體內adcc模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含人源化低親和性FcgR基因座的非人動物。本發(fā)明還提供所述非人動物用于確定抗體的體內功效的用途，以及用于確定抗體的體內功效的方法。
【專利說明】體內ADCC模型
【技術領域】
[0001]本發(fā)明的領域是包含人源化低親和性Fc-Y受體(FcgR)基因座的轉基因非人動物，包括包含用人低親和性FcgR基因替代內源性低親和性FcgR基因的轉基因非人動物，包括能夠表達四個功能性人低親和性FcgR基因的非人動物，和包括不表達內源性低親和性FcgR基因的非人動物。
【背景技術】
[0002]已經(jīng)證明，治療性抗體(TherAbs)對于如贅生性疾病或自體免疫炎癥痛苦這樣的人類疾病的治療是高度有效的。常常，TherAbs的治療作用所基于的是腫瘤細胞的細胞毒性清除，這使得這些抗體制劑的效應子功能特性成為一個關鍵問題。鼠來源的TherAbs常常在所治療患者中導致免疫反應(抗-藥物抗體(ADA)反應)。盡管預期純粹人TherAbs實質性地減輕了 ADA反應問題，但在進入人治療前其生物功效的可預測性在很大程度上仍然未得到解決。由于與新TherAbs研發(fā)相關的巨大成本，因此需要能夠在該過程的早期預測其功效的工具。通常在異種移植物試驗中測試抗腫瘤抗體藥物的體內功效。由此，首先將靶標人腫瘤接種于免疫缺陷小鼠中，通常為Scid或RAG突變體，并且使其生長，接著注射TherAbs0通過TherAbs消除人腫瘤的能力來確定TherAbs的功效。在該系統(tǒng)中,接種的癌細胞的破壞很大程度上依賴于由引入的(人)TherAbs在(鼠)天然免疫系統(tǒng)細胞上激活的效應子功能。
[0003]抗原-抗體復合物與不同免疫細胞表面上的補體(C)或Fe-受體(FcR)的結合引發(fā)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，由此免疫系統(tǒng)的效應細胞活躍地裂解靶(腫瘤)細胞。補體依賴性細胞 毒性(CDC)、巨噬細胞-介導的吞噬作用或細胞溶解(如通過自然殺傷細胞(NK)或粒細胞誘發(fā)的)有助于癌細胞的破壞。
[0004]然而，這些機制的功效在不同的物種中不同，并且甚至在相同物種的不同個體中也是不同的。特別地，盡管小鼠只具有兩個活化性低親和性FcR基因(Fcgr3和Fcgr4)，但人具有四個活化性低親和性FcR基因(FCGR2A、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B)。此外，主要的功能性人FcR——FcyRIIIa (由FCGR3A基因編碼)——存在于NK細胞和巨噬細胞中，而其鼠同系物Fe Y R4在粒細胞和巨噬細胞中被發(fā)現(xiàn)，但在NK細胞中未發(fā)現(xiàn)。人粒細胞表達FCGR3B——在小鼠中沒有對應物的FcR。最后，低親和性小鼠Fcg3在巨噬細胞、NK細胞和粒細胞中表達，而其人同系物FcgR2a只在巨噬細胞和粒細胞中找到，同時人變體FcgR2c專門在NK細胞中表達，但只存在于20%人群中。因此，由于小鼠和人效應細胞中完全不同的FcgR表達，在小鼠異種移植物系統(tǒng)中評價人治療性抗體的生物功效，具有差的預測價值。由于鼠和人效應細胞與機制之間內在的差異，獲得的異種移植物試驗的數(shù)據(jù)對于TherAbs在小鼠中的功效比對于其在人中的功效，更有預測性。
[0005]迄今為止，已經(jīng)研發(fā)了各種更為接近地模擬人效應細胞和-機制的體內模型。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了表達單個人FcgR基因的轉基因小鼠。然而，就細胞分布和表達水平兩者而言，這種小鼠模型只有部分與人類相當?？雌饋恚陀H和性FcgR基因的高保守性基因座(在人類和小鼠中都位于染色體I上)在基因內區(qū)段中包括調控元件，其是各FcgR基因忠實表達所需要的，并且不能與該局部遺傳環(huán)境脫離。
[0006]因此，另一種方法是，通過使用攜帶多達200kb基因組人DNA的轉基因細菌人造染色體(BAC)，在轉基因小鼠中復制人表達模式。然而，在BAC轉基因小鼠中，表達人和內源性小鼠FcgR，導致異常升高的FcgR整體水平。此外，所得到的細胞分布是鼠和人表達模式的總和。
[0007]因此，仍然需要在非人動物中再現(xiàn)人FcgR基因表達的體內模型，以用于提高異種移植物試驗的預測潛能。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明涉及具有人源化低親和性FcgR基因座的新轉基因非人動物。非人動物可以是任何非人動物。優(yōu)選，非人動物是哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物，如大鼠或小鼠，最優(yōu)選，非人動物是小鼠。在優(yōu)選的實施方案中，所述非人動物是小鼠。
[0009]本文中提供了包含人低親和性FcgR基因替代內源性低親和性FcgR基因的轉基因非人動物，包括能夠表達四個功能性人低親和性FcgR基因的非人動物，并且包括不表達內源性低親和性FcgR基因的非人動物。在一個實施方案中，所述四個功能性人低親和性FcgR基因是 FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C 和 FCGR3B。
[0010]在這種新的轉基因非人動物中，所有低親和性FcgR基因被人對應物替代。例如，在一個實施方案中，非人動物是小鼠，其中包括兩個鼠低親和性受體基因(Fcgr4、Fcgr3)的基因座被四個人基因(FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B)替代。由此，建立小鼠系，其能夠表達該組人低親和性FcgR以替代鼠基因，且表達的水平和細胞特異性與人表達相像。該FcgR-人源化小鼠系是用于治療性人抗體的功效預測的理想工具，因為其組合了對人FcgR表達水平和細胞特異性的精確再現(xiàn)，同時避免了鼠FcgR的累積表達和混合的細胞分布。
[0011]在一個實施方案中，在雜合和純合的靶向小鼠兩者中，非人動物在巨噬細胞和粒細胞上表達人FCGR2A，在NK細胞和巨噬細胞上表達人FCGR3A，在粒細胞上表達人FCGR3B。在另一個實施方案中，所述非人動物不表達內源性鼠低親和性Fcgr4和Fcgr3基因。
[0012]由于根據(jù)本發(fā)明的非人動物以類似于人表達的細胞特異性模式表達人低親和性FcgR組以替代內源性基因，因此其可以用作體內模型來確定抗體ADCC功效。因此，在本發(fā)明的第二個方面中，將所述非人試驗動物用作體內模型來確定抗體功效。
[0013]在一個實施方案中，提供了一種用于確定抗體功效的方法，包括將待評價的抗體施用于根據(jù)本發(fā)明的具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物。在一個實施方案中，所述方法包括a)提供具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物，b)將靶腫瘤接種于所述非人動物中，并且允許其生長，c)施用待評價的抗體。通過抗體消除腫瘤的能力或它們阻滯腫瘤生長的能力，確定抗體的功效。優(yōu)選，所述腫瘤是人腫瘤。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是靶向腫瘤細胞表面抗原的人或人源化抗體。
[0014]術語“替代”包括:將DNA序列放入非人動物的細胞的基因組中，以使得非人動物基因組內的序列被置換為人序列。
[0015]術語“FcgR”包括Fe，例如IgG免疫球蛋白的Fe部分，的受體。FcgR基因包括在細胞表面上表達、充當配體-結合結構域、并且可以與FcR Y -鏈的同型二聚體或FcR Y -鏈和α-鏈的雜二聚體締合的α鏈。存在幾種不同的FcgR基因，并且根據(jù)結合免疫復合物中的IgG的優(yōu)先性，它們可以分成低親和性和高親和性類型。人低親和性FcgR基因包括FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、FCGR3B和FCGR2B，并且，這些基因的大部分中的天然產(chǎn)生的遺傳差異或多態(tài)性已經(jīng)在患有自體免疫疾病的人患者中進行了描述。
[0016]如本文中所用的術語“人源化低親和性FcgR基因座”涉及:編碼低親和性內源性FcgR基因的非人動物基因組的部分已經(jīng)被編碼人FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B基因和鄰近非編碼區(qū)的序列替代。
[0017]如本文中所用的術語“內源性低親和性FcgR基因”是指，非人動物的基因組中天然存在的低親和性FcgR基因。例如，鼠的內源性低親和性FcgR基因是FcgR3和FcgR4。
[0018]如本文中所用的術語“野生型”是指，具有內源性低親和性FcgR基因并且沒有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物。
[0019]如本文中所用的術語“抗體的功效”是指，細胞中的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的程度。ADCC通過免疫系統(tǒng)的效應細胞介導靶細胞的裂解。因此，可以通過抗體消除靶細胞的能力或其阻止靶細胞生長的能力來確定抗體的功效。優(yōu)選，所述靶細胞是腫瘤細胞。
[0020]待評價的抗體包括，但不限于，靶向腫瘤細胞表位的抗體。
[0021]施用待評價抗體的方法包括，但不限于，口服施用和非腸道施用(例如，靜脈內施用、腹膜內施用和鼻內施用)?？梢詫⒋u價抗體結合藥物學上可接受的常規(guī)賦形劑(如，載體和稀釋劑)或添加劑一起施用。治療性抗體的施用常常伴隨急性輸注反應，如皮疹(skinrush)、惡心、類過敏性反應和細胞因子釋放綜合癥。這些不良反應中的大部分涉及輸注的抗體與效應細胞(如，巨噬細胞、NK細胞和嗜中性粒細胞)上的FcgR的相互作用。因此，本文中提供的非人動物可以用作體內模型以評價由抗體第一次輸注在人體中引起的急性不良反應。
[0022] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明提供的具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物的后代，其可以通過與相同或另一種基因型育種而獲得。優(yōu)選，通過與相同基因型進行育種來獲得后代。本發(fā)明的再一個目的是所述后代作為體內模型用于確定抗體功效的用途。本發(fā)明的再一個目的是所述小鼠的用途，用作體內模型用于評價由第一次輸注治療性抗體導致的、由不同效應細胞上的FcgR介導的急性輸注反應。在一個實施方案中，提供了一種用于評價治療性抗體的潛在安全性風險的方法，其包括將治療性抗體施用于本發(fā)明的非人動物或其后代，并且評價是否產(chǎn)生了急性輸注反應?？梢酝ㄟ^評價類過敏反應或細胞因子釋放綜合癥，測量急性輸注反應。
[0023]此外，本發(fā)明涉及源自如上所述的具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物或其后代的細胞系或原代細胞培養(yǎng)物。
[0024]此外，本發(fā)明還提供了源自如上所述的具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物或其后代的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物。
[0025]本發(fā)明還提供了源自如上所述的具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物或其后代的組織或細胞提取物。
[0026]在本發(fā)明的另一個實施方案中，將上述源自具有人源化低親和性FcgR基因座的非人動物或其后代的細胞系或原代細胞培養(yǎng)物、組織或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織或細胞提取物用作確定抗體功效的體內模型。
[0027]如本文中所述的“非人動物”是指不是人的任何動物。優(yōu)選，非人動物是哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物，如大鼠或小鼠，最優(yōu)選，非人動物是小鼠。
[0028]附圖簡述
[0029]圖1:RMGR方法的圖示，該方法導致兩個鼠低親和性FcgR基因Fcgr4和Fcgr3(上線)被置于BAC靶向構建體中的四個人低親和性FcgR基因FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B (中線)替代。下線描繪了獲自Cre-介導的重組的、突變的“人源化”等位基因。
[0030]圖2: (A)圖示鼠低親和性Fcgr基因座，其中通過在所示的LoxP和Lox511元件(有色三角形)處Cre-輔助的重組，54kb長的區(qū)域被含有完整人低親和性FcR基因組的160kb人DNA替代。在檢測PCR試驗中所用的寡核苷酸的位置由短箭頭來表示，箭頭指向為寡核苷酸的相應取向。(B)顯示在1%瓊脂糖凝膠上分離的DNA片段，所述DNA片段為在所示PCR試驗中從各單個鼠活檢樣本擴增的片段(5’端:~5kb ;3’端:1.2kb)。Tm表示突變小鼠，wt表示野生型小鼠；M,標記DNA。
[0031]圖3:(A)圖示FCGR-人源化基因座，其中指出用于各人FCGR基因的PCR擴增的引物位置，這些基因同如圖2中所示、但使用了縮寫名。分別使用引物對1+2、3+4、5+6和7+8來擴增編碼FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C和FCGR3B的基因。垂直箭頭指示SalI限制性切割的位置。(B)瓊脂糖凝膠顯示從活檢樣本DNA擴增的DNA片段，所述活檢樣本DNA獲自就替代突變而言的雜合小鼠。使用特異性引物來擴增人基因FCGR2A (2A:12.9kb)、FCGR3A (3A:
9.6kb)、FCGR2C (2C:18.5kb)和 FCGR3B (3B:9.6kb)。X 和 IV 表示所用的 DNA 分子量標記(以kb計)(Roche Diagnostics)。(C)通過Sail消化測試了由3A和3B PCR特異性引物擴增的兩個9.6PCR片段的特異性:盡管3A片段被SalI斷裂成Skb和1.65kb片段，但從FCGR3B基因(3B)擴增的9.6kb PCR片段抵抗SalI消化，由此證明了擴增的片段對應于兩個不同的基因。
[0032]圖4:(A)用所示抗體染色后，使用FACS Canto裝置，通過FACS分析，監(jiān)控了基因打靶(gene-targeted)的人FCGR2A/3A/2C/3B雜合小鼠和野生型小鼠的外周血細胞中人FCGR3A (CD16)的表達:在F4/80+單核細胞、NKl.1+自然殺傷細胞(兩者都在淋巴門控(lymphoid gating)內)和Gr-1+粒細胞(在骨髓門控(myeloid gating)內檢測)中清楚地檢測到了表達。(B)如(A)中的基因打靶的人FCGR2A/3A/2C/3B雜合小鼠和野生型小鼠的外周血細胞中人FCGR2A (⑶32)的表達:在F4/80+單核細胞和Gr-1+粒細胞中表達是明顯的，但在NKl.1+天然殺傷細胞中不存在表達，與針對人⑶32預期的一樣。
[0033]圖5: (A)用所示抗體染色后，使用FACS Canto裝置，通過FACS分析，監(jiān)控了基因打靶(gene-targeted)的人FCGR2A/3A/2C/3B純合小鼠和野生型小鼠的外周血細胞中人FCGR3A (⑶16)的表達:在F4/80+單核細胞、NKl.1+自然殺傷細胞(兩者都在淋巴門控內)和Gr-1+粒細胞(在骨髓門控內檢測)中清楚地檢測到了表達。(B)如(A)中的基因打靶的人FCGR2A/3A/2C/3B純合小鼠和野生型小鼠的外周血細胞中人FCGR2A (⑶32)的表達:在F4/80+單核細胞和Gr-1+粒細胞中表達是明顯的，但在NKl.1+天然殺傷細胞中不存在表達，與針對人⑶32預期的一 樣。
[0034]圖6: (A)顯示了基因打靶的人FCGR2A/3A/2C/3B純合小鼠的外周血中所示細胞群內帶有表面人Fe YRIII或Fe YRII的細胞的量。圖示了，如在F4/80+單核細胞、NKl.1+自然殺傷細胞(兩者都在淋巴門控內)和Gr-1+粒細胞(在骨髓門控內)中檢測的，與野生型小鼠(灰線)相比，純合基因打靶小鼠(黑線)中人Fe Y R陽性細胞的數(shù)量。
[0035]表1
[0036]
【權利要求】
1.一種包含人源化低親和性FcgR基因座的非人轉基因動物。
2.權利要求1的非人動物，其中內源性低親和性FcgR基因完全被人低親和性FcgR基因替代。
3.權利要求1或2的非人動物，其中非人動物是哺乳動物。
4.權利要求3的非人動物，其中非人動物是嚙齒動物。
5.權利要求4的非人動物，其中非人動物是小鼠。
6.權利要求1至5的非人動物的后代，其通過與相同或另一種基因型的動物育種獲得。
7.源自權利要求1至5的非人動物或權利要求6的后代的細胞系或原代細胞培養(yǎng)物。
8.源自權利要求1至5的非人動物或權利要求6的后代的組織或器官外植體或其培養(yǎng)物。
9.權利要求1至5任一項的非人動物、權利要求6的后代、權利要求7的細胞系或原代細胞培養(yǎng)物、或權利要求8的組織或器官外植體用于確定抗體功效的用途。
10.一種用于確定抗體功效的方法，包括將腫瘤細胞或腫瘤接種至權利要求1至5任一項的非人動物或權利要求6的后代中，和將抗體施用于所述非人動物或其后代。
11.一種用于評價治療性抗體的潛在安全性風險的方法，包括將治療性抗體施用于權利要求I至5任一項的非人動物或權利要求6的后代，和評價是否產(chǎn)生任何急性輸注反應。
12.基本上如本說明書中所述的非人動物、用途和方法。
【文檔編號】C07K14/705GK103906842SQ201280053302
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年10月29日 優(yōu)先權日:2011年11月1日
【發(fā)明者】D·布羅伊斯泰特, C·格德斯, A·伊格萊希亞斯, P·烏馬納 申請人:羅切格利卡特公司