通過(guò)與TaqMan探針組合的多重PCR從單一抗體產(chǎn)生細(xì)胞中獲得Fab片段的方法
【專利摘要】本文報(bào)道了用于從單細(xì)胞中擴(kuò)增和定量編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸（人IgG同種型）的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的方法。
【專利說(shuō)明】通過(guò)與TaqMan探針組合的多重PCR從單一抗體產(chǎn)生細(xì)胞中獲得Fab片段的方法
[0001]在本文中報(bào)道了通過(guò)組合多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和TaqMan探針，從單一抗體產(chǎn)生細(xì)胞中獲得抗體的方法，以允許PCR產(chǎn)物的快速篩選。通過(guò)體外翻譯，可以獲得各個(gè)抗體的Fab片段，并且可以測(cè)定Fab片段的結(jié)合性質(zhì)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]隨著雜交瘤技術(shù)的建立(Cole,S.P.C.，等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R.Liss, p.77 (1985)； 和 Boerner, P.，等人，J.1mmunol.147 (1991) 86-95)，單克隆免疫球蛋白已經(jīng)在科學(xué)研究、人類保健和診斷學(xué)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此，單克隆(特別是治療性)免疫球蛋白的產(chǎn)生是一個(gè)進(jìn)行了大量研究的領(lǐng)域。在這方面，其中雜交瘤技術(shù)和曬菌體展示技術(shù)(Hoogenboom, H.R.和Winter, G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388 ；Marks, J.D.，等人，J.Mol.Biol.222 (1991) 581-597)是用于單克隆免疫球蛋白產(chǎn)生的兩種最常見技術(shù)。在雜交瘤技術(shù)中，穩(wěn)定克隆的獲得是需要克服的障礙，因此，減少抗體的多樣性，使得僅有限數(shù)量的B細(xì)胞可以成功地融合、增殖，以及隨后的被表征。相似地，基于噬菌體或酵母展示的組合文庫(kù)方法的缺點(diǎn)是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)。原始重鏈和輕鏈對(duì)的分離以及非同源配對(duì)(non cognate pairing),需要篩選大量免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞以鑒定高親和力的重鏈和輕鏈對(duì)。此外，此類非同源對(duì)可能顯示出與人抗原的不想要的交叉反應(yīng)。最后，由于固有的選擇偏倚，通過(guò)選擇和篩選組合文庫(kù)鑒定的靶特異性免疫球蛋白的遺傳多樣性通常是受限制的。
[0004]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法從免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞中產(chǎn)生免疫球蛋白。此類方法是例如雜交瘤技術(shù)。不同的方法是基于免疫球蛋白的核酸序列的鑒定。通常，所述方法足以鑒定可變區(qū)或者甚至僅CDR區(qū)或者僅CDR3區(qū)的序列。例如，mRNA分離自免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)，并用于構(gòu)建編碼免疫球蛋白的CDR區(qū)的cDNA文庫(kù)。然后，將cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞，例如NSO或CHO中，并用于篩選特異性免疫球蛋白產(chǎn)生。
[0005]W02008/104184報(bào)道了用于克隆同源抗體(cognate antibody)的方法。Tiller 等人(Tiller,T.，等人，J.1mmunol.Meth.329 (2007) 112-124)報(bào)道了來(lái)自單個(gè)人B細(xì)胞的單克隆抗體的有效產(chǎn)生。Braeuninger等人(Braeuninger, A.,等人，Blood93 (1999) 2679-2687)報(bào)道了來(lái)自T細(xì)胞富集的B細(xì)胞淋巴瘤的單個(gè)B細(xì)胞分子的分析。Rohatgi 等 A (Rohatgi, S.,等人，J.1mmunol.Meth.339 (2008) 205-219)報(bào)道了嵌套式(RT-) PCR引物的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和測(cè)試。在W002/13862中，報(bào)道了改變B細(xì)胞介導(dǎo)的病理的方法和組合物。Haurum等人(Mei jer, P.J.和Haurum, J.S., J.Mol.Biol.358(2006)764-772)報(bào)道了一步 RT 多重重疊延伸 PCR (one-step RT-multiplexoverlap extension PCR)。Stollar等人和Junghans等人通過(guò)單細(xì)胞PCR反應(yīng)報(bào)道了序列分析(Wang, X.Stollar, B.D., J.1mmunol.Meth.244 (2000) 217-225 ；Coronella, J.A.和 Junghans, R.P., Nucl.Acids Res.28 (2000) E85)。Jiang, X.和 Nakano, H.,等人(Biotechnol.Prog.22(2006)979-988)報(bào)道了用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的線性表達(dá)元件的構(gòu)建。[0006]發(fā)明概述
[0007]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)組合在反轉(zhuǎn)錄和基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)中所需的引物，以及在多重單管實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)中實(shí)時(shí)定量所需的探針，可以改進(jìn)(例如變得更快和更強(qiáng))通常使用的用于獲得編碼同源(cognate) VH和VL的核酸的多步驟方法。
[0008]在一個(gè)方面，在本文中報(bào)道了用于多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的方法，所述聚合酶鏈反應(yīng)用于從單個(gè)B細(xì)胞或成漿細(xì)胞或漿細(xì)胞中擴(kuò)增和定量編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸(人IgG同種型)，所述方法包括以下步驟:
[0009]-用第一和第二5’-引物以及第一和第二 3’-引物以及第一和第二 TaqMan探針，在一個(gè)步驟中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 5’ -引物與編碼重鏈前導(dǎo)肽或第一重鏈構(gòu)架區(qū)的核酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 5’ -引物與編碼輕鏈前導(dǎo)肽或第一輕鏈構(gòu)架區(qū)的核酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 3’ -引物與編碼重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的C-端氨基酸殘基的核酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 3’ -引物與編碼輕鏈恒定域的C-端氨基酸殘基的核酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 TaqMan探針與編碼重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的N-端氨基酸殘基的核酸互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二 TaqMan探針與編碼輕鏈恒定域的N-端氨基酸殘基的核酸互補(bǔ)。
[0011]在一個(gè)方面，本文中還報(bào)道了獲得單克隆抗體的方法，其包括體外翻譯編碼人免疫球蛋白G片段的核酸，其中使用如本文中所報(bào)道的用于擴(kuò)增和定量編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)方法，通過(guò)特異性擴(kuò)增獲自產(chǎn)生單一免疫球蛋白的人B細(xì)胞、成漿細(xì)胞或漿細(xì)胞或者包含人免疫球蛋白基因座的動(dòng)物的B細(xì)胞的mRNA的cDNA片段來(lái)獲得核酸。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，隨后將Fab PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成mRNA并使用大腸桿菌裂解物進(jìn)行體外翻譯。`
[0013]使用如本文中所報(bào)道的方法，有可能根據(jù)B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白的抗原結(jié)合特征，表征所提供的許多B細(xì)胞。因此，不會(huì)發(fā)生免疫球蛋白多樣性的丟失。由于分析的B細(xì)胞是體外成熟步驟之后獲得的成熟B細(xì)胞，所以所述B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白不太可能顯示出與其他抗原的交叉反應(yīng)。
[0014]在另外的實(shí)施方案中，如本文中所報(bào)道的方法的特征在于，引物提供了用于5’_引物的編碼翻譯起始密碼子ATG的突出端和/或用于3’-引物的編碼翻譯終止密碼子TTA的突出端。在另外的實(shí)施方案中，如本文中所報(bào)道的方法的特征在于包括其他步驟:
[0015]-提供單細(xì)胞并獲得該細(xì)胞的mRNA。
[0016]如本文中所報(bào)道的另一方面是用于產(chǎn)生免疫球蛋白Fab片段的方法，其包括以下步驟:
[0017]-提供單一免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞，
[0018]-使用如本文中所報(bào)道的用于擴(kuò)增和定量編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)，從細(xì)胞中獲得編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變域，任選地還編碼輕鏈恒定域的一部分和重鏈ChI結(jié)構(gòu)域的一部分的核酸，
[0019]-產(chǎn)生包含所獲得的核酸的線性表達(dá)基質(zhì)，
[0020]-體外翻譯核酸從而產(chǎn)生免疫球蛋白Fab片段。[0021]本文中所報(bào)道的另一方面是用于產(chǎn)生免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟:
[0022]-提供單一免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞，
[0023]-使用用于擴(kuò)增和定量如本文中所報(bào)道的編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)，從細(xì)胞中獲得編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變域的核酸，
[0024]-將前述步驟中獲得的每一核酸與編碼各個(gè)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定域的非編碼C-端恒定域氨基酸殘基的核酸有效連接，
[0025]-用在前述步驟中獲得的核酸轉(zhuǎn)染真核或原核細(xì)胞，
[0026]-培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方案中，在適合于表達(dá)免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，
[0027]-從細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白，從而產(chǎn)生免疫球蛋白。
[0028]在如本文中所報(bào)道的全部方法的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是免疫球蛋白G類(IgG)。
[0029]在如本文中所報(bào)道的全部方法的一個(gè)實(shí)施方案中，每一引物彼此相互獨(dú)立地選自SEQ ID NO:05,SEQ ID NO:06,SEQ ID NO:07,SEQ ID NO:08,SEQ ID NO:09,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
[0030]在如本文中所報(bào)道的全部方法的一個(gè)實(shí)施方案中，用彼此相互獨(dú)立的一對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，所述引物選自SEQ ID NO:05, SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07、SEQ IDNO:08, SEQ ID NO:09,SE`Q ID NO:10,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
[0031]發(fā)明詳述
[0032]在一個(gè)方面，本文報(bào)道了用于多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的方法，所述聚合酶鏈反應(yīng)用于擴(kuò)增和定量來(lái)自單個(gè)B細(xì)胞或成漿細(xì)胞或漿細(xì)胞的編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸(人IgG同種型)。
[0033]-使用第一和第二5’ -引物以及第一和第二 3’ -引物以及第一和第二 TaqMan探針，在一個(gè)步驟中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)。
[0034]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)組合在反轉(zhuǎn)錄和基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)中所需的引物，以及在多重單管實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)中實(shí)時(shí)定量所需的探針，可以改進(jìn)(例如變得更快和更強(qiáng))通常使用的用于獲得編碼同源VH和VL的核酸的多步驟方法。
[0035]尤其可以將該方法用作為改進(jìn)目前所使用的具有某些缺點(diǎn)的兩步方法的其他可能方法。例如，由于有可能誘導(dǎo)引物-引物-二聚體形成和/或誘導(dǎo)非特異性結(jié)合，所以為了增加靈敏性而使用高引物濃度是不合適的，或者增加擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目可以導(dǎo)致非特異性序列的擴(kuò)增。
[0036]通過(guò)使用用人pan B細(xì)胞標(biāo)記，⑶19包被的磁性微珠(參見例如，Bertrand, F.E.,III,等人，Blood90 (1997) 736-744)，可以從外周血中分離B細(xì)胞。在有限稀釋方法的情況下，可以將單細(xì)胞置于96孔微量滴定板的孔中?？梢蕴崛∵@些細(xì)胞的mRNA。
[0037]在如本文中所報(bào)道的方法中，在單管聚合酶鏈反應(yīng)中，將多重聚合酶鏈反應(yīng)用于同時(shí)擴(kuò)增編碼重鏈和輕鏈可變域的核酸。與在分離的反應(yīng)中擴(kuò)增重鏈可變域和輕鏈可變域相反，當(dāng)前方法提供了增加的靈敏性和增加量的擴(kuò)增序列。在聚合酶鏈反應(yīng)中使用基因特異性引物增強(qiáng)了該方法的特異性和準(zhǔn)確性。[0038]對(duì)于所需的靈敏性和準(zhǔn)確性，更復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)(在人IgG的情況下)需要引物設(shè)計(jì)、放置以及聚合酶鏈反應(yīng)的不同策略。
[0039]因此，本文報(bào)道了可以在不連接和連接擴(kuò)增的重鏈編碼區(qū)和輕鏈編碼區(qū)的情況下實(shí)施多重實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)。對(duì)于所獲得的核酸的體外翻譯，有益的是編碼結(jié)構(gòu)域包含適合于形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。
[0040]例如，在Ausubel, F.M.，ed.，Current Protocol s in MolecularBiology, Volumes I toIII (1997), Wiley and Sons ；Sambrook, J.,等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) ；Morrison, S.L.,等 A , Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81 (1984) 6851-6855 ；US5, 202, 238和US5, 204, 244.中報(bào)道了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于實(shí)施當(dāng)前發(fā)明的方法和技術(shù)。
[0041]術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”表示基本上由免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以以多種形式存在，所述形式包括例如，F(xiàn)v、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體。免疫球蛋白一般包含兩個(gè)所稱作的輕鏈多肽(輕鏈)和兩個(gè)所稱作的重鏈多肽(重鏈)。每一重鏈和輕鏈多肽含有可變域(可變區(qū))(通常為多肽鏈的氨基端部分)，其包含能與結(jié)合配偶體(通常為抗原)相互作用的結(jié)合區(qū)。每一重鏈和輕鏈多肽包含恒定區(qū)(通常為羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體與以下細(xì)胞的結(jié)合:i)攜帶Fe Y受體(Fe YR)的細(xì)胞，例如吞噬細(xì)胞或者ii)攜帶新生Fe受體(FcRn)(也已知為Brambell受體)的細(xì)胞。重鏈的恒定區(qū)還介導(dǎo)與一些因子的結(jié)合，包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子如成分(Clq)。免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的可變域依次包含不同區(qū)段，即四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)和三個(gè)超變區(qū)(⑶R)。
[0042]術(shù)語(yǔ)“嵌合免疫球蛋白”表示包含來(lái)自第一非人種屬的可變域即結(jié)合區(qū)和來(lái)自第二不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白，優(yōu)選地單克隆免疫球蛋白。嵌合免疫球蛋白通常通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合免疫球蛋白包含小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔或綿羊可變域和人恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人重鏈恒定區(qū)是人IgG恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人輕鏈恒定域是K輕鏈恒定域或λ輕鏈恒定域。
[0043]免疫球蛋白的“Fe部分”不直接參與結(jié)合抗原，但顯示出多種效應(yīng)子功能。取決于重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，將免疫球蛋白劃分為以下類別:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。將這些類別的一些進(jìn)一步劃分為亞類，即將IgG劃分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4或者將IgA劃分為IgAl和IgA2。根據(jù)免疫球蛋白所屬的免疫球蛋白類別，將免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為a (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE), Y (IgG)和μ (IgM)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白屬于IgG類。“免疫球蛋白的Fe部分”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語(yǔ)，并且基于木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白含有的Fe部分是人Fe部分或者來(lái)源于人類來(lái)源的Fe部分。在另外的實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分是亞類IgG4或IgGl的人免疫球蛋白的Fe部分或者是亞類IgGl、IgG2或IgG3的人免疫球蛋白的Fe部分，其以這樣的方式修飾，以使不能檢測(cè)到如下所定義的Fe Y受體(例如FcYRIIIa)結(jié)合和/或Clq結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分是人Fe部分，在另一個(gè)實(shí)施方案中，是人IgG4或IgGl亞類Fe部分或來(lái)自人IgGl亞類的突變的Fe部分。在另外的實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分來(lái)自具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類。盡管IgG4顯示出降低的Fe Y受體(例如Fcy RIIIa)結(jié)合，但其他IgG亞類的免疫球蛋白顯示出強(qiáng)烈的結(jié)合。然而，如果改變Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (丟失 Fe 糖)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 或 / 和 His435，那么也提供了降低的 Fe y受體結(jié)合(Shields, R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604 ；Lund, J.，等人，F(xiàn)ASEBJ.9(1995) 115-119;Morgan, A.，et al.，Immunol.86(1995)319-324 ；EP0307434)o 在一個(gè)實(shí)施方案中，提及Fe Y受體結(jié)合，免疫球蛋白是具有L234、L235和/或D265、和/或含有PVA236突變的IgG4或IgGl亞類或者IgGl或IgG2亞類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變是S228P、L234A、L235A、L235E 和 / 或 PVA236 (PVA236 意為來(lái)自 IgGl 的氨基酸位置 233 至236氨基酸序列ELLG (以單字母氨基酸密碼給出)或者IgG4的EFLG被PVA替換)。在另外的實(shí)施方案中，突變是IgG4的S228P和IgGl的L234A和L235A。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈恒定區(qū)具有這樣的氨基酸序列:SEQ ID N0:0USEQ ID NO:02、具有突變L234A和L235A的SEQ ID N0:01或具有突變S228P的SEQ ID NO: 02，而輕鏈恒定區(qū)具有SEQ ID NO: 03或SEQID NO:04的氨基酸序列。
[0044]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“人免疫球蛋白”表示這樣的免疫球蛋白，其具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(域)并與這些種系序列具有高度的序列相似性或同一性?？贵w的恒定區(qū)是人IgGl或IgG4型的恒定區(qū)或其變體。此類區(qū)域可以是異型的，并且由例如 Johnson, G.和 Wu, Τ.Τ.，Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218，及其中所參考的數(shù)據(jù)庫(kù)所述。
[0045]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“重組免疫球蛋白”表示通過(guò)重組方法制備、表達(dá)或產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語(yǔ)包括從宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、NS0、BHK或CHO細(xì)胞分離的免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的“重組人免疫球蛋白”具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。重組人免疫球蛋白已經(jīng)進(jìn)行了體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此,重組人免疫球蛋白的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是歸屬于定義的人種系VH和VL序列的序列，但不能天然地存在于體內(nèi)人抗體種系的所有組成成分中。
[0046]術(shù)語(yǔ)“單克隆免疫球蛋白”表示獲自基本上同質(zhì)的免疫球蛋白的群體的免疫球蛋白，即除以少量存在的天然發(fā)生的突變外，各個(gè)免疫球蛋白群是相同的。單克隆免疫球蛋白是針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)高度特異的。此外，與`多克隆免疫球蛋白制備物(其包括針對(duì)不同抗原位點(diǎn)(決定簇或表位)的不同免疫球蛋白)相反，每一單克隆免疫球蛋白針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。除單克隆免疫球蛋白的特異性之外，它們的有利之處在可以通過(guò)其他免疫球蛋白無(wú)污染的合成。修飾語(yǔ)“單克隆”表示獲自基本上同質(zhì)的免疫球蛋白群體的免疫球蛋白的特征，并且并不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任意特定的方法產(chǎn)生免疫球蛋白。
[0047]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“可變域”(輕鏈(')的可變域、重鏈(Vh)的可變域)表示直接參與靶抗原的結(jié)合的免疫球蛋白的一對(duì)輕鏈和重鏈的各個(gè)結(jié)構(gòu)域?？勺冇蛲ǔＪ禽p鏈和重鏈的N-端結(jié)構(gòu)域。輕鏈和重鏈的可變域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，即它們擁有“免疫球蛋白構(gòu)架”，并且每一結(jié)構(gòu)域包含通過(guò)三個(gè)“高變區(qū)”(或者“互補(bǔ)決定區(qū)，⑶R”)連接的四個(gè)“構(gòu)架區(qū)”(FR)，其序列是相當(dāng)保守的。在本申請(qǐng)內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)”或“高變區(qū)”(HVR)是可互換使用的，并表示主要參與抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”區(qū)(FR)是那些除高變區(qū)以外的可變域的區(qū)域。因此，免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變域從N-端至C-端包含區(qū)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根據(jù)Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義，確定Q)R和FR氨基酸殘基。
[0048]如本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”表示羧基a_氨基酸的組群，其可以由核酸直接編碼或者編碼為前體形式。各個(gè)氨基酸通過(guò)由三個(gè)核苷酸(所稱作的密碼子或堿基-三聯(lián)體)組成的核酸編碼。每一氨基酸通過(guò)至少一個(gè)密碼子編碼。將通過(guò)不同密碼子編碼的同一氨基酸稱為“遺傳密碼的簡(jiǎn)并性”。如本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”表示天然存在的羧基a-氨基酸，并且包括丙氨酸(三字母密碼:ala,單字母密碼:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gin, Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟顏氨酸(val, V)。
[0049]在本申請(qǐng)內(nèi)，“核酸”或“核酸序列”是可以互換使用的術(shù)語(yǔ)，指由各個(gè)核苷酸(也稱為堿基)‘a(chǎn)’、‘c’、‘g’和‘t’(或者在RNA中為‘u’)組成的聚合分子，即指DNA、RNA或其修飾物。多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或者合成的多核苷酸分子或者一個(gè)或多個(gè)天然存在的多核苷酸分子與一個(gè)或多個(gè)合成的多核苷酸分子的組合。該定義還包括這樣的天然存在的多核苷酸分子，其中改變(例如通過(guò)誘變)、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸。核酸可以是分離的或者是整合到另一核酸中的，例如整合到表達(dá)盒、質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞的染色體中。核酸的特征在于其核酸序列由各個(gè)核苷酸組成。
[0050]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，將例如多肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)變成編碼該氨基酸序列的相應(yīng)核酸序列的步驟和方法是熟知的。因此，核酸的特征在于其核酸序列由各個(gè)核苷酸組成，并且同樣地所述核酸編碼多肽的氨基酸序列。
[0051]使用如本文中所報(bào)道的包含單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，可以從單細(xì)胞獲得編碼單克隆免疫球蛋白的核酸。此外，使用如本文中所報(bào)道的PCR方法和體外翻譯的組合，可以`從單細(xì)胞獲得編碼單克隆免疫球蛋白的核酸，并且可以以足以表征免疫球蛋白的結(jié)合性質(zhì)的量至少以Fab片段的形式提供編碼的免疫球蛋白。為了擴(kuò)增獲自單細(xì)胞的非常少量的mRNA，PCR (聚合酶鏈反應(yīng))必須非常靈敏。
[0052]因此，基于從單細(xì)胞中擴(kuò)增編碼IgG同種型免疫球蛋白的同源IgG HC (免疫球蛋白G重鏈)和IgG LC (免疫球蛋白G輕鏈)的核酸以及隨后體外翻譯所獲得的擴(kuò)增核酸，可以提供Fab片段或完整的免疫球蛋白。使用該方法，提供了獲得通過(guò)單細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白的有關(guān)信息的高靈敏度的方法。所述信息甚至可以從單細(xì)胞的微量mRNA中獲得。根據(jù)本發(fā)明的方法允許用生物化學(xué)方法表征由單細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白的結(jié)合特征。因此，與雜交瘤技術(shù)相比，使用該方法，可以實(shí)現(xiàn)更高的多樣性的表征。此外，由于可以例如從抗原接觸后的成熟B細(xì)胞中獲得同源免疫球蛋白鏈，所以可以選擇性地獲得編碼高特異性以及正確裝配的免疫球蛋白的核酸。
[0053]如本文中所報(bào)道，用于從單細(xì)胞中獲得編碼免疫球蛋白Fab片段的核酸的方法包括用于從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增編碼同源IgG HC和IgG LC (人IgG同種型)的核酸的單管實(shí)時(shí)多重半嵌套式PCR。因此，可以使用大腸桿菌細(xì)胞裂解物體外翻譯Fab片段。可以使用ELISA和蛋白質(zhì)印跡方法確認(rèn)表達(dá)。
[0054]總之，如本文中所報(bào)道的方法包括以下一般步驟[0055]i)用人⑶19包被的磁性微珠從外周血中分離B細(xì)胞，
[0056]ii)通過(guò)例如有限稀釋或FACS沉積單細(xì)胞，
[0057]iii)提取各個(gè)B細(xì)胞的mRNA，
[0058]iv)獲得由各個(gè)B細(xì)胞產(chǎn)生的編碼免疫球蛋白的至少可變域(VH和VL)的一個(gè)或多個(gè)核酸，
[0059]V)體外翻譯RNA模版，和，
[0060]vi)任選地，表征免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的結(jié)合性質(zhì)。
[0061]如本文中報(bào)道的基于PCR的方法是高度靈敏的，并且導(dǎo)致擴(kuò)增的編碼免疫球蛋白的重鏈和輕鏈或其片段的核酸的高度回收。在體外翻譯用如本文中所報(bào)道的基于PCR的方法獲得的核酸后，還提供了表達(dá)功能性和穩(wěn)定的Fab片段的方法。
[0062]可以互換使用的術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”和“PCR”表示用于特異性擴(kuò)增核酸例如DNA或RNA的區(qū)域的方法。該方法已經(jīng)由K.Mullis (參見例如Winkler, Μ.Ε.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA79 (1982) 2181-2185)研發(fā)。區(qū)域可以是單個(gè)基因、基因的一部分、編碼或者非編碼序列。大多數(shù)PCR方法通常擴(kuò)增數(shù)百個(gè)堿基對(duì)(bp)的DNA片段，盡管一些技術(shù)允許擴(kuò)增多達(dá)40千個(gè)堿基對(duì)(kb)大小的片段?；镜腜CR設(shè)置需要幾種組分和試劑。這些組分包括含待擴(kuò)增區(qū)域的核酸模版、與待擴(kuò)增區(qū)域的5’ -和3’ -末端互補(bǔ)的兩種引物、聚合酶，例如Taq聚合酶或者另一熱穩(wěn)定性聚合酶、聚合酶從中合成新鏈的脫氧核苷三磷酸(dNTP)、為聚合酶的最佳 活性和穩(wěn)定性提供合適的化學(xué)環(huán)境的緩沖液、二價(jià)陽(yáng)離子，通常為Mg2+，以及最后，單價(jià)陽(yáng)離子如鉀離子。
[0063]可以互換使用的術(shù)語(yǔ)“多重聚合酶鏈反應(yīng)”或“多重PCR”表示在單個(gè)PCR反應(yīng)/混合物中使用多個(gè)獨(dú)特的引物的聚合酶鏈反應(yīng)，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過(guò)一次靶向多個(gè)基因，可以從單個(gè)測(cè)試運(yùn)行中獲得其他信息，否則需要幾倍的試劑和更多的時(shí)間運(yùn)行才能獲得該信息。必須優(yōu)化每一引物集的退火溫度，以在單個(gè)反應(yīng)內(nèi)正確地運(yùn)行。此外，當(dāng)通過(guò)凝膠電泳目測(cè)時(shí)，擴(kuò)增子大小應(yīng)當(dāng)足夠不同，以形成不同的條帶。
[0064]在人類基因組中，含有免疫球蛋白編碼基因的染色體基因座位于染色體2、14和22 (參見圖1)。人免疫球蛋白G重鏈基因座可以見于染色體14 (14q32.2)上，所述基因座中的染色體方向:端粒-5’ -末端-Vh-D-Jh-Ch_3’ -末端-著絲粒。如下表1中所述，對(duì)染色體上的VHg段進(jìn)行分類。
[0065]表1.根據(jù) Matsuda, F.，等人，J.Exp.Med.188 (1998) 2151-2162 和 Tomlinson, 1.Μ.,等人，V Base sequence directoryl999,將 VH_ 基因分組成 Vh 家族。
[0066]
【權(quán)利要求】
1.用于從單細(xì)胞擴(kuò)增和定量編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的方法，其包括以下步驟: -使用第一和第二 5’-引物以及第一和第二 3’-引物以及第一和第二 TaqMan探針，在一個(gè)步驟中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于 a)第一5’ -引物與編碼重鏈前導(dǎo)肽或第一重鏈構(gòu)架區(qū)的核酸序列互補(bǔ)，和/或 b)第二5’ -引物與編碼輕鏈前導(dǎo)肽或第一輕鏈構(gòu)架區(qū)的核酸序列互補(bǔ)，和/或c)第一3’ -引物與編碼重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的C-端氨基酸殘基的核酸序列互補(bǔ)，和/或 d)第二3’ -引物與編碼輕鏈恒定域的C-端氨基酸殘基的核酸序列互補(bǔ)，和/或 e)第一TaqMan探針與編碼重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的N-端氨基酸殘基的核酸互補(bǔ)，和/或 f)第二TaqMan探針與編碼輕鏈恒定域的N-端氨基酸殘基的核酸互補(bǔ)。
3.用于獲得單克隆抗體的方法，其包括以下步驟 -體外翻譯編碼免疫球蛋白片段的核酸，其中所述核酸通過(guò)使用根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的方法，特異性擴(kuò) 增獲自單一免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞的mRNA的cDNA片段獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟 -隨后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成mRNA，并使用大腸桿菌細(xì)胞裂解物體外翻譯所述mRNA。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述引物提供了用于5’-引物的編碼翻譯起始密碼子ATG的突出端和/或用于3’ -引物的編碼翻譯終止密碼子TTA的突出端。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于包括另外的步驟: -提供單細(xì)胞并獲得該細(xì)胞的mRNA。
7.用于產(chǎn)生免疫球蛋白Fab-片段的方法，其包括以下步驟: -提供單一免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞， -使用用于擴(kuò)增和定量根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)中的編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)，從所述細(xì)胞中獲得編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變域，任選地還編碼輕鏈恒定域的一部分和重鏈ChI結(jié)構(gòu)域的一部分的核酸， -產(chǎn)生包含獲得的核酸的線性表達(dá)基質(zhì)， -體外翻譯所述核酸，從而產(chǎn)生所述免疫球蛋白Fab片段。
8.用于產(chǎn)生免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟: -提供單一免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞， -使用用于擴(kuò)增和定量根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的編碼同源IgG重鏈和輕鏈的核酸的多重單管實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)，從所述細(xì)胞獲得編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變域的核酸， -將前述步驟中獲得的每一所述核酸與編碼所述各個(gè)免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定域的非編碼C-端恒定域氨基酸殘基的核酸有效連接， -用前述步驟中獲得的所述核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞或原核細(xì)胞， -培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方案中，在適合于表達(dá)所述免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，-從所述細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收所述免疫球蛋白，從而產(chǎn)生免疫球蛋白。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述免疫球蛋白是G類免疫球蛋白(IgG)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述單細(xì)胞是單個(gè)B細(xì)胞或者單個(gè)成衆(zhòng)細(xì)胞或者單個(gè)衆(zhòng)細(xì)胞。
11.SEQ ID N0:05或06或07或08或09或10的核酸。
12.試劑盒，其包含SEQID N0:05、06、07、08、09和10的核酸。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK103814047SQ201280045381
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月21日
【發(fā)明者】H-W·克雷爾, A·利夫克, V·利夫克, K·馬丁, C·韋爾克 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司