通過拮抗il-6受體抑制腫瘤生長的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于抑制或減弱對象中的腫瘤生長的方法，通過向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法用于抑制對象中的抗VEGF抗性腫瘤的生長。IL-6拮抗劑可以是例如特異性結(jié)合IL-6R的抗體。IL-6拮抗劑可以與VEGF拮抗劑和/或EGFR拮抗劑組合施用。
【專利說明】通過拮抗IL-6受體抑制腫瘤生長的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于抑制或減弱對象中的腫瘤生長或增殖的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及這樣的方法，所述方法包括向具有腫瘤的對象施用白介素_6(IL-6)拮抗劑。
[0002]背景
[0003]血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的拮抗劑已經(jīng)在多個實驗和臨床設(shè)計中表現(xiàn)出有效抑制腫瘤生長。VEGF拮抗劑通過靶向腫瘤血管來產(chǎn)生其治療效果。然而，已經(jīng)觀察到在某些情況下腫瘤可以發(fā)展出對于抗VEGF活性劑的抗性。因此，本領(lǐng)域需要新的用于治療腫瘤的治療方法，包括抑制已發(fā)展出對于抗VEGF療法的抗性的腫瘤的生長的方法。
[0004]白介素-6(IL_6)是在多種癌癥類型中表達的促炎性細胞因子。臨床研究顯示，增加的血清IL-6水平與更差的患者結(jié)果相關(guān)。升高的IL-6表達可以是由原癌信號傳遞通路激活導(dǎo)致的，和/或是慢性炎癥的結(jié)果，后者與癌癥發(fā)展相關(guān)。IL-6信號通過其異源二聚受體IL-6R/gpl30來激活JAK/STAT和Ras信號傳遞通路。特別的是，IL-6強烈激活STAT3，后者表現(xiàn)出促進腫瘤細胞增殖、侵入和存活。在若干種臨床前期模型中，用針對IL-6或IL-6R的單克隆抗體抑制IL-6信號傳遞表現(xiàn)出抑制腫瘤生長，提示IL-6通路是有吸引力的癌癥治療靶。然而，尚未描述過IL-6水平與抗VEGF抗性之間的相關(guān)性，或使用IL-6拮抗劑治療抗VEGF抗性腫瘤。
[0005]發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明至少部分地基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即，抗VEGF抗性腫瘤表達升高的IL-6水平，并且當(dāng)IL-6的拮抗作用(例如，通過使用抗IL-6R抗體)與抗VEGF療法組合時，能夠克服腫瘤的抗VEGF抗性，因而提供了針對之前被視為不響應(yīng)VEGF拮抗作用的腫瘤的強大的抗腫瘤活性。
[0007]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于抑制或減弱對象中的抗VEGF抗性腫瘤生長的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明這一方面的某些實施方案，提供了癌癥治療的方法，所述方法包括:(i)測量來自對象的腫瘤活組織檢查中的IL-6/STAT3信號傳遞水平；(ii)如果腫瘤活組織檢查表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞，則向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法還包括向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑和VEGF拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了包含至少一種IL-6拮抗劑和至少一種VEGF拮抗劑的組合物。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于增強IL-6拮抗劑的抗腫瘤活性的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法包括向具有腫瘤的對象施用至少一種額外的抗腫瘤劑與IL-6拮抗劑的組合。額外的抗腫瘤劑可以是例如VEGF拮抗劑、EGFR拮抗劑或其組合。
[0009]本發(fā)明的拮抗劑分子可以是例如抗原特異性結(jié)合蛋白，包括特異性結(jié)合例如IL-6、IL-6R、VEGF, VEGFRl、VEGFR2、EGFR、EGFRvII1、ErbB2、ErbB3 和 / 或 ErbB4 的抗原特異性結(jié)合蛋白。本發(fā)明的抗原特異性結(jié)合蛋白包括抗體及其抗原結(jié)合片段?？乖禺愋越Y(jié)合蛋白還包括融合多肽，所述融合多肽包含一個或多個受體分子的配體結(jié)合部分。在某些示例性的實施方案中，IL-6拮抗劑是特異性結(jié)合IL-6R的抗體，VEGF拮抗劑是結(jié)合VEGF的融合分子，其包含VEGFRl、VEGFR2的VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多聚化的結(jié)構(gòu)域(VEGF-Trap)，并且EGFR拮抗劑是特異性結(jié)合EGFR(ErbBl/HERl)的抗體，或特異性結(jié)合ErbB3的抗體，或特異性結(jié)合ErbB4的抗體。然而，其他的拮抗劑也可用于本發(fā)明上下文中，如本文別處所述的。
[0010]鑒于之后詳細的說明書，本發(fā)明的其他實施方案是顯而易見的。
附圖簡介
[0011]圖1顯示了對培養(yǎng)的A549、Calu3和Dul45腫瘤細胞進行Western印跡的結(jié)果，以評估在用10 μ g/ml人Fe對照蛋白(第I道)、10 μ g/ml抗IL-6R mAbl (第2道)、10ng/mlIL-6 加 10 μ g/ml hFc (第 3 道)或 10ng/ml IL-6 加 10 μ g/ml 抗 IL-6R mAbl (第 4 道)處理后，細胞內(nèi)的磷酸化-STAT3和總STAT3的水平。
[0012]圖2，A圖顯示了對從培養(yǎng)的A431-P或A431-V2細胞中收集的條件化培養(yǎng)基實施ELISA的結(jié)果，以測量IL-6的濃度。
[0013]圖2，B圖顯示了對用hFc對照蛋白(10 μ g/ml)或抗IL-6R mAbl (10 μ g/ml)處理的A431-P或A431-V2細胞實施的Western印跡的結(jié)果，以測量磷酸化-STAT3的水平(相對于肌動蛋白對照)。
[0014]發(fā)明詳述
[0015]在描述本發(fā)明前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的特定方法和實驗條件，因為此類方法和條件是可變的。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅僅是出于描述特定實施方案的目的，而并非意在限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求的限制。
[0016]除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文中使用的，術(shù)語“約”當(dāng)用于指特別陳述的數(shù)值時，意味著所述數(shù)值可自所陳述的值變化不超過1%。例如，如本文中使用的，表述方式“約100”包括99和101，以及兩者之間的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0017]雖然可以使用與本文所述的方法和材料相似或等價的任何方法和材料來實踐本發(fā)明，但優(yōu)選的方法和材料描述如下。
[0018]用于抑制或減弱腫瘤生長的方法
[0019]本發(fā)明提供了用于抑制或減弱對象中的腫瘤生長的方法。本發(fā)明包括向具有腫瘤的對象施用IL-6拮抗劑。IL-6拮抗劑可以與一種或多種額外的治療劑組合施用?？梢耘c根據(jù)本發(fā)明方法的IL-6拮抗劑組合施用的示例性的治療劑包括，例如，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的拮抗劑和/或表皮生長因子受體(EGFR)的拮抗劑(本文定義的)。本文其他地方描述了可以與根據(jù)本發(fā)明方法的IL-6拮抗劑組合施用的治療劑的其他例子。
[0020]本發(fā)明的方法可用于治療腦和腦膜、口咽部、肺和支氣管樹、胃腸道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚和附屬器、結(jié)締組織、脾、免疫系統(tǒng)、成血細胞和骨髓、肝和尿道、和特殊的感覺器官如眼中產(chǎn)生的原發(fā)性的和/或轉(zhuǎn)移的腫瘤。根據(jù)本發(fā)明方法可治療的具體癌癥包括，例如，腎細胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌、結(jié)腸直腸癌、惡性間皮細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌和黑色素瘤。
[0021]在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療對象中的抗VEGF抗性腫瘤。如本文中使用的，“抗VEGF抗 性腫瘤”意指不應(yīng)答或僅部分應(yīng)答使用抗VEGF活性劑(如抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體或任何其他VEGF特異性結(jié)合蛋白(包括例如本文定義的VEGF_trap))的治療的腫瘤。例如，抗VEGF抗性腫瘤可以是例如這樣的腫瘤，當(dāng)接觸通常能夠抑制或減弱至少一種腫瘤類型的生長的一定量的VEGF拮抗劑時，所述腫瘤在體外或體內(nèi)(例如，在細胞培養(yǎng)物中或移植到動物體內(nèi))繼續(xù)生長和/或增殖?？筕EGF抗性腫瘤可以是源自最初應(yīng)答抗VEGF療法的腫瘤細胞的腫瘤，但通過選擇、突變或適應(yīng)，已獲得了對一種或多種抗VEGF活性劑的抗性。
[0022]使用本發(fā)明的方法可治療的對象包括診斷患有癌癥，或鑒別具有腫瘤的任何對象。在某些實施方案中，對象是已被診斷或鑒別為具有至少部分地抵抗于抗VEGF治療的腫瘤的患者。用于診斷具有抗VEGF抗性腫瘤的患者的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且可使用常規(guī)的診斷方法實踐。
[0023]如本文實施例所示，抗VEGF治療抗性的腫瘤細胞表現(xiàn)出表達比親代非抗性腫瘤細胞更高水平的IL-6和磷酸化-STAT3。因此，本發(fā)明還包括癌癥治療的方法，包括(i)測量對象中(例如，在從對象獲得的血清樣品、組織樣品、腫瘤活組織檢查等中)的IL-6/STAT3信號傳遞水平；(ii)如果對象(或從中獲得的樣品/活組織檢查)表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞，則向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，表述方式“增加的IL-6/STAT-3信號傳遞”意指在腫瘤活組織檢查中測量到的IL-6的量和/或磷酸化-STAT3的量比在對于抗VEGF療法敏感的(即，非抗性)腫瘤中高至少3x(例如，4x、5x、6x、7x或更高)。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，“增加的IL-6/STAT-3信號傳遞”意指在自對象采集的樣品中的磷酸化-STAT3與不變的對照蛋白的比例(例如，P-STAT3/肌動蛋白比例)大于約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、
5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或更高。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，“增加的IL-6/STAT-3信號傳遞”意指在自對象采集的腫瘤樣品中的IL-6濃度大于約50pg/ml、55pg/ml、60pg/ml、65pg/ml、70pg/ml、75pg/ml、80pg/ml、85pg/ml、90pg/ml、95pg/ml、lOOpg/ml、IlOpg/ml、120pg/ml、130pg/ml、140pg/ml、150pg/ml、160pg/ml、170pg/ml、180pg/ml、190pg/ml>200pg/ml 或更高?？梢允褂美鏦estern印跡、ELISA或任何其他本領(lǐng)域已知的免疫化學(xué)方法測量IL-6和磷酸化-STAT3的水平。
[0025]類似的，本發(fā)明還包括用于確定具有腫瘤的患者是否具有抗VEGF抗性腫瘤的方法。根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法包括測量來自患者的樣品(例如腫瘤活組織檢查)中的IL-6/STAT3信號傳遞的水平，其中樣品中“增加的IL-6/STAT3信號傳遞”(如上文定義的表述方式)鑒別了具有抗VEGF抗性腫瘤的對象。由于本發(fā)明人已證實抗VEGF抗性腫瘤是對IL-6拮抗作用敏感的，在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法還包括向患者施用IL-6拮抗劑和/或VEGF拮抗劑。
[0026]拮抗劑
[0027]本發(fā)明包括這樣的方法，所述方法包括向有需要的對象施用IL-6拮抗劑、VEGF拮抗劑、EGFR拮抗劑和/或其組合。如本文中使用的，“IL-6拮抗劑”是與IL-6結(jié)合或相互作用，且在體外或體內(nèi)抑制IL-6的正常生物學(xué)信號傳遞功能的任何活性劑。術(shù)語“IL-6拮抗劑”還包括IL-6受體的拮抗劑(“IL-6R”，即“IL-6R拮抗劑)。IL-6R拮抗劑可以是與IL-6R結(jié)合或相互作用，且在體外或體內(nèi)抑制IL-6R的正常生物學(xué)信號傳遞功能的任何活性劑。
[0028]VEGF拮抗劑可以是與VEGF或VEGF受體(VEGFR1，也被稱為Fltl ;或VEGFR2，也被稱為Flkl或KDR)結(jié)合或相互作用的任何活性劑。
[0029]EGFR拮抗劑可以是與表皮生長因子受體結(jié)合或相互作用，且在體外或體內(nèi)抑制受體的正常生物學(xué)信號傳遞功能的任何活性劑。如本文中使用的，表述方式“EGFR拮抗劑”包括表皮生長因子受體家族的任何一個或多個成員的拮抗劑。例如，EGFR拮抗劑可以是EGFR(也被稱為ErbBl或HER1)的拮抗劑、EGFR變體(如EGFRvIII)的拮抗劑、ErbB2 (也被稱為HER2或Neu)的拮抗劑、ErbB3 (也被稱為HER3)的拮抗劑和/或ErbB4 (也被稱為HER4)的拮抗劑。
[0030]IL-6、IL-6R、VEGF, VEGF受體和EGFR的拮抗劑包括小分子拮抗劑，以及抗原特異性結(jié)合蛋白，如本文別處所述。
[0031]抗原特異性結(jié)合蛋白
[0032]可用于本發(fā)明方法中的拮抗劑包括抗原特異性結(jié)合蛋白。例如，本發(fā)明包括這樣的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯锰禺愋越Y(jié)合白介素-6 (IL-6)或IL-6受體(IL-6R)的抗原特異性結(jié)合蛋白。本發(fā)明還包括這樣的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯锰禺愋越Y(jié)合血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、或VEGF受體(VEGFR)的抗原特異性結(jié)合蛋白，或特異性結(jié)合表皮生長因子受體(EGFR、EGFRvII1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4)的抗原特異性結(jié)合蛋白。
[0033]如本文中使用的，表述方式“抗原特異性結(jié)合蛋白”意指包含至少一個特異性結(jié)合特定抗原的結(jié)構(gòu)域的蛋 白質(zhì)。抗原特異性結(jié)合蛋白的示例性類別包括抗體、抗體的抗原結(jié)合部分、與特定抗原特異性相互作用的肽(例如，肽體(P印tibodies))、與特定抗原特異性相互作用的受體分子，和包含與特定抗原特異性結(jié)合的受體的配體結(jié)合部分的蛋白質(zhì)。
[0034]如本文中使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”等意指抗原特異性結(jié)合蛋白或抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域與特定抗原形成復(fù)合物，其特征是解離常數(shù)(Kd)為500pM或更小，和/或在普通測試條件下不結(jié)合其他不相關(guān)的抗原?！安幌嚓P(guān)的抗原”是彼此具有低于75%氨基酸同一性的蛋白質(zhì)、肽或多肽。用于確定兩個分子是否彼此特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，包括例如平衡透析、表面等離子體共振等。例如，本發(fā)明上下文中使用的抗原特異性結(jié)合蛋白或抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合特定抗原(例如，IL-6、IL-6R、VEGF、VEGFR和/或EGFR)的分子或其部分，其具有小于約500pM、小于約400pM、小于約300pM、小于約200pM、小于約ΙΟΟρΜ、小于約90pM、小于約80pM、小于約70pM、小于約60pM、小于約50pM、小于約40pM、小于約30pM、小于約20pM、小于約ΙΟρΜ、小于約5pM、小于約4pM、小于約2pM、小于約ΙρΜ、小于約0.5pM、小于約0.2pM、小于約0.1pM或小于約0.05pM的KD，如等離子體共振測定法中測量的。
[0035]如本文中使用的，當(dāng)在表面等離子體共振測定法中在25°C測試與不相關(guān)抗原的結(jié)合時，如果蛋白質(zhì)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出大于1000pM的KD，或者在這類測定法或其等價形式中未能表現(xiàn)出任何結(jié)合，則抗原特異性結(jié)合蛋白或抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域“不結(jié)合”不相關(guān)抗原。
[0036]如本文中使用的，術(shù)語“表面等離子體共振”指允許通過檢測生物傳感器基質(zhì)中的蛋白質(zhì)濃度的改變，分析實時相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAcore?系統(tǒng)(BiacoreLife Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)。
[0037]如本文中使用的，術(shù)語“KD”意指特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(例如，抗體-抗原相互作用)的平衡解離常數(shù)。除非另外指出，本文公開的Kd值指通過表面等離子體共振測定法在25°C確定的Kd值。
[0038]抗體和抗體的抗原結(jié)合片段
[0039]如上所述，抗原特異性結(jié)合蛋白可以包含特異性結(jié)合特定抗原的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段(例如，抗IL-6抗體、抗IL-6R抗體、抗VEGF抗體、抗VEGFR抗體和/或抗EGFR抗體，或其抗原結(jié)合片段)，或由上述抗體或抗體的抗原結(jié)合片段組成。
[0040]如本文中使用的，術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四條多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的2條重鏈⑶和2條輕鏈(L)，及其多聚體(例如IgM)。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域:Ch1、Ch2和Ch3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR或\)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含I個結(jié)構(gòu)域(Ql)。V1^P'區(qū)可以進一步細分為被稱為互補決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，中間散布有更保守的、被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個VdP'由3個CDR和4個FR構(gòu)成，按下列順序從氨基端至羧基端排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā)明的不同實施方案中，抗體(或其抗原結(jié)合片段)的FR可以與人種系序列相同，或者可以是天然或人為修飾的。可以基于對2個或多個CDR的并排分析，定義氨基酸共有序列。
[0041]如本文中使用的，術(shù)語“抗體”還包括完整抗體分子的抗原結(jié)合片段。如本文中使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”、抗體的“抗原結(jié)合片段”等包括任何天然存在的、可酶促獲得的、合成的或遺傳改造的多肽或糖蛋白，所述多肽或糖蛋白特異性地結(jié)合抗原，形成復(fù)合物?？贵w的抗原結(jié)合片段可以源自例如完整的抗體分子，使用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如蛋白水解消化或涉及操作和表達編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域、任選恒定結(jié)構(gòu)域的DNA的重組遺傳改造技術(shù)。這類DNA是已知的和/或可方便獲得自，例如商業(yè)來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫)、或者可以是合成的。DNA可以進行測序，化學(xué)操作或使用分子生物學(xué)技術(shù)進行操作，例如將一個或多個可變結(jié)構(gòu)域和/或恒定結(jié)構(gòu)域排列成合適的構(gòu)象，或?qū)朊艽a子、生成半胱氨酸殘基、修飾、添加或刪除氨基酸等。
[0042]抗原結(jié)合片段的非限制性例子包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)單鏈Fv(scFv)分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模擬抗體超變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單位(例如，分離的互補決定區(qū)(CDR)，如CDR3肽)，或限制性的FR3-CDR3-FR4肽。其他改造的分子，如結(jié)構(gòu)域特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu)域缺失的抗體、嵌合抗體、移植⑶R的抗體、二價體(diabody)、三價體(triabody)、四價體(tetrabody)、微體(minibody)、納米抗體(例如，單價納米抗體、二價納米抗體等)、小模塊免疫藥劑(SMIP)和鯊魚可變IgNAR結(jié)構(gòu)域，也涵蓋在本文使用的表述方式“抗原結(jié)合片段”中。
[0043]抗體的抗原結(jié)合片段通常將包含至少一個可變結(jié)構(gòu)域?？勺兘Y(jié)構(gòu)域可以具有任何大小或氨基酸組成，并一般包含至少一個CDR，所述CDR與一個或多個框架序列相鄰或符合一個或多個框架序列的讀框。在具有與' 結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)的Vh結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段中，Vh和\結(jié)構(gòu)域可以位于相對彼此合適的任何排列方式中。例如，可變區(qū)可以是二聚化的并含有Vh-Vh、Vh-'或二聚體?？蛇x的，抗體的抗原結(jié)合片段可含有單體的Vh或\結(jié)構(gòu)域。
[0044] 在某些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合片段可含有與至少一個恒定結(jié)構(gòu)域共價連接的至少一個可變結(jié)構(gòu)域?？梢娪诒景l(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段中的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的非限制性的示例構(gòu)象包括:(i) Vh-ChI ； (ii)VH-CH2 ； (iii)VH-CH3 ； (iv) VH-CH1-CH2 ；(v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii) Vh-Cl ； (viii) Vl-ChI ； (ix)VL-CH2 ； (x)VL-CH3 ； (xi)VL-CH1-CH2 ；(xii)VL-CHl-CH2-CH3 ；(xiii)VL-CH2-CH3 ;和(xiv) Vl-Clo 在可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的任何構(gòu)象中，包括任何上述示例性構(gòu)象，可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域可以直接彼此連接或者可以通過完整的或部分的鉸鏈區(qū)或接頭區(qū)連接。鉸鏈區(qū)可以由至少2個(例如，5、
10、15、20、40、60或更多個)氨基酸組成，所述氨基酸導(dǎo)致在單個多肽分子的相鄰可變和/或恒定結(jié)構(gòu)域之間的柔性或半柔性的連接。此外，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段可包含彼此和/或與一個或多個單體Vh或\結(jié)構(gòu)域(例如通過二硫鍵)非共價關(guān)聯(lián)的上文列舉的任何可變和恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
[0045]本發(fā)明的分子可包含人抗體和/或重組人抗體，或其片段，或由人抗體和/或重組人抗體，或其片段組成。如本文中使用的，術(shù)語“人抗體”包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。然而，人抗體也可包括例如在CDR中，特別是CDR3中的不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變，或通過體內(nèi)的體細胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，如本文中使用的，術(shù)語“人抗體”并非意在包括這樣的抗體，其中源自另一種哺乳動物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人框架序列上。
[0046]本發(fā)明的分 子可包含重組人抗體或其抗原結(jié)合片段，或由重組人抗體或其抗原結(jié)合片段組成。如本文中使用的，術(shù)語“重組人抗體”意在包括通過重組手段制備、表達、生成或分離的所有人抗體，如使用轉(zhuǎn)染到宿主細胞(下文將進一步描述)中的重組表達載體表達的抗體，從重組的、組合的人抗體文庫(下文將進一步描述)中分離的抗體，從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中分離的抗體(參見例如，Taylor等人，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通過任何其他涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制備、表達、生成或分離的抗體。這類重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，對地這類重組人抗體進行了體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動物時，進行體內(nèi)的體細胞誘變)，因而重組抗體的％和'區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列雖然源自人種系Vh和\序列且與其相關(guān)，但可以不天然地存在于體內(nèi)的人抗體種系庫中。
[0047]抗IL-6R抗體及其抗原結(jié)合片段
[0048]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的方法包括向?qū)ο笫┯每笽L-6R抗體或其抗原結(jié)合片段。如本文中使用的，術(shù)語“白介素-6受體”、“ IL-6R”等意在指特異性結(jié)合白介素-6 (IL-6)的人細胞因子受體。人IL-6R的胞外結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO:1所述氨基酸序列。抗IL-6R抗體提及在例如美國專利號 5，795，695 ;5，817，790 ;6，410，691 ;6，670，373 和 7，582，298中。任何上述出版物提及和/或描述的任何抗IL-6R抗體，或其抗原結(jié)合片段都可用于本發(fā)明的上下文中?？捎糜诒景l(fā)明的上下文中的非限制性的示例性抗IL-6R抗體是這樣的抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有SEQ ID N0:2/3的HCVR/LCVR氨基酸對的重鏈和輕鏈CDR。例如，抗IL-6R抗體可以是抗體或其抗原結(jié)合片段，包含分別具有SEQ ID N0:4、5和6的氨基酸序列的重鏈CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3);和分別具有SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
[0049]VEGF 拮抗劑[0050]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的方法包括向?qū)ο笫┯肰EGF拮抗劑。如本文中使用的，表述方式“VEGF拮抗劑”意指任何阻斷、降低或干擾VEGF的正常生物學(xué)活性的分子。VEGF拮抗劑包括干擾VEGF與天然的VEGF受體之間的相互作用的分子，例如，與VEGF或VEGF受體結(jié)合和阻止或者阻礙VEGF與VEGF受體之間的相互作用的分子。特定的示例性VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體和基于VEGF受體的嵌合分子(在本文中也被稱為 “VEGF-Trap”)。
[0051]基于VEGF受體的嵌合分子包括嵌合多肽，所述嵌合多肽包含兩個或多個VEGF受體如VEGFRl (也被稱為Fltl)和/或VEGFR2 (也被稱為Flkl或KDR)的免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域，并且還可以含有多聚化結(jié)構(gòu)域(例如，協(xié)助兩個或多個嵌合多肽多聚化【例如二聚化】的Fe結(jié)構(gòu)域)。示例性的基于VEGF受體的嵌合分子是被稱為VEGFR1R2-FC Δ Cl (a)的分子，其由SEQ ID NO: 10的核酸序列編碼。VEGFR1R2-FC Λ Cl (a)包含3種組分:(I)包含SEQ ID NO: 11的第27至129位氨基酸的VEGFRl組分；⑵包含SEQ ID NO: 11的第130至231位氨基酸的VEGFR2組分；和(3)包含SEQ ID NO: 11的第232至457位氨基酸的多聚化組分(Fe Λ Cl (a)) (SEQ ID NO: 11的C末端氨基酸[即，K458]可以包括或不包括在本發(fā)明方法使用的VEGF拮抗劑中；參見例如美國專利7，396，664)。SEQ ID NO: 11的第1-26位氨基酸是信號序列。
[0052]組合療法
[0053]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的方法包括向?qū)ο笫┯门c一種或多種額外的治療劑(如VEGF拮抗劑和/或EGFR拮抗劑)組合的IL-6拮抗劑。如本文中使用的，表述方式“與……組合”意指額外的治療劑在IL-6拮抗劑之前、之后或共同施用。例如，當(dāng)在IL-6拮抗劑“之前”施用時，可以在施用IL-6拮抗劑之前約72小時、約60小時、約48小時、約36小時、約24小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約2小時、約I小時、約30分鐘、約15分鐘或約10分鐘施用額外的治療劑。當(dāng)在IL-6拮抗劑“之后”施用時，可以在施用IL-6拮抗劑之后約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約I小時、約2小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時施用額外的治療劑。與IL-6拮抗劑“共同”施用意指在施用IL-6拮抗劑少于5分鐘內(nèi)(之前、之后或同時)，以獨立的劑量形式向?qū)ο笫┯妙~外的治療劑，或作為包含額外的治療劑和IL-6拮抗劑的單一組合的劑量制劑(例如，包含抗IL-6R抗體+VEGFTrap的單一制劑；或包含抗IL-6R抗體+抗EGFR抗體的單一制劑；或包含抗IL-6R抗體+抗ErbB3抗體的單一制劑；等)向?qū)ο笫┯妙~外的治療劑。
[0054]藥物組合物和施用方法
[0055]本發(fā)明包括包含IL-6拮抗劑的藥物組合物。本發(fā)明還包括包含IL-6拮抗劑和第二活性組分(如VEGF拮抗劑和/或EGFR拮抗劑)的藥物組合物。例如，本發(fā)明包括包含抗IL-6抗體和VEGF-Trap分子的藥物組合物；本發(fā)明還包括包含抗IL-6R抗體和抗EGFR抗體的藥物組合物。本發(fā)明的范圍內(nèi)還涵蓋了包括向患者施用這類藥物組合物的治療方法。
[0056] 用合適的載體、賦形劑和其他活性劑配制本發(fā)明的藥物組合物，所述活性劑提供了合適的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等。多種恰當(dāng)?shù)闹苿┛梢娪诶鏡emington’s PharmaceuticalSciences, Mack Publishing Company, Easton, PA中。合適的制劑包括例如粉末、糊劑、軟膏、膠凍劑、蠟、油、脂類、含脂(陽離子型或陰離子型)的囊泡(如LIPOFECTIN?)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油和油包水型乳劑、乳劑聚乙二醇(carbowax)(多種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠劑，和含有聚乙二醇的半固體混合物。額外的合適的制劑還描述在 Powell 等人〃Compendium of excipients for parenteral formulations〃PDA(1998) JPharm Sci Techno 152:238-311 中。
[0057]多種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如囊封在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中、能夠表達突變體病毒的重組細胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見例如Wu等人，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。施用方法包括但不限于皮膚內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。可以通過任何常規(guī)途徑施用組合物，例如通過灌注或丸劑注射，通過表皮或粘膜皮膚內(nèi)層吸收(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)，并且可以與其他生物學(xué)活性劑共同施用。
[0058]可以用標(biāo)準(zhǔn)的針頭和注射器皮下或靜脈內(nèi)遞送本發(fā)明的藥物組合物。此外，對于皮下遞送，可應(yīng)用筆式遞送裝置方便地遞送本發(fā)明的藥物組合物。這類筆式遞送裝置可以是可重復(fù)使用的或一次性的?？芍貜?fù)使用的筆式遞送裝置一般利用了含有藥物組合物的可更換藥筒。一旦藥筒內(nèi)的所有藥物組合物都被施用且藥筒變空，則可以方便地丟棄空藥筒，并用含有藥物組合物的新藥筒替換。然后可以重復(fù)使用筆式遞送裝置。在一次性的筆式遞送裝置中，沒有可更換的藥筒。一次性的筆式遞送裝置是用保存在裝置內(nèi)部儲池中的藥物組合物預(yù)裝填的。一旦儲池的藥物組合物排空，則丟棄整個裝置。
[0059]多種可重復(fù)使用的筆式和自動注射器式遞送裝置已用于皮下遞送本發(fā)明的藥物組合物。例子包括但不限于 AUT0PEN?(0wen Mumford, Inc.，Woodstock, UK)、DISETR0NIC?注射筆(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland) > HUMAL0G MIX75/25? 注射筆、HUMAL0G? 注射筆、HUMALIN70/30? 注射筆(Eli Lilly and C0.，Indianapolis, IN)、N0V0PEN? 1、II 和 II I (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), N0V0PEN JUNIOR?(NovoNordisk, Copenhagen, Denmark)、BD? 注身寸筆(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、0ΡΤΙΡΕΝ?、0ΡΤΙΡΕΝ PRO?、OPTIPEN STARLET? 和 0PTICLIK?(sanof1-aventis，F(xiàn)rankfurt，Germany)，舉例而言。可用于皮下遞送本發(fā)明的藥物組合物的一次性筆式遞送裝置的例子包括但不限于 S0L0STAR? 注射筆(sanof1-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)、和 KWIKPEN?(Eli Lilly)、SURECLICK? Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET?(Haselmeier, Stuttgart, Germany)、EPIPEN (Dey, L.P.)和 HUMIRA? 注射筆(AbbottLabs, Abbott Park IL),舉例而言。
[0060]在某些情況下，可以用受控釋放系統(tǒng)遞送本發(fā)明的藥物組合物。在一個實施方案中，可以使用泵(參見 Langer,見上文；Sefton, 1987, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料；參見Medical Applications of ControlledRelease, Langer 和 Wise (編著)，1974，CRC Pres., Boca Raton, Florida。在仍然另一個實施方案中，可以將受控釋放系統(tǒng)放置在組合物的靶附近，因而僅需要全身劑量的一部分(參見例如Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release,見上文，第2卷，第115-138頁)。其他的受控釋放系統(tǒng)在Langer, 1990，Science249:1527-1533的綜述中進行了討論。
[0061]可注射制品可包括用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射、點滴注射等的劑量形式。可以通過已知的方法制備這些可注射制品。例如，通過在常規(guī)用于注射的無菌水性基質(zhì)中或油性基質(zhì)中溶解、懸浮或乳化上述抗體或其鹽，來制備可注射制品。作為用于注射的水性基質(zhì)，有例如生理鹽水、含有葡萄糖和其他佐劑的等滲溶液等，其可與恰當(dāng)?shù)闹軇┙M合使用，例如醇類(例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑【例如，聚山梨醇酯80、HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)】等。作為油性基質(zhì)，使用例如芝麻油、豆油等，其可與助溶劑組合使用，如苯甲酸芐酯、苯甲醇等。如此制備的注射液優(yōu)選裝填在恰當(dāng)?shù)陌碴持小?br> [0062]有利地，將上述用于口腔或不經(jīng)腸道使用的藥物組合物制備成適合活性成分的一次劑量的單位劑量的劑型。這類單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安首瓦)、檢劑等。
[0063]劑量
[0064]可以施用給對象的活性成分(例如，IL-6拮抗劑、VEGF拮抗劑、EGFR拮抗劑等)的量一般是治療有效量。如本文中使用的，詞組“治療有效量”意指當(dāng)施用給具有腫瘤的動物時，相對于陰性對照，導(dǎo)致腫瘤生長或重量減少至少5%的抗原特異性結(jié)合蛋白和/或抗原結(jié)合分子的劑量(參見例如本文的實施例1)。例如，IL-6R特異性結(jié)合蛋白、VEGF特異性結(jié)合蛋白和/或EGFR特異性結(jié)合蛋白的“治療有效量”包括例如這類抗原特異性結(jié)合蛋白的這樣的量，當(dāng)向具有腫瘤的動物施用所述量時，導(dǎo)致腫瘤生長或重量相對于陰性對照治療的動物減少至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、95% 或 100%。
[0065]在本發(fā)明的抗原特異性結(jié)合蛋白的情況下(例如，抗IL-6R抗體、抗EGFR抗體、抗ErbB3抗體和/或VEGF-Tr p分子)，治療有效量可以是從約0.05mg至約600mg ;例如，約 0.05mg、約 0.1mg、約 1.0mg、約 1.5mg、約 2.0mg、約 10mg、約 20mg、約 30mg、約 40mg、約50mg、約 60mg、約 70mg、約 80mg、約 90mg、約 IOOmg、約 I IOmg、約 120mg、約 130mg、約 140mg、約 150mg、約 160mg、約 170mg、約 180mg、約 190mg、約 200mg、約 210mg、約 220mg、約 230mg、約 240mg、約 250mg、約 260mg、約 270mg、約 280mg、約 290mg、約 300mg、約 310mg、約 320mg、約 330mg、約 340mg、約 350mg、約 360mg、約 370mg、約 380mg、約 390mg、約 400mg、約 410mg、約 420mg、約 430mg、約 440mg、約 450mg、約 460mg、約 470mg、約 480mg、約 490mg、約 500mg、約510mg、約 520mg、約 530mg、約 540mg、約 550mg、約 560mg、約 570mg、約 580mg、約 590mg 或約600mg的各種抗原特異性結(jié)合蛋白。例如，根據(jù)其中施用抗IL-6R抗體(例如，本文討論的mAbl)的某些特定實施方案，可以向?qū)ο笫┯脛┝繛?00mg、150mg或200mg的抗體(例如，頻率為每周I次、每兩周I次等)。
[0066]可以用每千克患者體重的抗體毫克數(shù)(即，mg/kg)表示包含在單次劑量中的本發(fā)明的抗原特異性結(jié)合蛋白的量。例如，可以向患者施用劑量為約0.0001至約50mg/kg患者體重(例如 0.5mg/kg、l.0mg/kg、l.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、2lmg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg 等)的本發(fā)明的抗 IL-6R抗體、抗EGFR抗體、抗ErbB3抗體和/或VEGF-Trap分子。根據(jù)某些示例性的實施方案，在特定劑量中，向患者施用的VEGF-Trap分子的量是4mg/kg或6mg/kg。
[0067]活性成分(例如,抗IL-6R抗體、抗EGFR抗體、抗ErbB3抗體和/或VEGF-Trap分子)可以等量存在于本發(fā)明的組合物中，或者可選的，可以0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5或更多倍數(shù)不同于彼此的量存在。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用常規(guī)實驗可以確定，為了產(chǎn)生理想的治療效果，本發(fā)明的組合物中的單個組分所必需的恰當(dāng)?shù)牧俊?br> [0068]施用方案
[0069]根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，可以在定義的時間段內(nèi)，向?qū)ο笫┯枚啻蝿┝康谋景l(fā)明的組合物(例如，包含IL-6拮抗劑、VEGF拮抗劑和/或EGFR拮抗劑的組合物)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括向?qū)ο箜樞蚴┯枚啻蝿┝康谋景l(fā)明的組合物。如本文中使用的，“順序施用”意指在不同的時間點，例如在相隔預(yù)定的間隔(例如，數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月)的不同天向?qū)ο笫┯妹看蝿┝康谋景l(fā)明的組合物。本發(fā)明包括這樣的方法，所述方法包括向患者順序施用初始劑量的本發(fā)明的組合物，隨后施用一次或多次第二劑量的組合物，和任選地隨后施用一次或多次第三劑量的組合物
[0070]術(shù)語“初始劑量”、“第二劑量”和“第三劑量”指施用本發(fā)明組合物的時間順序。因此，“初始劑量”是在治療方案開始時施用的劑量(也被稱為“基線劑量”)第二劑量”是在初始劑量之后施用的劑量；“第三劑量”是在第二劑量之后施用的劑量。初始、第二和第三劑量都可以含有相同量的活性成分，但一般在施用頻率上彼此不同。然而，在某些實施方案中，包含在初始、第二和/或第三劑量中的活性成分的量將隨治療過程彼此不同(例如，恰當(dāng)?shù)卣{(diào)高或調(diào)低)。
[0071]在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，在上一次劑量I至30天(例如，1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多
天)后施用每次第二和/或第三劑量。如本文中使用的，詞組“上一次劑量”意指在多次施用順序中，在施用順序中的下一次劑量之前向?qū)ο笫┯玫谋景l(fā)明組合物的劑量，之間沒有插入劑量。
[0072]根據(jù)本發(fā)明該方面的方法可包括向患者施用任何數(shù)量的第二和/或第三劑量的本發(fā)明組合物。例如，在某些實施方案中，僅向患者施用一次第二劑量。在其他實施方案中，向患者施用兩次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)第二劑量。同樣的，在某些實施方案中，僅向患者施用一次第三劑量。在其他實施方案中，向患者施用兩次或多次(例如，
2、3、4、5、6、7、8或更多次)第三劑量。
[0073]在涉及多次第二劑量的實施方案中，每個第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率施用。例如，可以在上一次劑量I至29天后施用每個第二劑量。類似的，在涉及多次第三劑量的實施方案中，每個第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率施用。例如，可以在上一次劑量I至60天后施用每個第三劑量?？蛇x的，向患者施用第二和/或第三劑量的頻率可以隨治療方案的過程而改變。還可以在臨床檢驗后，由醫(yī)生根據(jù)每個患者的需要在治療過程中調(diào)整施用頻率。
實施例
[0074] 下列實施例的提出是為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于本發(fā)明的方法和組合物如何制備和使用的完整公開和說明，而并非意在限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍。對于所使用的數(shù)值(例如，量、溫度等)，已努力確保其精確性，但也應(yīng)該考慮一些實驗錯誤和偏差。除非另外指出，部分是按重量計的部分，分子量是平均分子量，溫度是按攝氏度計，壓力是大氣壓或接近大氣壓。[0075]實施例1.抗IL-6R單克隆抗體作為單一活性劑和與其他抗腫瘤劑的組合抑制腫瘤異種移植物生長
[0076]治療劑
[0077]該實施例證實了向具有腫瘤的小鼠單獨施用抗IL-6R抗體或與VEGF-Trap、抗EGFR抗體或抗ErbB3抗體組合施用抗IL-6R抗體。該實施例中使用的抗IL-6R抗體在本文中也被稱為“抗IL-6R mAbl”，是包含分別具有SEQ ID N0:4、5和6的氨基酸序列的重鏈CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和分別具有SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗體(即，在美國專利號7，582，298中被稱為VQ8F11-21的抗IL-6R抗體)。用于該實施例中的VEGF-Trap是2個融合多肽的二聚體，每個融合多肽包含:
(I)包含SEQ ID NO: 11的第27至129位氨基酸的VEGFRl組分；(2)包含SEQ ID NO: 11的第130至231位氨基酸的VEGFR2組分；和(3)包含SEQ ID NO: 11的第232至457位氨基酸的多聚化組分(“Fe Λ Cl (a)”)(即，在美國專利號7，396, 664中被稱為VEGFR1R2-Fc Λ Cl (a)的VEGF-Trap)。用于該實施例中的抗EGFR抗體在本文中也被稱為“抗EGFR mAb2”，是針對人EGFR/ErbBl/HERl的胞外結(jié)構(gòu)域生成的完整的人抗體。用于該實施例中的抗ErbB3抗體也被稱為“抗ErbB3mAb3”，是針對ErbB3生成的完整的人抗體(即，在2012年9月21日提交的美國專利申請?zhí)?3/623，885中被稱為H4H1821N的抗體)。
[0078]實驗方法和結(jié)果
[0079]作為初步實驗，用⑴10 μ g/ml人Fe對照蛋白(“hFc”)，(ii) 10 μ g/ml抗IL-6RmAbl, (iii) 10ng/ml IL-6 力卩 10 μ g/ml hFc,或(iv) lOng/ml IL-6 加 10 μ g/ml 抗 IL-6RmAbl處理培養(yǎng)的A549、Calu3和Dul45細胞。向培養(yǎng)的細胞中添加人Fe或抗IL-6R mAbl 16小時，并向hFc或抗IL-6R mAbl預(yù)處理的細胞中添加IL-630分鐘。然后裂解細胞，實施Western印跡，評估磷酸化-STAT3和總STAT3的水平。如圖1所示，所有3個腫瘤細胞系都表現(xiàn)出組成性和IL-6-誘導(dǎo)性的磷酸化-STAT3，其被抗IL-6R mAbl抑制。
[0080]之后，測試抗IL-6R mAbl、VEGF-Trap 或抗 IL-6R mAbl 加 VEGF-Trap 的組合對Dul45人前列腺癌細胞生長的效果。簡而言之，向6-8周齡SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)的側(cè)腹皮下植入5xl06個Dul45細胞(ATCC)。在腫瘤達到~200mm3的平均體積后，將小鼠隨機分入處理組(η = 5只小鼠/組)。向小鼠施用人Fe對照蛋白(25mg/kg)、抗IL-6RmAbl (25mg/kg) >VEGF-Trap (25mg/kg)或抗 IL-6R mAbl 加 VEGF-Trap 的組合(25+25mg/kg)。所有蛋白質(zhì)都通過皮下注射施用，每周2次。在實驗過程中，每周測量腫瘤體積2次(在植入后第35、39、42、46、49、53、56、60、63和67天)。計算每組從治療開始時的平均腫瘤生長。與Fe對照組相比，計算腫瘤生長的百分比減少。結(jié)果概括在表1中。
[0081]表1:SCID小鼠中的Dul45腫瘤異種移植物生長的抑制
[0082]
[0083]
【權(quán)利要求】
1.包含抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，所述藥物組合物用于抑制或減弱對象中的抗VEGF抗性腫瘤的生長。
2.包含抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，所述藥物組合物用于抑制或減弱對象中的腫瘤生長,其中腫瘤表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中抗IL-6R抗體或其抗原特異性結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中HCVR包含SEQ ID NO:2的互補決定區(qū)(CDR)，且其中LCVR包含SEQ ID NO: 3的CDR。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中HCVR包含具有SEQID NO: 4、5和6的氨基酸序列的⑶R ;且其中LCVR包含具有SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的⑶R。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的藥物組合物，還包含EGFR拮抗劑。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中EGFR拮抗劑選自由抗EGFR抗體、抗EGFRvIII抗體、抗ErbB2抗體、抗ErbB3抗體,和抗ErbB4抗體組成的組。
7.權(quán)利要求1至4中任一項的藥物組合物，還包含VEGF拮抗劑。
8.權(quán)利要求7 的藥物組合物，其中VEGF拮抗劑是特異性結(jié)合VEGF的抗原特異性結(jié)合蛋白。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是包含VEGFRl的Ig結(jié)構(gòu)域2、VEGFR2的Ig結(jié)構(gòu)域3，和多聚化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中VEGFRl的Ig結(jié)構(gòu)域2包含SEQID NO: 11的第27至129位氨基酸，VEGFR2的Ig結(jié)構(gòu)域3包含SEQ ID NO: 11的第130至231位氨基酸，并且多聚化結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 11的第232至457位氨基酸。
11.用于抑制或減弱對象中的抗VEGF抗性腫瘤的生長的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑和VEGF拮抗劑。
12.癌癥治療方法，包括:(i)測量來自對象的腫瘤活組織檢查中的IL-6/STAT3信號傳遞的水平；和(?)如果腫瘤活組織檢查表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞，則向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的方法，還包括向?qū)ο笫┯肰EGF拮抗劑。
14.權(quán)利要求11或12的方法，其中IL-6拮抗劑是特異性結(jié)合IL-6的抗原特異性結(jié)合蛋白。
15.權(quán)利要求14的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗IL-6抗體或其抗原結(jié)合片段。
16.權(quán)利要求11或12的方法，其中IL-6拮抗劑是特異性結(jié)合IL-6受體(IL-6R)的抗原特異性結(jié)合蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段。
18.權(quán)利要求17的方法，其中抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中HCVR包含SEQ ID NO: 2的互補決定區(qū)(⑶R)，且其中LCVR包含SEQ ID NO:3 的 CDR0
19.權(quán)利要求18的方法，其中HCVR包含具有SEQID N0:4、5和6的氨基酸序列的⑶R ;且其中LCVR包含具有SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的⑶R。
20.權(quán)利要求11或13的方法，其中VEGF拮抗劑是特異性結(jié)合VEGF受體的抗原特異性結(jié)合蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中VEGF受體是VEGFRl或VEGFR2。
22.權(quán)利要求21的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗VEGFRl抗體或其抗原結(jié)合片段。
23.權(quán)利要求21的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗VEGFR2抗體或其抗原結(jié)合片段。
24.權(quán)利要求11或13的方法，其中VEGF拮抗劑是特異性結(jié)合VEGF的抗原特異性結(jié)合蛋白。
25.權(quán)利要求24的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗VEGF抗體。
26.權(quán)利要求24的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是包含VEGFRl的Ig結(jié)構(gòu)域2、VEGFR2的Ig結(jié)構(gòu)域3，和多聚化結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
27.權(quán)利要求24的方法，其中VEGFRl的Ig結(jié)構(gòu)域2包含SEQID NO: 11的第27至129位氨基酸，VEGFR2的Ig結(jié)構(gòu)域3包含SEQ ID NO: 11的第130至231位氨基酸，并且多聚化結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 11的第232至457位氨基酸。
28.用于抑制或減弱對象中的抗VEGF抗性腫瘤的生長的方法，方法包括向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑和VEGF拮抗劑； 其中IL-6拮抗劑是抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的重鏈互補決定區(qū)(HCDR);且包含含有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的輕鏈互補決定區(qū)；和 其中VEGF拮抗劑是包含SEQ ID NO: 11的第27至457位氨基酸的VEGF特異性結(jié)合蛋白。
29.用于確定具有腫瘤的患者是否具有抗VEGF抗性腫瘤的方法，方法包括測量來自對象的腫瘤活組織檢查中的IL-6/STAT3信號傳遞的水平，其中腫瘤活組織檢查中增加的IL-6/STAT3信號傳遞將患者鑒別為具有抗VEGF抗性腫瘤。
30.權(quán)利要求29的方法，所述方法還包括如果發(fā)現(xiàn)腫瘤活組織檢查表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞，則向患者施用IL-6拮抗劑。
31.權(quán)利要求29的方法，所述方法還包括如果發(fā)現(xiàn)腫瘤活組織檢查表現(xiàn)出增加的IL-6/STAT3信號傳遞，則向患者施用IL-6拮抗劑和VEGF拮抗劑。
32.用于抑制或減弱對象中的腫瘤生長的方法，方法包括向?qū)ο笫┯肐L-6拮抗劑和EGFR拮抗劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中IL-6拮抗劑是特異性結(jié)合IL-6的抗原特異性結(jié)合蛋白。
34.權(quán)利要求33的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗IL-6抗體或其抗原結(jié)合片段。
35.權(quán)利要求32的方法，其中IL-6拮抗劑是特異性結(jié)合IL-6受體(IL-6R)的抗原特異性結(jié)合蛋白。
36.權(quán)利要求35的方法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段。
37.權(quán)利要求36的方法，其中抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中HCVR包含SEQ ID NO: 2的互補決定區(qū)(⑶R)，且其中LCVR包含SEQ ID NO:3 的 CDR0
38.權(quán)利要求37的方法，其中HCVR包含具有SEQID N0:4、5和6的氨基酸序列的⑶R ;且其中LCVR包含具有SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的⑶R。
39.權(quán)利要求32的方法，其中EGFR拮抗劑選自由抗EGFR抗體、抗EGFRvIII抗體、抗ErbB2抗體、抗ErbB3抗體,和抗ErbB4抗體組成的組。
40.權(quán)利要求39的方 法，其中抗原特異性結(jié)合蛋白是抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段。
【文檔編號】C07K16/32GK103930443SQ201280055109
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月10日
【發(fā)明者】L·張 申請人:瑞澤恩制藥公司