作為對(duì)抗hiv-1的疫苗的嵌合非整合型慢病毒基因組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的核酸，所述非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括：不整合至人類細(xì)胞中的山羊慢病毒、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)或另一逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’和3’的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)；以及另一逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因。本發(fā)明還涉及含有這種核酸的載體，含有所述載體或所述核酸的免疫原性組合物或疫苗組合物，以及它們?cè)谥委熀?或預(yù)防由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的感染或由病原體誘導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】作為對(duì)抗HIV-1的疫苗的嵌合非整合型慢病毒基因組
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的目標(biāo)是核酸，該核酸包括非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，所述非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括:不整合至人類細(xì)胞中的山羊慢病毒(山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒 VAEC (或在英語(yǔ)中為 Caprine Arthritis Encephalitis Virus, CAEV))或另一逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’和3’末端重復(fù)序列(STR、或在英語(yǔ)中為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Long Terminal Repeat,LTR));以及，另一逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因。本發(fā)明還涉及含有這種核酸的載體，含有所述載體或所述核酸的免疫原性組合物或疫苗組合物，以及它們?cè)谥委熀?或預(yù)防由逆轉(zhuǎn)錄病毒所引起的感染或由病原體所誘導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，開(kāi)發(fā)對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的有效疫苗是全球重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。最近，已經(jīng)基于具有能夠在被接種的宿主中表達(dá)免疫原性蛋白的載體的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)了疫苗。在細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增后，這些疫苗的載體經(jīng)純化并且被直接注射至需要接種的宿主中。因此，通過(guò)宿主細(xì)胞控制載體，表達(dá)免疫原性蛋白并且將該免疫原性蛋白提供到I類和II類主要組織相容性復(fù)合體的分子中，從而能夠引起對(duì)抗這些免疫原性蛋白的免疫應(yīng)答。憑借逆轉(zhuǎn)錄病毒的疫苗載體進(jìn)行的首次接種測(cè)試給出了如下的可能性:示出在雞群中進(jìn)行對(duì)抗勞斯氏肉瘤病毒(Chebloune 等人.,1991, JVirol, 65, 5374-5380)、新城疫病毒(Cosset, Bouquet 等人，1991,Virologyl85,862-866)以及隨后的流感病毒(Robinson,Hunt et Webster, 1993,Vaccine, 11 (9):9 57-960)的免疫是可能的。
[0003]該接種途徑對(duì)于控制人類免疫缺陷病毒(HIV)是尤其感興趣的?，F(xiàn)今，獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)仍然是全球性公共衛(wèi)生難題，有大于三千三百萬(wàn)的已感染個(gè)體，并且有大于2百萬(wàn)的個(gè)體死亡以及每天有大約3百萬(wàn)的新感染者。非洲是受感染最多的大陸，但是感染正在亞洲和一些東歐國(guó)家中快速增長(zhǎng)，該現(xiàn)象無(wú)疑是由于缺少早期檢測(cè)的手段并且缺乏對(duì)感染的治療。此外，由于經(jīng)濟(jì)性質(zhì)的限制，發(fā)展中國(guó)家中的許多感染HIV的患者并不能得到任何治療，因此促使了感染的大規(guī)模傳播。因此，AIDS對(duì)經(jīng)濟(jì)的影響在接下來(lái)的幾年里無(wú)疑是非常重要的。在歐洲，AIDS依然是最重大的一種傳播病癥，在西歐和中歐有約I百萬(wàn)人患有AIDS并且每年有超過(guò)20000的新感染者；而且，在東歐有約1.5百萬(wàn)人患有AIDS并且每年有超過(guò)200000的新感染者。因此，終止該感染的預(yù)防性疫苗的開(kāi)發(fā)保有優(yōu)先權(quán)。
[0004]盡管直至今天已經(jīng)做出了許多努力，但是還沒(méi)有為人類提供對(duì)抗由HIV引起的感染或?qū)褂稍摬《菊T導(dǎo)的發(fā)病的保護(hù)的安全且令人滿意的疫苗。不過(guò)，進(jìn)行的很多研究已經(jīng)給出了如下的可能性:為了理解迄今為止所使用的疫苗策略的失敗，而積累寶貴知識(shí)；以及，界定誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗的所需特性，該免疫應(yīng)答給出對(duì)抗導(dǎo)致AIDS的慢病毒的保護(hù)。
[0005]疫苗應(yīng)當(dāng)明顯誘導(dǎo)⑶8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，⑶8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答與在原發(fā)感染期間控制病毒相關(guān)，并且該CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的存在已被證實(shí)對(duì)于控制已感染的非人靈長(zhǎng)類中的病毒載量來(lái)說(shuō)是必不可少的(Jin等人.，1999，JExpMed，189:991-998)。此外，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)存在于長(zhǎng)期非漸進(jìn)性病人(LTNP)中(Rinaldo等人.，1995，JVirol,69:5838-5842)，或者進(jìn)一步存在于暴露于HIV但未感染HIV的受試者中(Makedonas等人，2002，AIDS, 16:1595-1602)。這些因素和其它因素顯示出這種應(yīng)答在控制病毒復(fù)制和/或預(yù)防該疾病中的重要性。
[0006]此外，疫苗應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)⑶4+T細(xì)胞的應(yīng)答，⑶4+T細(xì)胞對(duì)于刺激和維持基于抗-HIV的CD8+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答來(lái)說(shuō)是必不可少的(Kalams等人.，1999，JVirol, 73 =6715-6720)。CD4+T細(xì)胞對(duì)于建立和維持基于由B淋巴細(xì)胞(BL)產(chǎn)生的抗體的應(yīng)答來(lái)說(shuō)也是必不可少的。因此，示出被SIV感染的且BL貧乏的獼猴控制它們的病毒載量不如猴子控制的那么好(Johnson等人，2003，JVirol，77:375-381)?？紤]到這些結(jié)果以及前述的結(jié)果，似乎必須是對(duì)抗HIV的疫苗應(yīng)當(dāng)刺激免疫系統(tǒng)的B和T應(yīng)答。
[0007]在許多經(jīng)測(cè)試的疫苗策略中，發(fā)現(xiàn)了涉及被稱為減毒的慢病毒的那些疫苗策略。因此，示出后者可能可再現(xiàn)地誘導(dǎo)對(duì)抗同源和異源測(cè)試病毒的最好保護(hù)(Yankee等人，2009, Virology, 383:103-111 ；Genesca, McChesney 和 Miller,2009, JIntern Med,265:67-77 !Reynolds 等人.,2008, JExp Med, 205:2537-2550 ;Amara 等人.,2005, J Virol, 79:15356-15367 ;Whitne y 和 Ruprecht，2004，CurrOpin InfectDis, 17:17-26)。然而，由于它們不可逆地整合至宿主的基因組中以及與前病毒潛伏有關(guān)的反復(fù)感染的可能性，這些病毒在一些成人和在新生兒中是致病的(Desrosiers, 1994, AIDS Res Hum Retroviruses, 10:331-332 ；Hofmann-Lehmann 等人.,2003, AIDS, 17:157-166 ；Baba 等人.，1999，Nat Med,5:194-203 ;Baba 等人.，1995，Science, 267:1820-1825 ；Yankee 等人.,2009, Virol, 383:103-111)。由于倫理和安全性原因，這些減毒的慢病毒不能就這樣用在人類中。
[0008]對(duì)此，基于病毒載體的DNA疫苗從未與人類或動(dòng)物中的病癥發(fā)展相關(guān)聯(lián)，并且因此是更加安全的。然而，在猴子中經(jīng)過(guò)測(cè)試的載體證實(shí)不能保護(hù)動(dòng)物免受實(shí)驗(yàn)性的感染(Liu 等人.，2006，Virology, 351:444-454 ；Singh 等人.，2005，JVirol, 79:3419-3428)。
[0009]因此，需要新型的疫苗接種的載體，該載體使慢病毒抗原能夠在質(zhì)量和數(shù)量上均以較高水平進(jìn)行表達(dá)，目的在于誘導(dǎo)對(duì)抗致病病毒的防護(hù)性應(yīng)答。
[0010]先前，發(fā)明人已經(jīng)描述了包括全病毒基因組的傳染性病毒基因組，其中完整病毒基因組含有CAEV的RTL以及另一逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一個(gè)或兩個(gè)基因(Bouzar等人，2007，Virology, 364 (2):269-280 ；Bouzar 等人.，2004，Virology, 326 (I):47-56 ；Bouzar等人.，2003, Virology, 309 (I):41-52 ;Yuhai 等人.，2009, Retrovirology, 6 (2):22)。這些基因組被用于研究由人類和猴子的高致病性逆轉(zhuǎn)錄病毒所誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(VAEC(或在英語(yǔ)中為CaprineArthritis Encephalitis Virus, CAEV))的末端重復(fù)序列(RTS,或在英語(yǔ)中為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Long Terminal Repeat, LTR))的使用給出了如下的可能性:改進(jìn)接種的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的表達(dá)，且改進(jìn)對(duì)抗致病逆轉(zhuǎn)錄病毒的保護(hù)性應(yīng)答的誘導(dǎo)，同時(shí)避免它們整合至宿主細(xì)胞中。發(fā)明人尤其證實(shí)了山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)能夠使與其相關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行組成型表達(dá)，并且該長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)不依賴于CAEV的病毒tat基因(更具體地，不依賴于CAEV的病毒tat基因的蛋白)來(lái)表達(dá)病毒基因組(該長(zhǎng)末端重復(fù)序列融合在其中)的基因，因此使得病毒抗原能夠強(qiáng)表達(dá)。因此，發(fā)明人開(kāi)發(fā)了 SIV 和 HIV 型(VIH,或在英文中為 HIV(Human Immunodeficiency Virus))靈長(zhǎng)類的慢病毒與CAEV之間的嵌合基因組，該嵌合基因組具有不會(huì)整合且非復(fù)制的性質(zhì)，同時(shí)能夠進(jìn)行表達(dá)存在于基因組中的HIV和SIV的所有抗原的復(fù)制循環(huán)。發(fā)明人證實(shí)了在靈長(zhǎng)類細(xì)胞(HEK293)中的這些基因組的轉(zhuǎn)染使得所存在的基因的所有蛋白都能進(jìn)行表達(dá)，并且這些蛋白被組裝成病毒顆粒。該病毒顆粒能夠在靶細(xì)胞中進(jìn)行單一的感染循環(huán)(即，假循環(huán))，且不會(huì)使病毒基因組整合至這些靶細(xì)胞中。N0D/SCID小鼠(經(jīng)人類單核細(xì)胞人源化的)的免疫證實(shí)了存在對(duì)抗病毒抗原的強(qiáng)烈特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0012]定義
[0013]“核酸”是指單四級(jí)(monoquatemary)形式和雙-四級(jí)(b1-quaternary)螺旋形式的核苷(腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脫氧核苷(脫氧腺嘌呤核苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧尿嘧啶核苷或脫氧胞嘧啶核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物的形式。雙-四級(jí)螺旋DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA是可能的。術(shù)語(yǔ)核酸，并且尤其是DNA分子或RNA分子僅僅是指分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不限于具體的三級(jí)形式。因此，該術(shù)語(yǔ)包括尤其是在線狀或環(huán)狀DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙-四級(jí)DNA。當(dāng)提及具體的雙-四級(jí)DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，本文根據(jù)常規(guī)知識(shí)來(lái)描述序列，僅給出了沿DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即，與mRNA具有同源序列的鏈)的5'至3'方向上的序列。
[0014]在本發(fā)明的上下文中，“包括非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的核酸”是指包括在至少兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的 cis位中起作用的核酸序列，所述核酸不能整合宿主細(xì)胞的基因組。所述核酸包括在第一逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’和3’中的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，以及第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一個(gè)病毒基因。
[0015]“逆轉(zhuǎn)錄病毒”是指其基因組由RNA分子組成并且包括逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒，即，逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)的成員。逆轉(zhuǎn)錄病毒被分為三種類型:腫瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。腫瘤病毒尤其由以下種類組成:小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、勞斯氏肉瘤病毒(VSR,或在英文中為RSV (Rous Sarcoma Virus))或梅森-菲舍猴病毒(simianMason-Pfizer virus)。慢病毒由以下種類組成:1型人類免疫缺陷病毒(VIH-1,或在英文中為 HIV-1 (humanimmunodeficiency virus of typel))、2 型人類免疫缺陷病毒(VIH-2,或在英文中為HIV-2 (human immunodeficiency virus oftype2))、猿猴免疫缺損病毒(VIS,或在英文中為SIV(simian immunodeficiency virus))、貓免疫缺陷病毒(VIF,或在英文中為FIV(feline immunodeficiency virus))、牛免疫缺陷病毒(VIB,或在英文中為BIV (bovine immunodeficiency virus))、綿羊髓鞘脫落病毒(VMV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)或馬傳染性貧血病毒(VAIE,或在英文中為EIAV (Equine Infectious AnaemiaVirus))。泡沫病毒可為HFV。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-1時(shí)，它可以屬于任何血清組，例如屬于血清組M(血清型A-D、F-H、J、K)、血清組O、血清組N或血清組P。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-2時(shí)，它可以屬于任何血清組，例如屬于血清組A或血清組B。
[0016]“病毒基因”是指在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中存在的基因。在本發(fā)明的上下文中，病毒基因可為gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因或env基因。
[0017]表示“組特異性抗原”的基因“gag”編碼前體多蛋白gag，該前體多蛋白gag被剪切以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)蛋白，該基本結(jié)構(gòu)蛋白為衣殼蛋白，核殼體的蛋白和基質(zhì)蛋白。例如，HIV的蛋白gag為衣殼蛋白p24的前體、核殼體蛋白p6和p7的前體以及基質(zhì)蛋白P17的前體。作為非限制性實(shí)施例，基因gag為HIV-1的基因gag(NCBI基因識(shí)別號(hào)(IDN0.) 155030，于 2011 年 8 月 20 日更新)、HIV_2 的基因 gag (NCBI 基因 ID N0.14900001，于2011年8月27日更新)、SIV的基因gag(NCBI基因ID N0.956108，于2011年8月27日更新)或FIV的基因gag(NCBI基因ID N0.1489988，于2011年8月20日更新)。
[0018]基因“pol”編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶。作為非限制性實(shí)施例，基因pol為HIV-1的基因pol(NCBI基因ID N0.155348，于2011年8月27日更新)、HIV-2的基因pol(NCBI 基因 ID N0.1490001，于 2011 年 8 月 27 日更新)、FIV 的基因 pol (NCBI 基因 IDN0.1489989，于 2011 年 8 月 27 日更新)或 SIV 的基因 pol (NCBI 基因 ID N0.956107，于2011年8月20日更新)。
[0019]基因“vif”或“病毒感染因子”編碼產(chǎn)生感染性病毒顆粒所需的蛋白。作為非限制性實(shí)施例，基因vif為HIV-1的基因vif(NCBI基因ID N0.155459，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因vif (NCBI基因ID N0.1724712，于2010年I月21日更新)、FIV的基因vif (NCBI基因ID N0.1724709，于2010年2月7日更新)或SIV的基因vif (NCBI基因IDN0.1490005,于 2010 年 I 月 21 日更新)。
[0020]基因“vpr”編碼病毒蛋白R(shí)，病毒蛋白R(shí)在將細(xì)胞周期停止在G2期、在調(diào)控預(yù)整合復(fù)合體從細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞核的運(yùn)輸、病毒復(fù)制中起到重要作用。作為非限制性實(shí)施例，基因vpr為HIV-1的基因vpr(NCBI基因ID N0.155807，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因vpr (NCBI基因ID N0.1724718，于2010年I月21日更新)或SIV的基因vpr (NCBI基因ID N0.956112，于 2011 年 I 月 15 日更新)。
[0021]基因“vpx”編碼涉及基因vpr的病毒蛋白X。作為非限制性實(shí)施例，基因vpx為HIV-2的基因vpx(NCBI基因ID N0.1724714，于2011年3月19日更新)或SIV的基因vpx (NCBI 基因 ID N0.1490006，于 2011 年 7 月 16 日更新)。
[0022]基因“nef”編碼被稱為負(fù)調(diào)控因子的27kDa至25kDa的十八酰化的蛋白，該蛋白在體內(nèi)CD4淋巴細(xì)胞減少中起到關(guān)鍵作用。作為非限制性實(shí)施例，基因nef為HIV-1的基因nef(NCBI基因ID N0.156110，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因nef (NCBI基因ID N0.1724715，于 2011 年 3 月 19 日更新)或 SIV 的基因 nef (NCBI 基因 ID N0.1490008，于2011年7月2日更新)。
[0023]基因“tat”編碼被稱為“轉(zhuǎn)錄反式激活因子”的具有86至101個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白增加逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的轉(zhuǎn)錄率。作為非限制性實(shí)施例，基因tat為HIV-1的基因tat (NCBI 基因 ID N0.155871，于 2011 年 8 月 20 日更新)、HIV_2 的基因 tat (NCBI 基因 IDN0.1724713，于 2010 年 2 月 7 日更新)或 SIV 的基因 tat (NCBI 基因 ID N0.956113，于 2010年2月7日更新)。
[0024] 基因“rev”編碼被稱為“病毒顆粒表達(dá)調(diào)控子”的蛋白，該蛋白使得病毒RNA能夠從細(xì)胞核輸出至細(xì)胞質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，基因rev為HIV-1的基因rev(NCBI基因ID N0.155908，于 2011 年 8 月 7 日更新)、HIV_2 的基因 rev(NCBI 基因 ID N0.1724716，于2011年5月21日更新)或SIV的基因rev(NCBI基因ID N0.1490003,于2011年I月15
日更新)。
[0025]基因“vpu”編碼被稱為“病毒蛋白U”的蛋白，該蛋白涉及病毒出芽以及病毒顆粒釋放的改進(jìn)。作為非限制性實(shí)施例，基因vpu為HIV-1的基因vpu(NCBI基因ID N0.155945，于2011年8月7日更新)或SIV的基因vpu(NCBI基因ID N0.2828723，于2010年I月21
日更新)。
[0026]基因“env”編碼前體蛋白gpl60，該前體蛋白gpl60成熟并且被剪切以產(chǎn)生包膜蛋白gpl20和gp41。作為非限制性實(shí)施例，基因env為HIV-1的基因env(NCBI基因IDN0.155971，于 2011 年 8 月 7 日更新)、HIV_2 的基因 env (NCBI 基因 ID N0.1724717，于 2011年6月18日更新)、FIV的基因env(NCBI基因ID N0.1489987，于2011年6月18日更新)或SIV的基因env (NCBI基因IDN0.1490007，于2011年6月18日更新)。
[0027]從本申請(qǐng)的意義上說(shuō),術(shù)語(yǔ)“包括(comprises) ”或“包括(comprising) ”根據(jù)具體方式來(lái)表示“由...組成(consist in)’’或“由...組成(consisting in)”。
[0028]核酸
[0029]發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列使得與其相關(guān)聯(lián)的基因能夠進(jìn)行組成型表達(dá)，并且該長(zhǎng)末端重復(fù)序列并不依賴于病毒基因tat來(lái)表達(dá)病毒基因組(該長(zhǎng)末端重復(fù)序列融合在其中)的基因，因此使得病毒抗原能夠強(qiáng)表達(dá)。此外，發(fā)明人表明這些LTR的單獨(dú)存在防止了該LTR融合在其中的異源逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的整合。
[0030]因此，本發(fā)明涉及一種包括非整合型嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的核酸，其中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括:
[0031]在第一逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’中和3’中的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒為諸如山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、綿羊髓鞘脫落病毒(VMV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)的慢病毒，或腫瘤病毒或泡沫病毒；以及
[0032]第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒不是所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0033]優(yōu)選地，所使用的LTR序列源自不會(huì)整合“宿主”或“患者”基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述宿主或患者為在其基因組中可整合第二和/或第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主或患者。例如當(dāng)?shù)谝荒孓D(zhuǎn)錄病毒為CAEV時(shí)，所述宿主或患者不是山羊，但可以是人類、猴子、貓或馬；或者當(dāng)?shù)谝荒孓D(zhuǎn)錄病毒為EIAV時(shí)，所述宿主或者患者不是馬，但是可以是人類、猴子、貓或綿羊；或者當(dāng)?shù)谝荒孓D(zhuǎn)錄病毒為VMV時(shí)，所述宿主或患者不是綿羊，但可以是人類、猴子、貓或馬。
[0034]在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，“第一逆轉(zhuǎn)錄病毒”為山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒或CAEV。CAEV為山羊的慢病毒型的逆轉(zhuǎn)錄病毒,該病毒涉及人類免疫缺陷病毒(HIV),但是不在它的宿主中引發(fā)AIDS型的任何病癥。
[0035]“長(zhǎng)末端重復(fù)序列”(英文中為L(zhǎng)TR)是指能夠控制轉(zhuǎn)錄的序列，即，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、用于啟始轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或若干個(gè)信號(hào)、用于終止轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或若干個(gè)信號(hào)、用于聚腺苷化的一個(gè)或若干個(gè)信號(hào)。在本發(fā)明的上下文中，CAEV的LTR包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和用于啟始轉(zhuǎn)錄的信號(hào)，以及用于終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)和聚腺苷化信號(hào)。優(yōu)選地，在CAEV的5’和3’中的LTR是相同的，并且包括序列SEQ ID N0.:3或由序列SEQ ID N0.:3組成。
[0036]在另一實(shí)施方式中，使用綿羊髓鞘脫落病毒(VMV)的LTR或馬科EIAV的慢病毒的LTR。在VMV的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001452.1 (于2008年12月8日更新)的第I~161位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBI NC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第I~161位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在VMV的3’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第9106~9202位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001452.1 (于2008年12月8日更新)的第9106~9202位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在EIAV的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001450 (于2010年3月11日更新)的第61~381位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBI NC_001450(于2010年3月11日更新)的第61~381位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在EIAV的3’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001450(于2010年3月11日更新)的第7269~8289位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBI NC_001450(于2010年3月11日更新)的第7269~8289位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。
[0037]在又一實(shí)施方式中，使用諸如小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)或梅森-菲舍猴病毒的腫瘤病毒的LTR，或諸如HFV的泡沫病毒的LTR。在MLV的5’中的LTR包括在參考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第I~210位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBI NC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第I~210位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在MLV的3’中的LTR包括在參考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第5735~8135位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBI NC_001702.1 (于2011年2月5日更新)的第5735~8135位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在ALV的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_015116.1 (于2011年4月18日更新)的第1~594位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列從^1從:_015116.1(于2011年4月18日更新)的第I~594位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在ALV的3’中的LTR包括在參考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第5338~7489位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第5338~7489位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在RSV的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001407.1 (于2008年12月8日更新)的第22~102位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001407.1(于2008年12月8日更新)的第22~102位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在RSV的3’中的LTR包括在參考序列NCBINC_001407.1 (于2008年12月8日更新)的第9058~9292位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001407.1 (于2008年12月8日更新)的第9058~9292位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在梅森-菲舍猴病毒的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001550.1 (于2008年12月8日更新)的第26~123位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001550.1 (于2008年12月8日更新)的第26~123位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在梅森-菲舍猴病毒的3’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001550.1(于2008年12月8日更新)的第7573~7811位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001550.1 (于2008年12月8日更新)的第7573~7811位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在HFV的5’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001364.1 (于2009年4月22日更新)的第I~1760位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001364.1 (于2009年4月22日更新)的第I~1760位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。在HFV的3’中的LTR包括在參考序列NCBI NC_001364.1 (于2009年4月22日更新)的第11487~13246位中發(fā)現(xiàn)的序列，或者由在參考序列NCBINC_001364.1 (于2009年4月22日更新)的第11487~13246位中發(fā)現(xiàn)的序列組成。
[0038]發(fā)明人已經(jīng)表明了山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)并不依賴于病毒基因tat來(lái)表達(dá)病毒基因組(該長(zhǎng)末端重復(fù)序列融合在其中)的基因，有利地，根據(jù)本發(fā)明的核酸不含有所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒的tat基因。
[0039]在本發(fā)明的上下文中，“第二逆轉(zhuǎn)錄病毒”與第一逆轉(zhuǎn)錄病毒不同。第二逆轉(zhuǎn)錄病毒可為腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。因此，例如，當(dāng)使用CAEV的LTR時(shí),第二逆轉(zhuǎn)錄病毒不是CAEV。優(yōu)選地,第二逆轉(zhuǎn)錄病毒為:腫瘤病毒，諸如小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)或梅森-菲舍猴病毒；慢病毒，諸如1-型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、2_型人類免疫缺陷病毒HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV);或泡沫病毒，諸如HFV。更優(yōu)選地，第二逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-1、HIV-2、SIV 或FIV。
[0040]優(yōu)選地，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因選自gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在具體的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少兩種病毒基因、三種病毒基因(例如基因gag、pol、vif,或基因gag、pol、env)、四種病毒基因、五種病毒基因、六種病毒基因、七種病毒基因、八種病毒基因、九種病毒基因、十種病毒基因。有利地，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因tat。仍然更優(yōu)選地，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的一套基因gag、pol、vif、vpx、vpr、nef、tat、rev、vpu和 env o
[0041]在尤其優(yōu)選的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括SIV、HIV-1、HIV-2或FIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在又一優(yōu)選的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括SIV的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID N0.:4)、HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID N0:2)、HIV_2的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQID NO:5)或FIV的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID NO:6)，或由SIV的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID N0.:4)、HIV_1的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID NO:2)、HIV-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID NO:5)或FIV的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列(SEQ ID NO:6)組成。
[0042]在圖1至圖4中分別示意性地示出了 SIV、HIV-1、HIV_2和FIV的嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒
基因組。
[0043]在具體的實(shí)施方式中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)一步包括第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒不是第一逆轉(zhuǎn)錄病毒，也即，與所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒不同。因此，例如，當(dāng)使用CAEV的LTR時(shí)，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒不是CAEV。所述“第三逆轉(zhuǎn)錄病毒”可選自如上限定的逆轉(zhuǎn)錄病毒中的一種。
[0044]當(dāng)所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因和第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒與所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒不同。所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒可屬于相同或不同的類型，例如，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒可各自為腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒，或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒可分別為(i)慢病毒和泡沫病毒,或相反地為泡沫病毒和慢病毒； (ii)腫瘤病毒和慢病毒，或相反地為慢病毒和腫瘤病毒；或者(iii)泡沫病毒和腫瘤病毒，或相反地為腫瘤病毒和泡沫病毒。
[0045]優(yōu)先地，當(dāng)所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因和第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒各自為慢病毒，并且優(yōu)選地，所述慢病毒選自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV或EIAV。仍然更優(yōu)選地，第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和第三逆轉(zhuǎn)錄病毒是不同種類、血清組或血清型的慢病毒。因此，例如，當(dāng)所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-1時(shí),所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-2 ;或進(jìn)一步地,當(dāng)所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒為血清組M的HIV-1時(shí)，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒為血清組O的HIV-1 ;或者進(jìn)一步地，當(dāng)所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒為血清組M的HIV-1和血清型I的HIV-1時(shí)，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒為血清組M和血清型B的HIV-1。
[0046]優(yōu)選地，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的所述至少一種病毒基因選自gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在具體的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)一步包括所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少兩種病毒基因、三種病毒基因、四種病毒基因、五種病毒基因、六種病毒基因、七種病毒基因、八種病毒基因、九種病毒基因或十種病毒基因。有利地，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括基因tat。
[0047]仍然更優(yōu)選地，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)一步包括所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的一套基因gag、pol、vifvpx、vpr、nef、tat、rev、vpu和env,即，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括:所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的一套基因gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的一套基因gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
[0048]因此，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可包括:所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的九種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的兩種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的八種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的三種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的七種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的四種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的六種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的五種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的五種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的六種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的四種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的七種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的三種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的八種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的兩種病毒基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的九種病毒基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種病毒基因。因此，在非限制性的實(shí)施例中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可包括:所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、r ev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、r ev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、Vif基因、vpx基因、vpr基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的vpu基因和env基因；或者所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的env基因。
[0049]在尤其優(yōu)選的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
[0050]在仍然更優(yōu)選的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括SIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-1的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，或者相反地包括HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及SIV的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在另一尤其優(yōu)選的方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-2的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，或者相反地包括HIV-2的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-1的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在仍然更優(yōu)選地方面中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括SEQ IDNO:7或由SEQ ID NO:7 組成，圖5中示出了該嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的圖示。
[0051]在具體的實(shí)施方式中，當(dāng)pol基因存在于嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中時(shí)，所述pol基因?yàn)閯h除了編碼整合酶(in)的序列的pol基因。優(yōu)選地，從所述pol基因中刪除序列SEQID NO:8(SIV 的整合酶序歹Ij )、SEQ ID NO:9(HIV-1 的整合酶序列)、SEQ ID NO:10(HIV-2的整合酶序列)或SEQ ID NO: 11 (FIV的整合酶序列)。
[0052]因此，在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:14 或 SEQ ID NO:15，或由序列 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO: 15 組成。
[0053]在圖6至圖10中分別示意性示出了包括SEQ ID NO:USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO:13、SEQ ID N0:14 或 SEQ ID NO: 15，或由序列 SEQ ID NO:U SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:
13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15組成的嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。
[0054]本發(fā)明還涉及一種包括根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體。
[0055]術(shù)語(yǔ)“載體”是指染色體外因子，通過(guò)載體，DNA或RNA序列(即“外源”基因)可被引入宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化宿主并且使得被引入的序列能夠表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄和翻譯)。染色體外因子可為自我復(fù)制序列、噬菌體序列或核苷酸序列，單鏈或雙鏈DNA或RNA，質(zhì)粒，粘粒。載體典型地含有可傳遞劑(transmissible agent)和選擇性標(biāo)記物的DNA,在該可傳遞劑的DNA中可插入外源DNA。將DNA片段插入至另一 DNA片段中的常規(guī)手段涉及酶的使用，該酶被稱為限制酶，在特定位點(diǎn)(核苷酸的特定基團(tuán)，也被稱為限制性位點(diǎn))處剪切DNA。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA被插入DNA載體的一個(gè)或若干個(gè)限制性位點(diǎn)處，并且隨后通過(guò)載體被轉(zhuǎn)送至具有可傳遞劑的DNA的宿主細(xì)胞中。包括添加或插入的DNA的DNA片段或序列(諸如載體)也可被稱為“DNA構(gòu)建體”。載體的常見(jiàn)類型為“質(zhì)?！?，質(zhì)粒通常為獨(dú)立存在的雙鏈DNA分子，通常是細(xì)菌來(lái)源的，可容易地接受額外的(外源)DNA并且可容易地被引入到合適的宿主細(xì)胞中。已經(jīng)描述了用于在不同真核和原核宿主中進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)的大量的載體(包括質(zhì)粒)。在本發(fā)明的上下文中，載體包括選擇性標(biāo)記物(諸如提供對(duì)抗生素的抗性的基因)或根據(jù)本發(fā)明的核酸。優(yōu)選地，所述抗性基因?yàn)樘峁?duì)氨芐西林或卡那霉素的抗性的基因。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或載體可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞或宿主有機(jī)體，即用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。
[0057]術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指以任何方式被選擇的、被修飾的、被轉(zhuǎn)化的、被轉(zhuǎn)染的、被轉(zhuǎn)導(dǎo)的、被培養(yǎng)的、或被使用的或被操作的任何有機(jī)體的任何細(xì)胞，用于通過(guò)該細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生物質(zhì),例如,通過(guò)該細(xì)胞來(lái)表達(dá)基因、DNA序列、蛋白、病毒顆粒。在本發(fā)明的上下文中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括，但并不限于，HEK293細(xì)胞、人類⑶4+T淋巴細(xì)胞系CEMxl74和M8166、人類⑶4+T淋巴細(xì)胞、人類⑶8+T淋巴細(xì)胞、人類血液的單核細(xì)胞。
[0058]根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或載體對(duì)細(xì)胞或宿主有機(jī)體的轉(zhuǎn)化，諸如，通過(guò)轉(zhuǎn)染、電穿孔、微量注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、使用磷酸鈣的沉淀、或使用基因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如，參見(jiàn)Wu等人.，1992，JBiolChem267:963-967 ；ffu 等人.，1988，JBiol Chem263:14621-14624 ；Hartmut 等人.，加拿大專利申請(qǐng)第2，012，311號(hào)，1990年3月15日公布)。
[0059]免疫原性組 合物或疫苗組合物及其應(yīng)用
[0060]根據(jù)本發(fā)明的核酸或載體可用于免疫原性目的或疫苗的目的。
[0061]因此，本發(fā)明還涉及包括根據(jù)本發(fā)明的核酸或載體的免疫原性組合物或疫苗組合物。
[0062]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指預(yù)防性或治療性疫苗。
[0063]免疫原性組合物或疫苗組合物是指可能誘導(dǎo)對(duì)抗上文限定的逆轉(zhuǎn)錄病毒的免疫應(yīng)答的組合物。免疫應(yīng)答是指涉及T淋巴細(xì)胞(例如⑶4+和⑶8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)的應(yīng)答。
[0064]根據(jù)實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物是單價(jià)的，即它能夠?qū)箚我荒孓D(zhuǎn)錄病毒，例如對(duì)抗HIV-1或HIV-2的免疫應(yīng)答。
[0065]根據(jù)另一實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物是多價(jià)的(multivalent)，即，它能夠?qū)谷舾煞N逆轉(zhuǎn)錄病毒的免疫應(yīng)答，例如對(duì)抗HIV-1和HIV-2或若干種病原體的免疫應(yīng)答，例如對(duì)抗HIV-1和VHC(英文中為丙型肝炎病毒(Hepatitis CVirrus7HCV))的免疫應(yīng)答。在該情況下，疫苗載體表達(dá)任一種病原體的抗原。
[0066]根據(jù)另一實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物是多價(jià)的(polyvalent)?？赏ㄟ^(guò)將若干根據(jù)本發(fā)明的單價(jià)免疫原性組合物或疫苗組合物相組合,得到這種免疫原性組合物或疫苗組合物。免疫原性組合物或疫苗組合物可進(jìn)一步包括對(duì)抗另一病毒的至少一種其它的疫苗(即減毒的活病毒、滅活病毒或病毒亞單元)，該另一病毒諸如為性傳播病毒，例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或乳頭瘤病毒。
[0067]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物包括藥學(xué)可接受的載劑。[0068]“藥學(xué)可接受的載劑”是指其中可配制根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物的任何載劑。該載劑包括鹽溶液，諸如磷酸鹽緩沖液。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)給藥方法和途徑以及根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來(lái)選擇稀釋劑或載劑。藥學(xué)可接受的載劑包括但并不限于:離子交換劑，鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，用于遞送自乳化藥物的系統(tǒng)諸如D- α -生育酚聚乙二醇1000琥珀酸，用作藥物劑型的表面活性劑諸如吐溫(Tweens)或其它聚合物遞送基質(zhì)，血清蛋白諸如人血清蛋白，緩沖物質(zhì)諸如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，植物的飽和脂肪酸甘油酯的混合物，水，鹽或電解質(zhì)，諸如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，硅膠，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物以及羊毛脂。環(huán)糊精(諸如A-、B-、和g-環(huán)糊精)，或化學(xué)修飾的衍生物(諸如包括2-和3-羥丙基-b-環(huán)糊精的羥烷基環(huán)糊精，或其它溶解的衍生物)也可有利地用于改進(jìn)根據(jù)本發(fā)明的組合物的遞送。
[0069]根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步含有佐劑。為了該目的，可使用在疫苗領(lǐng)域中常規(guī)使用的任何藥學(xué)可接受的佐劑或佐劑的混合物。作為合適的佐劑的實(shí)例，可提及的是鋁鹽(諸如氫氧化鋁或磷酸鋁)和DC-Chol (DC-膽固醇)。為了該目的，可使用在疫苗領(lǐng)域中常規(guī)使用的任何藥學(xué)可接受的佐劑或佐劑的混合物。作為合適的佐劑的實(shí)例，可提及的是鋁鹽(諸如氫氧化鋁或磷酸鋁)和DC-Chol。
[0070]根據(jù)本發(fā)明的組合物可含有輔助基因，即是表達(dá)如下蛋白的基因:該蛋白通過(guò)增加表達(dá)的病毒蛋白的免疫原性來(lái)起到輔助作用。例如，編碼細(xì)胞因子，諸如白介素(II)[IL-2、IL12、IL-15...或GM-CSF (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)]的基因。這些輔助基因被并入疫苗質(zhì)粒中或作為獨(dú)立的表達(dá)質(zhì)粒而被共注入。
[0071]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的給藥方法。具體地，根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗組合物可 口服給藥、吸入給藥或經(jīng)由腸胃外途徑給藥(尤其是通過(guò)皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、髓內(nèi)注射或肌內(nèi)注射)。當(dāng)使用腸胃外途徑時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗組合物可為包括在安瓿或瓶子中的可注射的溶液和懸浮液的形式。通常，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗組合物與緩沖液、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑相混合來(lái)得到用于腸胃外遞送的形式。根據(jù)已知的技術(shù)，這些混合物隨后被滅菌，并且被包裝成皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、髓內(nèi)注射或肌內(nèi)注射的形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用基于有機(jī)磷酸鹽的緩沖液作為緩沖液。乳化劑的實(shí)例包括甲基纖維素、阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉。穩(wěn)定劑的實(shí)例包括亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉。且防腐劑的實(shí)例包括對(duì)羥基苯甲酸鈉、山梨酸、甲酚和氯甲酚。核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗組合物也可為經(jīng)冷凍干燥的形式。
[0072]疫苗DNA溶液可被直接注射，或也可利用商購(gòu)的電穿孔儀進(jìn)行體內(nèi)電穿孔來(lái)給藥，或者被包裹在脂質(zhì)體或納米粒子中來(lái)給藥，或者通過(guò)使用將疫苗DNA更好地引入到接種的宿主細(xì)胞中的任何體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法來(lái)給藥。
[0073]在其它方面中，本發(fā)明涉及一種根據(jù)本發(fā)明的核酸、一種根據(jù)本發(fā)明的載體和/或一種根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物在預(yù)防和/或治療由逆轉(zhuǎn)錄病毒所引起的感染中的應(yīng)用。
[0074]“預(yù)防(prevent) ”或“預(yù)防(prevention) ”是指抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，即預(yù)防逆轉(zhuǎn)錄病毒引起感染，或預(yù)防逆轉(zhuǎn)錄病毒在已感染的受試者體內(nèi)的傳播或逆轉(zhuǎn)錄病毒從一個(gè)受試者至另一受試者的傳播。
[0075]“治療(treat) ”或“治療(treatment) ”是指限制疾病的嚴(yán)重性，以及預(yù)防復(fù)發(fā)性感染，即，限制潛伏性感染或持續(xù)性感染的再活化，以及找到對(duì)由逆轉(zhuǎn)錄病毒所引起的感染癥狀的進(jìn)行補(bǔ)救的方法。逆轉(zhuǎn)錄病毒為上文所限定的，并且優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒為HIV-1、HIV-2 或 FIV。
[0076]術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”或“宿主”是指人類或非人類的哺乳動(dòng)物，或鳥類。優(yōu)選地，患者為靈長(zhǎng)類、鼠科(小鼠)、貓科(貓)、犬科(狗)、馬科的成員(馬)、鳥、人類(包括女人、男人、成年人和兒童)。
[0077]本申請(qǐng)還涉及一種為有需要的受試者進(jìn)行接種或?qū)τ行枰氖茉囌哌M(jìn)行治療的方法，所述方法包括給予預(yù)防有效量或治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的核酸，根據(jù)本發(fā)明的載體，或根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物。
[0078]“ 預(yù)防有效量或治療有效量”是指核酸的量、載體的量、免疫原性組合物或疫苗組合物的量能夠?qū)Ρ恢委煹氖茉囌弋a(chǎn)生治療或預(yù)防效果。治療效果可為客觀的(即通過(guò)測(cè)試或標(biāo)記物來(lái)測(cè)定)或主觀的(即受試者示出效果的跡象或感受到效果)。有效量可在約0.01至5000 μ g/kg之間變動(dòng)，或者在約0.1至1000 μ g/kg之間變動(dòng)，或者在約I至500μ g/kg之間變動(dòng)。有效量也可根據(jù)給藥途徑，使用或未使用體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法，受試者的大小和重量，以及根據(jù)其它藥劑共使用的可能性而變動(dòng)。
[0079]在本發(fā)明的上下文中，根據(jù)本發(fā)明的核酸或根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物的給藥模式可經(jīng)由靜脈途徑、皮下途徑、皮內(nèi)途徑、髓內(nèi)途徑或肌內(nèi)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0080]參照下面的實(shí)施例，將更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0081]圖1:由序列SEQ ID N0.:2編碼的核酸的圖示。
[0082]圖2:由序列SEQ ID N0.:4編碼的核酸的圖示。
[0083]圖3:由序列SEQ ID N0.:5編碼的核酸的圖示。
[0084]圖4:由序列SEQ ID N0.:6編碼的核酸的圖示。
[0085]圖5:由序列SEQ ID N0.:7編碼的核酸的圖示。
[0086]圖6:由序列SEQ ID N0.:1編碼的核酸的圖示。
[0087]圖1:由序列SEQ ID N0.:12編碼的核酸的圖示。
[0088]圖8:由序列SEQ ID N0.:13編碼的核酸的圖示。
[0089]圖9:由序列SEQ ID N0.:14編碼的核酸的圖示。
[0090]圖10:由序列SEQ ID N0.:15編碼的核酸的圖示。
[0091 ]圖 11 =CAEV 的基因組，質(zhì)粒 pSHIVKU2、pCA-LTR-SHIVKU2IN-的質(zhì)粒和 ρ Δ 4SHIVKU2 的構(gòu)建體的圖示。
[0092]圖12:對(duì)Balb/c小鼠的分泌IFN- Y的T淋巴細(xì)胞數(shù)量的評(píng)定。對(duì)照BALB/c的具有免疫能力的小鼠的脾細(xì)胞和經(jīng)P Δ 4SHIVKU2和pCA-LTR-SHIVKU2IN-免疫的小鼠的脾細(xì)胞，并且用Gag、Env肽和肽Tat+Rev+Nef池進(jìn)行刺激。計(jì)算I百萬(wàn)PBMC的斑點(diǎn)數(shù)量。
[0093]圖13:對(duì)在經(jīng)免疫的NOD/SCID-hu小鼠中的分泌IFN- Y的人類T淋巴細(xì)胞數(shù)量的評(píng)定。通過(guò)人血的單核細(xì)胞進(jìn)行重建，并且用P δ 4SHIVKU2或pCA-LTR-SHIVKU2IN-或pSHIVKU2進(jìn)行免疫的免疫缺陷的小鼠脾細(xì)胞經(jīng)Gag、Env肽和肽池Tat+Rev+Nef進(jìn)行刺激。計(jì)算I百萬(wàn)PBMC的斑點(diǎn)數(shù)并且被標(biāo)準(zhǔn)化至20%。
[0094]圖14:制備載體 Ca-LTR-SHIVku2-1N-的示意圖。
[0095]圖15:載體 CA-LTR-SHIVku2 的圖示。
[0096]圖16:載體 Ca-LTR-SHIVku2-1N-的圖示。
[0097]圖17:制備載體CAL-HIV-1N-的示意圖。
[0098]圖18:載體 CAL-HIV-1N-的圖示。
【具體實(shí)施方式】
[0099]SEQ ID No:1代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括SAEV的LTR和刪除了編碼整合酶的序列的SHIV基因組。[0100]SEQ ID No:2代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和HIV-1的基因組。
[0101]SEQ ID No:3 代表 CAEV 的 LTR 的序列。
[0102]SEQ ID NO:4代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和SIV的基因組。
[0103]SEQ ID NO: 5代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和HIV-2的基因組。
[0104]SEQ ID NO:6代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和FIV的基因組。
[0105]SEQ ID NO:7代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和SHIV的基因組。
[0106]SEQ ID NO:8代表SIV整合酶的序列。
[0107]SEQ ID NO:9代表HIV-1整合酶的序列。
[0108]SEQ ID NO:10代表HIV-2整合酶的序列。
[0109]SEQ ID NO: 11代表FIV整合酶的序列。
[0110]SEQ ID NO:12代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和刪除了編碼整合酶的序列的HIV-1的基因組。
[0111]SEQ ID NO:13代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和刪除了編碼整合酶的序列的HIV-2的基因組。
[0112]SEQ ID NO:14代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和刪除了編碼整合酶的序列的FIV的基因組。
[0113]SEQ ID NO:15代表嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的序列，包括CAEV的LTR和刪除了編碼整合酶的序列的SIV的基因組。
[0114]SEQ ID NO: 16 代表載體 pCA_LTR_SHIVKU2 的序列。
[0115]SEQ ID NO: 17 代表載體 pCA-LTR-SHIVku2-1N-的序列。
[0116]SEQ ID NO: 18 代表載體 CAL-HIV-1N-的序列。
[0117]實(shí)施例[0118]1.材料和方法
[0119]1.L疫苗載體(圖1)
[0120]1.1.1.載體 dCA-LTR-SHIV，和 dca-ltr-shiv，-1n-
[0121]載體CA-LTR-SHIVku2包括類人猿和人類免疫缺陷病毒(SHIV)的基因組，其中刪除了 SIV的LTR并替代為CAEV的LTR。SHIV包括由SIV_mac239其中之一組成的嵌合基因組，其中，刪除了 SIV的tat基因、env基因和rev基因并替代為HIV-1的vpu基因、tat基因、env基因和rev基因。因此，載體具有在CAEV的5’和3’中的LTR的轉(zhuǎn)錄控制下的SIV的vpr基因、vpx基因、gag基因、pol基因、vif基因和nef基因以及HIV-1的tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。將編碼整合酶(in)的序列從pol基因中刪除。未刪除編碼整合酶的序列的疫苗載體pCA-LTR-SHIVKU2由序列SEQ ID NO:16(圖15)組成。刪除了編碼整合酶的序列的載體pCA-LTR-SHIVku2-1N-由SEQ ID NO:17(圖16)組成。
[0122]通過(guò)下列方式得到載體Ca-LTR-SHIVku2-1N-的構(gòu)建體(圖14)。用EcoRl和Narl消化載體SHIV-KU2，并且隨后去除0.8kb的LTR片段。隨后用EcoRl和Narl消化CAEV-pBSCA載體，純化0.5kb的片段LTR。隨后兩個(gè)片段進(jìn)行連接。然后用Stul和Aval消化載體SHIV-1LTRCA，并且隨后去除0.8kb的LTR片段。用引物Stul和Aval擴(kuò)增CAEV的3’中的LTR,用Stul和Aval消化PCR產(chǎn)物，并且純化0.5kb的LTR片段。兩個(gè)片段進(jìn)行連接以生成CAL-SHIVku2。最后，完成在pol基因中用Kpnl和Accl進(jìn)行的消化，以去除314bp的SHIV整合酶基因，從而生成CAL-SHIVku2-1N-。
[0123]1.1.2.載體 DSHIV^ 和 Λ 4SHIV，
[0124]質(zhì)粒PSHIVku2和ρ Λ 4SHIVKU2為用作對(duì)照的質(zhì)粒。它們的構(gòu)建體已經(jīng)在許多出版物中進(jìn)行了描述(Liu ZQ 等人,2006, Ramakrisna Hegde 等人.，2005)。
[0125]1.2疫苗DNA的生產(chǎn)
[0126]1.2.1.細(xì)菌培養(yǎng)
[0127]將含有質(zhì)粒的大腸桿菌K12 (JM109)細(xì)菌放入含有0.05mg/ml卡那霉素的5ml BL培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，隨后在30°C、在150轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下進(jìn)行攪拌的條件下孵育一夜。將來(lái)自預(yù)培養(yǎng)的細(xì)菌懸浮液以1:100000稀釋在BL培養(yǎng)基中，并且隨后將50 μ I的稀釋液涂布在皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中的瓊脂/BL/卡那霉素的表面上，隨后在32°C孵育一夜。將在皮氏培養(yǎng)皿的瓊脂上生長(zhǎng)的分離的克隆播種在5ml的含有0.05mg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基BL中，隨后在30°C、在150rpm下進(jìn)行攪拌的條件下孵育一夜。培養(yǎng)物的一部分(Iml)用于根據(jù)推薦的程序通過(guò)Macherey-Nagel或Qiagen的Min1-prep試劑盒來(lái)快速提取DNA，隨后提取出的DNA在I %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離來(lái)檢測(cè)其質(zhì)量。對(duì)應(yīng)于判斷是滿意的細(xì)菌被用于播種IL培養(yǎng)基，隨后在如上文所述的相同條件下進(jìn)行孵育以分離大量制備的DNA。
[0128]1.2.2.大量制各:質(zhì)粒提取
[0129]通過(guò)離心(400(^,41^, 15min)收獲沉淀物形式的在3(TC、攪拌(150rpm)條件下孵育一夜的細(xì)菌，并且將沉淀物重懸在8ml重懸緩沖液(Tris-HC150mMpH8，EDTAlOmM)。然后，通過(guò)加入8ml堿性裂解緩沖液(Na0H200mM，1% SDS)來(lái)裂解細(xì)胞，以釋放質(zhì)粒DNA。通過(guò)加入8ml中和緩沖液(3M乙酸鉀，pH5.5)來(lái)中和裂解液。隨后混合物在冰中孵育5分鐘，并且在4°C、15，OOOg離心15分鐘。含有DNA的溶液被轉(zhuǎn)移至預(yù)先平衡的柱子中，以保留住質(zhì)粒DNA。用洗滌緩沖液沖洗三次柱子，隨后洗脫DNA，并且用異丙醇進(jìn)行沉淀。通過(guò)離心(30min，15000g，4°C )得到經(jīng)沉淀的DNA沉淀物。然后用2ml70%的乙醇沖洗DNA，并且在4°C、15000g來(lái)離心10min，以去除過(guò)量的雜質(zhì)和鹽，隨后將沉淀物進(jìn)行干燥，并且重懸在合適體積的超純水中。
[0130]隨后，通過(guò)分光光度法在等于260nm的波長(zhǎng)λ處確定DNA溶液的濃度，并且隨后通過(guò)在I %的瓊脂糖凝膠上的電泳遷移來(lái)檢測(cè)質(zhì)粒的質(zhì)量。在用限制酶例如Bam Hl和EcoRl消化之后，在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)質(zhì)粒的大小和質(zhì)粒的完整度。
[0131]1.2.3.通討酶消化來(lái)檢測(cè)質(zhì)粒dCA-LTR-SHIV，-1N-
[0132]在37°C下，在各種酶合適的IX緩沖液中，并且最終體積為20μ 1，用2單位的酶EcoRUBamHl或Sphl來(lái)消化0.5 μ g等份的質(zhì)粒60分鐘。通過(guò)使用TAE的IX緩沖液在I %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳遷移，并且用溴化乙錠(ETB)來(lái)顯現(xiàn)，并且在UV下觀察凝膠來(lái)檢測(cè)消化圖譜。
[0133]1.3細(xì)胞培養(yǎng)和處理:
[0134]1.3.1.細(xì)胞模型和培養(yǎng)條件
[0135]細(xì)胞系獲自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institute ofHealth)AIDS研究和參考試劑計(jì)劃(AIDS Research and Reference Reagent Program)。將在 10%二甲亞諷(DMSO)中的細(xì)胞冷凍保藏在_170°C的液氮中。將其解凍并隨后培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中。
[0136]HEK293T(永生的人胚腎293)細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞的永久系。由于其非常容易以可達(dá)到100%的非常高的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而使用該細(xì)胞系。慢病毒基因組在這些細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，并且蛋白組裝成傳染性顆粒，并且它們與指示細(xì)胞(CEM或M8166)共培養(yǎng)能夠形成典型的合胞體。HEK293T細(xì)胞是貼壁的，以單層培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶的表面上，且培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)、1%的盤尼西林(5000單位/ml)、鏈霉素5000 μ g/ml和I %的慶大霉素(10mg/ml)的MEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞維持在37°C、含有5%的CO2的潮濕氣氛中。每三天更換一次培養(yǎng)基。為了進(jìn)行傳代培養(yǎng)，去除營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，用d PBS/EDTA沖洗細(xì)胞，并且在37°C、0.5%胰蛋白酶-0.01% EDTA的存在下孵育I分鐘。在細(xì)胞的分離之后，立即將一定體積的MEM培養(yǎng)基加入至細(xì)胞中，并且隨后將這些細(xì)胞均質(zhì)化并且轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。
[0137]細(xì)胞CEMxl74和M8166是人類⑶4+T淋巴細(xì)胞，能夠感染人類和猿猴慢病毒，并且形成典型的細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPE)。他們是非貼壁的，且培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%的SCS、I %的盤尼西林-鏈霉素和I %的慶大霉素的RPMI培養(yǎng)基中。將這些細(xì)胞維持在37°C、含有5%的CO2的潮濕氣氛中。通過(guò)在1500G進(jìn)行5分鐘的離心步驟，以每三天更換一次培養(yǎng)基。隨后通過(guò)連續(xù)的抽吸和釋放到合適體積的培養(yǎng)基來(lái)重懸沉淀物。
[0138]1.3.2.使用體外生物測(cè)試進(jìn)行功能性評(píng)定
[0139]使用質(zhì)粒pCA-LTR-SHIVku2-1N-或 pSHIVku2 的 HEK293T 的轉(zhuǎn)染
[0140]使用的轉(zhuǎn)染方法為使用ExGen500的方法。ExGen500 (Euromedex,法國(guó))由基于線性聚乙烯亞胺的陽(yáng)離子聚合物組成。該聚合物具有非常大的陽(yáng)離子電荷密度，從而使得它能夠與DNA通過(guò)離子鍵而形成絡(luò)合物。然后，這些ExGen500/DNA絡(luò)合物能夠與一般的陰離子細(xì)胞的質(zhì)膜發(fā)生相互作用(經(jīng)由硫酸化蛋白多聚糖的相互作用)。接著發(fā)生絡(luò)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，以及向核內(nèi)體/溶酶體運(yùn)輸。通過(guò)它在酸性pH下的質(zhì)子化能力，ExGen500可以緩沖酸泡(acidvesicle)的介質(zhì)，從而防止轉(zhuǎn)染的DNA發(fā)生降解。該性質(zhì)還引起滲透休克(osmotic shock),該滲透休克使得DNA能夠被釋放在細(xì)胞質(zhì)中。ExGen500隨后促進(jìn)DNA朝向細(xì)胞核的運(yùn)輸，并且避免它被細(xì)胞質(zhì)的核酸酶降解。
[0141]將5 μ g質(zhì)粒DNA加入至350 μ 1150mM的NaCl溶液和15 μ I ExGen500中?；旌衔镌谑覝叵路跤?0分鐘。接下來(lái)，將該混合物加入至含有HEK-293T的培養(yǎng)瓶中，HEK-293T被剛剛更新的培養(yǎng)基覆蓋。
[0142]CEMx174的感染和病毒原液的擴(kuò)增
[0143]經(jīng)pCA-LTR-SHIVku2-1N-或 pSHIVKU2 的 DNA 轉(zhuǎn)染的 HEK-293T 與 CEMx174 進(jìn)行共培養(yǎng)，并且從第48小時(shí)起，CEMx174產(chǎn)生由ECP的形成所表現(xiàn)出感染的標(biāo)志，ECP的形成是由形成合胞體的CEMxl74的融合而導(dǎo)致的。已感染的CEMxl74被轉(zhuǎn)移至存在有新鮮CEMxl74的新培養(yǎng)瓶中以擴(kuò)增病毒，擴(kuò)增的病毒在上清液中收獲。
[0144]病毒生產(chǎn)
[0145]在第48 小時(shí)起，憑借注射器進(jìn)行病毒原液的收獲，然后在使其通過(guò)0.22 μ m直徑的過(guò)濾器以去除細(xì)胞碎片之后，將其放入管中，該管被儲(chǔ)存在-80 V。
[0146]使用病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種
[0147]等份的病毒上清液(10~100 μ I)用于對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行接種，以通過(guò)細(xì)胞病變的出現(xiàn)或通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)評(píng)定其感染性。
[0148]病毒對(duì)非貼壁細(xì)胞的滴定
[0149]含有病毒的上清液經(jīng)十步稀釋(連續(xù)的稀釋)在培養(yǎng)基中以得到從KT1至10_6的稀釋液，稀釋液用于一式四份地接種在24孔板的孔中，其中每孔含有在0.5~Iml的RPMI培養(yǎng)基中的1.1O5個(gè)細(xì)胞。從而經(jīng)接種的細(xì)胞在37°C以及5%的CO2中孵育，并且通過(guò)每3天更換一次培養(yǎng)基維持。定期觀察ECP的發(fā)展。
[0150]1.4.電子顯微鏡觀察經(jīng)pCA-LTR-SHIVKU2-1N-轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞
[0151]帶著檢查由疫苗基因組pCA-LTR-SHIVKU2_IN-所產(chǎn)生的蛋白是否組裝成病毒顆粒的目的，發(fā)明人使用電子顯微鏡(EM)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究。
[0152]經(jīng)pCA-LTR-SHIVKU2-1N-、pSHIVKU2 或 Λ 4SHIVKU2 轉(zhuǎn)染的 HEK293T 細(xì)胞的樣品被固定在用二甲胂酸緩沖液(0.1M的二甲胂酸鈉)稀釋的2.5%的戊二醛溶液中。隨后它們?cè)?°C，在含有1%的四氧化鋨(0s04)的二甲胂酸緩沖液中進(jìn)行60分鐘后固定。隨后樣品在4°C且在黑暗中，在乙酸雙氧鈾(pH4)中孵育過(guò)夜。隨后將樣品浸入用乙醇分別稀釋至30%、60%、90%和100%的連續(xù)浴中保持10分鐘。接下來(lái)，將樣品浸入純乙醇和環(huán)氧樹(shù)脂的50/50混合物(8ml的DDSA、7ml的MNA或13ml的環(huán)氧基樹(shù)脂)中保持2小時(shí)。隨后在將樣品放置在純環(huán)氧樹(shù)脂中保持2小時(shí)，然后被包在比姆(Beem)膠囊中并且開(kāi)始在60°C下進(jìn)行48小時(shí)的聚合。
[0153]憑借具有超薄顯微切片機(jī)的金剛石切片器來(lái)進(jìn)行這些區(qū)域的超薄切割。將這些厚度為70nm的切片放置在銅載網(wǎng)上，從而憑借日本電子(Jeol) 1200EX透射電子顯微鏡在80kV的電壓下進(jìn)行觀察。
[0154]1.5.使用 pCA-LTR-SHIVku2-1N-疫苗 DNA 免疫小鼠
[0155]1.5.1.N0D/SCID小鼠的人源化和瘡苗梓種
[0156]用劑量為120厘戈瑞的Y射線來(lái)輻照6周齡的小鼠50秒。
[0157]使用人類血液的PBMC對(duì)小鼠進(jìn)行人源化[0158]對(duì)在檸檬酸鈉上全血樣進(jìn)行離心(2000g，10min，20°C ),以回收在血漿和紅細(xì)胞之間的白細(xì)胞層。將細(xì)胞稀釋在3倍的PBS/EDTA中，小心地放置在聚蔗糖(Ficoll)墊層(用于分離淋巴細(xì)胞的介質(zhì))上，并且隨后在20°C以2，OOOg離心45分鐘?；厥誔BMC，用PBS/EDTA沖洗若干次，并且重懸在PBSxl中，并且隨后將在0.1ml中的50.1O6pBMC經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑注入每只小鼠中。
[0159]小鼠的免疫
[0160]在人源化后的48至72小時(shí)之后，SCID-hu細(xì)胞與50 μ g的pCA-LTR-SHIVKU2_IN-、PSHIVku2或ρ Λ 4SHIVKU2的DNA —起經(jīng)由肌內(nèi)途徑(頂)注入。用100 μ g的每種DNA通過(guò)頂注射來(lái)直接免疫6~8周齡的BALB/c小鼠。
[0161]1.5.2.評(píng)價(jià)體液應(yīng)答的方法
[0162]亞諾(Abnova)夾層酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)試:
[0163]該測(cè)試是基于對(duì)于對(duì)抗病毒抗原的抗體的檢測(cè)，并且該抗體結(jié)合至96孔板的孔的底部。在孔中放置有待測(cè)試的血清(在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)回收的)、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照?？?HIVAc (抗體)可選地存在，且結(jié)合在病毒抗原上。在對(duì)孔進(jìn)行若干次沖洗以去除過(guò)量和非特異性的結(jié)合之后，加入具有生物素分子的第二檢測(cè)抗體，生物素分子與耦合至HPRO酶的鏈霉親和素相互作用。隨后通過(guò)加入酶的底物TMB來(lái)檢測(cè)形成的抗原/Ac復(fù)合物，這將引起顯色反應(yīng)。該顏色以通過(guò)ELISA光度讀出器中讀出的光密度來(lái)表示。
[0164]將試劑和產(chǎn)物放置在室溫下。將試劑盒提供的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(100 μ I)、空白樣(100 μ I)，以及10 μ I血清樣品和50 μ I血清樣品放置在孔中，最終體積為100 μ I。將該板在37°C孵育30分鐘，用沖洗溶液進(jìn)行洗滌。將稀釋至1:100的第二 Ac溶液(100 μ I)加入除了空白樣的所有孔中。然后用封口膜覆蓋該板并且在37°C孵育20分鐘。在沖洗步驟之后，加入TMB溶液A和B，在實(shí)驗(yàn)室的溫度下孵育該板15分鐘。為了終止著色反應(yīng),每孔加入100 μ I的2N H2SO4。在450nm處讀出該板。
[0165]吸光度值等于或大于閾值的樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性的，該閾值根據(jù)以下公式確定:截留值=NCx+0.100且NCx =兩個(gè)陰性對(duì)照的吸光度值的平均值。
[0166]血清-中和測(cè)試
[0167]該技術(shù)是基于血清-中和Ac (血清-N)抑制對(duì)病毒敏感的細(xì)胞感染的能力。為了檢測(cè)和評(píng)定血清-NAc，使恒定量的感染性病毒與待測(cè)試的血清系列稀釋液相接觸，隨后將該混合物接種至微孔板上的受納細(xì)胞培養(yǎng)物中并且孵育3至5天。通常來(lái)說(shuō)，病毒通常來(lái)說(shuō)是致細(xì)胞病變的毒株，因此ECP數(shù)量的缺乏和降低表明在被測(cè)試的血清中存在Ac。
[0168]將病毒原液SHIVku2在RPMI中稀釋至1:1000 (測(cè)定病毒上清液體積的IOOTCID5q,其對(duì)應(yīng)于5 O %具有合胞體的孔的病毒的稀釋濃度)，以及從NOD / S CID對(duì)照小鼠、用pCA-LTR-SHIVku2-1N-或pSHIVKU2人源化和接種的小鼠中回收的血清被稀釋在相同的培養(yǎng)基中(以10、20、40、80、160和320x稀釋濃度)。經(jīng)稀釋的病毒和血清稀釋液在96孔板中混合(100 μ I/孔)，將該混合物在4°C孵育I小時(shí)。，然后將混合物放置在預(yù)先在24孔板中培養(yǎng)的M8166細(xì)胞(1.1O5個(gè)細(xì)胞/孔)上。在該實(shí)驗(yàn)中，用源于PSHIVku2而沒(méi)有任何血清的病毒來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照，且陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)于僅有細(xì)胞。
[0169]評(píng)定細(xì)胞應(yīng)答的方法:酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)試
[0170]該測(cè)試的目的是檢測(cè)和評(píng)定作為對(duì)抗原刺激特異性應(yīng)答而分泌IFN- Y的T淋巴細(xì)胞(TL)的比例。
[0171]首先，深度麻醉小鼠，并且隨后采取全血和脾臟。將小鼠脾臟放入在冰中的RPMI培養(yǎng)基中。在干燥管中的血液用于分離血清。在PBS和I %的EDTA的存在下，在一對(duì)葉片之間研磨皮氏培養(yǎng)皿中的脾臟，以分離脾細(xì)胞。在PBS/EDTA中將細(xì)胞沖洗兩次(離心2000G，5min,20°C )，以純化和富集具有脾細(xì)胞的細(xì)胞。在孔中播種細(xì)胞之后，用PBS沖洗該板，隨后與PBS+10% SCS在實(shí)驗(yàn)室的溫度下孵育30分鐘。在每個(gè)孔中播種細(xì)胞(5.1O5個(gè)脾細(xì)胞)，然后用最終濃度為2 μ g/ml的Gag、Env、Tat、Rev和Nef蛋白的肽池來(lái)接種。將陽(yáng)性對(duì)照(在試劑盒中包括的CD3-2)和陰性對(duì)照加入測(cè)試中。用鋁箔覆蓋該板，在37°C孵育19小時(shí)。沖洗細(xì)胞和肽，隨后加入生物素化(7-b6-生物素)的抗-1FN-Y的單克隆抗體，并且覆蓋該板，在室溫下孵育2h。加入稀釋在含有0.5%的FCS的PBSdOOy I/孔)，并且該板在室溫下孵育I小時(shí)。在另一個(gè)沖洗步驟之后，隨后加入TMB (顯影底物)，隨后，在出現(xiàn)藍(lán)斑之后沖洗該板并且進(jìn)行干燥。在雙目放大鏡下以40倍的放大率來(lái)完成板的讀出。
[0172]對(duì)于每種條件，通過(guò)計(jì)算重復(fù)斑點(diǎn)的數(shù)量的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定孔的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算I百萬(wàn)PBMC的斑點(diǎn)的數(shù)量，并且該數(shù)量被標(biāo)準(zhǔn)化至在N0D/SCID小鼠中得到的數(shù)據(jù)的20%。如果該斑點(diǎn)的平均值大于每百萬(wàn)PBMC中有大于10個(gè)斑點(diǎn)(對(duì)應(yīng)于對(duì)照培養(yǎng)物所得到的斑點(diǎn)的平均值)，則認(rèn)為測(cè)試是陽(yáng)性的。
[0173]1.6.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)抗原特異性的T細(xì)胞的表型和功能性檢驗(yàn)
[0174]1.6.1.外周單核細(xì)胞的分離
[0175]如上所示制備人類外 周血的單核細(xì)胞。根據(jù)上述程序分離的小鼠脾臟的脾細(xì)胞也被重懸在AM V培養(yǎng)基中，而不具有任何用于孵育和細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)試的血清。
[0176]1.6.2.細(xì)胞的抗原刺激和培養(yǎng)
[0177]為了檢驗(yàn)抗原的特異性細(xì)胞是否能夠增殖且產(chǎn)生細(xì)胞因子和裂解分子，用CFSE(1 μ g/ml)在37°C對(duì)脾細(xì)胞和PBMC標(biāo)記10分鐘，并且隨后用PBSlX來(lái)沖洗細(xì)胞以除去過(guò)量物。經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞以Iml AIM V培養(yǎng)基中2.1O6/孔的量播種在96孔板的深孔中，并且隨后在抗-⑶49和⑶28共刺激Ac的存在下，用以2 μ g/ml的量的不同肽池(Gag、Env和Tat+Rev+Nef)進(jìn)行刺激。沒(méi)有任何肽的細(xì)胞被用作陰性對(duì)照，并且加入2 μ g/ml的植物凝集素(PHA)的細(xì)胞被用作陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)5天(37°C，具有濕度)，然后在標(biāo)記這些細(xì)胞之前用相同的肽池再刺激6小時(shí)。通過(guò)離心(2，000G，5min，4°C )收獲細(xì)胞，重懸在100 μ I的PBS中，并且用表面Ac(CD3、CD4和CD8) [Pacific Blue (太平洋之藍(lán))抗-人類⑶3(5 μ I)，PE抗-人類⑶4 (10 μ I)和APC/Cy7抗-人類⑶8 (10 μ I)]在室溫下進(jìn)行首次標(biāo)記30分鐘。隨后離心細(xì)胞，然后用PBSlX沖洗，然后進(jìn)行固定，并且在100 μ I的BD的Cytofix Cytoperm中使細(xì)胞是可滲透的。隨后，在4°C，細(xì)胞與“抗-人類IFN-Y PE_Cy7”和“Alexa Fluor647抗-人類顆粒酶A” Ac (5 μ I)孵育20分鐘來(lái)進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記。最后，用PBS沖洗細(xì)胞且用4% PFA進(jìn)行固定，然后使用流式細(xì)胞分析儀獲得和分析。
[0178]1.6.3.儀器
[0179]使用連接BD FACSDiva6軟件包的來(lái)自BD的LSRII流式細(xì)胞分析儀。該儀器能夠進(jìn)行高達(dá)13種熒光參數(shù)以及2種物理參數(shù)的測(cè)量，該物理參數(shù)是FSC大小(前向散射)和復(fù)雜度(complexity)或粒團(tuán)SSC(側(cè)散射)。該儀器裝配有三種激光。在488nm處發(fā)射的藍(lán)色激光可獨(dú)立地激發(fā)若干種熒光染料(FITC、PE、PE-Cy7)。在633nm處發(fā)射的紅色激光可激發(fā)APC和APC-Cy7熒光染料，最后在405nm處發(fā)射的紫色激光可激發(fā)Pacific Blue熒光染料。
[0180]1.7.獼猴的免疫
[0181]在該研究中總共使用了 12只食蟹獼猴。6只獼猴形成對(duì)照組，其它的6只獼猴形成接種組。經(jīng)由肌內(nèi)途徑(4mg/動(dòng)物和Img/動(dòng)物)通過(guò)電穿孔(EP)進(jìn)行DNA的單次雙注射，以免疫動(dòng)物。
[0182]用單劑量的疫苗進(jìn)行該免疫策略的原因是多重的。一個(gè)主要原因不會(huì)擾亂由與每一再免疫步驟相關(guān)的初始效應(yīng)T細(xì)胞所引起的記憶T細(xì)胞的生成、成熟和增殖。
[0183]經(jīng)免疫的動(dòng)物經(jīng)受縱向跟蹤(一周一次進(jìn)行4周，隨后一周2次直至第32周，隨后I周4次進(jìn)行10個(gè)月)以檢驗(yàn)由疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在免疫前的2周和I周時(shí)采取血液樣品用于檢驗(yàn)可能的本底應(yīng)答。分離外周血的單核細(xì)胞(PBMC)并且用于通過(guò)表面和胞漿內(nèi)標(biāo)記，以及通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析，使用ELISPOT IFN- λ測(cè)試來(lái)評(píng)定T細(xì)胞的應(yīng)答。
[0184]2.結(jié)果
[0185]2.1.pCA-LTR-SHIVKU2-1N-質(zhì)粒構(gòu)建體的定性和定量檢測(cè)
[0186]2.1.1.pCA-LTR-SHIV^-1N-質(zhì)粒的存在
[0187]當(dāng)從多克隆細(xì)菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，其中多克隆細(xì)菌培養(yǎng)物獲自BL培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)物，該預(yù)培養(yǎng)物 用于播種大體積的BL液體培養(yǎng)基時(shí)，觀察到顯著比例的約2000bp的游離基因。電泳圖譜也表明存在對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒的約HOOObp (理論上為13739bp)的單一DNA 帶。
[0188]當(dāng)從細(xì)菌培養(yǎng)物中分離DNA，其中細(xì)菌培養(yǎng)物首先在皮氏培養(yǎng)皿上產(chǎn)生以得到分離的克隆，這些克隆已被用于預(yù)培養(yǎng)和大量培養(yǎng)以用于分離和純化質(zhì)粒DNA時(shí)，在分離0.5yg的DNA之后得到的電泳圖譜示出缺乏任何游離基因，并且示出對(duì)應(yīng)于pCA-LTR-SHIVKU2-1N-質(zhì)粒的環(huán)狀、螺旋和超螺旋形式的高分子量DNA的三條帶。通過(guò)分光光度法檢測(cè)我們兩種制備方法的質(zhì)粒DNA的純度和定量分析。在波長(zhǎng)230nm、260nm和280nm處測(cè)量的吸光度值用于分別確定260/280比例(為1.75和1.82)和260/230比例(2.04和
1.92)，這表明了我們的DNA具有令人滿意的質(zhì)量。DNA濃度分別為545 μ g/ml和765 μ g/ml ο
[0189]2.1.2.pCA-LTR-SHIV^-1N-的酶消化
[0190]用EcoRl消化質(zhì)粒的圖譜顯示出存在在EcoRI位點(diǎn)處切割出約5，OOObp和7，500bp的兩條帶；用Bam Hl消化質(zhì)粒的圖譜顯示出存在在Bam Hl位點(diǎn)處切割出2400bp、4，900bp和7，400bp的三條帶；以及用Sphl消化質(zhì)粒的圖譜顯示出存在在單個(gè)Sphl位點(diǎn)處切割出的位于1000Obp處的條帶。用BamHl消化還觀察到2400bp的額外條帶,并且該條
帶應(yīng)來(lái)自游離基因。
[0191]2.2.功能性的評(píng)定:質(zhì)粒DNA對(duì)細(xì)胞的作用
[0192]用表達(dá)GFP的對(duì)照質(zhì)粒pCG-GFP、質(zhì)粒pSHIVKU2，并且隨后用質(zhì)粒pCA-LTR-SHIVKU2-1N-轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pCG_GFP的細(xì)胞能夠通過(guò)評(píng)價(jià)GFP+細(xì)胞的數(shù)量來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。
[0193]為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染有pCA-LTR-SHIVKU2-1N-或pSHIVKU2的HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)典型合胞體的病毒體，這些細(xì)胞與CEMxl74 —起共培養(yǎng)，隨后在顯微鏡下觀察ECP的發(fā)生。用ECP表征產(chǎn)生的兩種共培養(yǎng)物。
[0194]為了檢測(cè)通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞所產(chǎn)生的SHIVku2病毒是否復(fù)制了若干次，而將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液用于感染M8166人類⑶4+T淋巴細(xì)胞系。使用SHIVku2得到的結(jié)果清楚地表明它感染且誘導(dǎo)ECP，尤其是使用高受納的M8166細(xì)胞系。這些ECP在48小時(shí)之后馬上出現(xiàn)，但是也在遲來(lái)的階段中出現(xiàn)。
[0195]接下來(lái)，為了檢測(cè)疫苗載體pCA-LTR-SHIVKU2_IN-的DNA僅允許單一的復(fù)制周期(因?yàn)樗鼊h除了 in基因)，回收的含有Ca-LTR-SHIVku2-1N-病毒的上清液首次被接種，隨后第二次被接種至正在培養(yǎng)的M8166細(xì)胞。首次接種從48小時(shí)開(kāi)始并且在76小時(shí)結(jié)束時(shí)產(chǎn)生ECP，它們是更大量的?；厥者@些感染的細(xì)胞的上清液并將該上清液再次接種至M8166。與之前的接種不同，在接種后的48小時(shí)或76小時(shí)時(shí)均未觀察到ECP。這些結(jié)果能夠得出這樣的結(jié)論:pCA-LTR-SHIVKU2-1N-僅能夠?qū)ε囵B(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行一次轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0196]典型ECP的存在暗示質(zhì)粒DNA在HEK293T細(xì)胞中復(fù)制，并且已經(jīng)產(chǎn)生了Ca-LTR-SHIVku2-1N-病毒體。 第一次感染的ECP表明M8166人類CD4+TL系通過(guò)產(chǎn)生的顆粒而具有感染性，并且在第二次感染中它們的缺失表明在細(xì)胞中缺乏生產(chǎn)性復(fù)制。
[0197]2.3.對(duì)轉(zhuǎn)染有dCA-LTR-SHIV^-1N-的HEK293T細(xì)朐中病毒顆粒的形杰講行的電子顯微分析
[0198]接下來(lái)，確定由疫苗pCA-LTR-SHIVKU2_IN-基因組產(chǎn)生的蛋白是否在HEK293T細(xì)胞中適當(dāng)?shù)亟M裝成病毒顆粒。通過(guò)EM檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pCA-LTR-SHIVKU2-1N-的HEK293T細(xì)胞的形態(tài)。
[0199]結(jié)果表明病毒顆粒以芽體和已經(jīng)與細(xì)胞分離的成熟病毒顆粒的形式存在于細(xì)胞的表面。因此，pCA-LTR-SHIVKU2-1N-疫苗的病毒蛋白為了產(chǎn)生在細(xì)胞外側(cè)上出芽的病毒顆粒而進(jìn)行組裝。
[0200]2.4.對(duì)人源化的SCID小鼠和BALB/c小鼠講行梓種的體內(nèi)測(cè)丨試
[0201]2.4.1.在梓種有dCA-LTR-SHIV，-1N-的SCID-hu小鼠中評(píng)估體液應(yīng)答
[0202]利用商購(gòu)的ELISA測(cè)試的方式，檢測(cè)免疫后約I個(gè)月時(shí)所采集的經(jīng)免疫小鼠的血清樣品中的Ac存在，該Ac特異性地結(jié)合病毒的抗原。在表1(下面)中總結(jié)了該分析的結(jié)果。這些結(jié)果表明類似于用SHIVku2的DNA免疫的小鼠樣品，來(lái)自用疫苗pCA-LTR-SHIVku2-1N-的DNA免疫的小鼠的約一半的樣品具有較小的陽(yáng)性比例(分別為44%和37% )，這不同于來(lái)自用pA4SHIVKU2免疫的小鼠的樣品(50%)。這些結(jié)果證實(shí)了疫苗pCA-LTR-SHIVKU2-1N-的DNA在NOD/SCID-hu小鼠中誘導(dǎo)體液應(yīng)答的能力。在3個(gè)用P Δ 4SHIVKU2免疫的小鼠的血清中的I個(gè)樣品具有的OD值大于在用pCA-LTR-SHIVKU2-1N-和PSHIVku2免疫的小鼠的血清的樣品所獲得的OD值。該質(zhì)粒是非復(fù)制性，病毒的蛋白保持與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的膜相關(guān)聯(lián)，從而應(yīng)誘導(dǎo)較少的Ac。
[0203]
【權(quán)利要求】
1.一種包括嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的核酸，其中，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括: 在第一逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’中和3’中的長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR，所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒為山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒CAEV、綿羊髓鞘脫落病毒VMV、馬傳染性貧血病毒EIAV、腫瘤病毒或泡沫病毒；以及 第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒不是所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少三種病毒基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、re V基因、vpu基因和euv基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組進(jìn)一步包括第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種病毒基因，所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒不同于所述第一逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒或所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒的至少一種基因選自gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和euv基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4和5中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因，和所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒的tat基因、rev基因、vpu基因和euv基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒選自腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4至6中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒各自選自腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4至8中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述第二逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述第三逆轉(zhuǎn)錄病毒各自為慢病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述慢病毒選自1-型人類免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒SIV、貓免疫缺陷病毒FIV或馬傳染性貧血病毒EIAV。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4至10中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述慢病毒的嵌合基因組包括SIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因，和HIV-1的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，所述慢病毒的嵌合基因組包括HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，或HIV-2的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于，當(dāng)所述pol基因存在時(shí)，所述Pol基因?yàn)閯h除了編碼整合酶in的序列的pol基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸，其特征在于，非整合型的所述嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括序列SEQ ID NO:1、序列SEQ ID NO:2或序列SEQ ID NO:6。
15.一種重組的載體，包括權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的核酸。
16.一種免疫原性組合物或疫苗組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的核酸，或根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的核酸，根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗組合物在預(yù)防或治療由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的感染中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸、載體或疫苗組合物的應(yīng)用，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的核酸、載體或疫苗組合物的應(yīng)用，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒為 HIV-l、HIV-2 或 FIV。
【文檔編號(hào)】C07K14/155GK103946385SQ201280055569
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月12日
【發(fā)明者】葉海亞·舍布羅恩, 戴爾芬·阿爾得伯特, 杰拉爾丁·阿如德-布如斯 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心