第一肽；和 (b)與第二點(diǎn)擊化學(xué)柄結(jié)合的包含分選酶識(shí)別基序的第二肽；其中所述第一肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄和所述第二肽的點(diǎn)擊化學(xué)柄可以在合適條件下反應(yīng)；以及，任選地， (c)分選酶。
59.根據(jù)權(quán)利要求56-58中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:末端炔烴、有張力的炔烴、二烯、烷氧基胺、膦、酰肼和硫醇。
60.根據(jù)權(quán)利要求56-59中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄選自由如下所組成的組:疊氮化物、親二烯體、羰基和烯烴。
61.根據(jù)權(quán)利要求56-60中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中 (i)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是末端炔烴，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (ii)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是有張力的炔烴，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (iii)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是二烯，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是親二烯體； (iv)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是烷氧基胺，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是羰基； (V)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是膦，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物； (vi)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是酰肼，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是羰基；或 (vii)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是硫醇，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是烯； (viii)所述第一點(diǎn)擊化學(xué)柄是環(huán)辛炔，所述第二點(diǎn)擊化學(xué)柄是疊氮化物。
62.根據(jù)權(quán)利要求56-61中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含催化劑、反應(yīng)緩沖液和/或所述試劑盒 的使用說(shuō)明書(shū)。
【文檔編號(hào)】C07K1/06GK103764665SQ201280042272
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月28日
【發(fā)明者】希德·L·普萊赫, 馬丁·D·威特, 尼古拉斯·C·約德 申請(qǐng)人:懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所