用于生產(chǎn)因子viii的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物中生產(chǎn)因子VIII多肽的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于生產(chǎn)因子Vl I I的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)因子VIII多肽的方法。
[0002]發(fā)明背景
因子VIII是重要的凝血因子。導(dǎo)致因子VIII蛋白減少或缺陷的因子VIII基因中的突變引起遺傳疾病血友病A，其特征在于復(fù)發(fā)性的出血發(fā)作。血友病A的治療需要血漿來(lái)源或重組的因子VIII的靜脈輸注。
[0003]盡管血漿來(lái)源的因子VIII可用于治療血友病，但這種方法有多種問(wèn)題，包括病毒向患者的傳播。因此，優(yōu)選施用已重組表達(dá)的因子VIII。
[0004]難以從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得大量的因子VIII。已知因子VIII以非常低的水平在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。也已知因子VIII是在無(wú)血清或無(wú)蛋白培養(yǎng)基中不穩(wěn)定的蛋白。各種物質(zhì)的添加已用于改進(jìn)重組生產(chǎn)的因子VIII的產(chǎn)量。例如，使用高強(qiáng)度的緩沖液提高因子VIII的產(chǎn)量。然而，這種苛刻的處理不允許細(xì)胞的后續(xù)重新使用。
[0005]盡管對(duì)因子VIII調(diào)控有所了解，但在商業(yè)制造使用的異源系統(tǒng)中，因子VIII的產(chǎn)量依舊顯著低于其他重組蛋白。WO 2008/135501公開(kāi)了使用結(jié)合因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域的配體(例如，正磷酸-L-絲氨酸(OPLS))獲得改進(jìn)的因子VIII產(chǎn)量。然而，需要進(jìn)一步提高可以從細(xì)胞培養(yǎng)物分離的因子VIII 的產(chǎn)量的方法和組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)使培養(yǎng)細(xì)胞接觸結(jié)合磷脂酰絲氨酸的試劑，釋放到培養(yǎng)基且隨后收獲的因子VIII的量大幅增加。具體地，與向細(xì)胞基添加結(jié)合因子VIII的C2結(jié)構(gòu)域的試劑OPLS時(shí)所見(jiàn)的產(chǎn)量相比，因子VIII的產(chǎn)量顯著增加。
[0007]因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)因子VIII多肽的方法，所述方法包括:
a)在使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)因子VIII多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和
b)在步驟(a)期間或步驟(a)之后，使所述細(xì)胞接觸結(jié)合磷脂酰絲氨酸的試劑。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步提供了:
-細(xì)胞培養(yǎng)基，其不含血清并且包含:i)選自乳凝集素、膜聯(lián)蛋白V、抗磷脂抗體和因子VIII輕鏈的試劑，和ii)正磷酸-L-絲氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白。
-能夠結(jié)合磷脂酰絲氨酸的化合物用于提高可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物分離的因子VIII的產(chǎn)量的用途。
[0009]序歹1丨
SEQ ID NO:1 (人B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII):
ATRRWLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKICrLFVEFr
DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTW1TLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD
QTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGUGALL
VCREGSLAKEfCTOTLHKfllXFAVFDEGKSWHSElTKNSUVIODRDAASARAWPKMHTVNGY
VNRSLPGUGCHRKSVYWHVtGMGTTPEVHStFLEGHTFLVRNHRQASLElSPfTFLTAQTLL
【權(quán)利要求】
1.用于生產(chǎn)因子VIII多肽的方法，所述方法包括: a)在使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)因子VIII多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和 b)在步驟(a)期間或步驟(a)之后，使所述細(xì)胞接觸結(jié)合磷脂酰絲氨酸的試劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在所述細(xì)胞的生存力是至少80%的時(shí)間點(diǎn)，收獲因子VIII多肽的步驟。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在2-3天后收獲因子VIII多肽的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且其中所述因子VIII多肽是人因子VIII多肽。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)i)將所述試劑與因子VIII共表達(dá)，或ii)向培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基添加所述試劑，使所述試劑接觸所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑是特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸的蛋白，優(yōu)選乳凝集素、膜聯(lián)蛋白V、抗磷脂抗體或因子VIII輕鏈。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述乳凝集素、膜聯(lián)蛋白V或因子VIII輕鏈以0.01至100 μ M的濃度添加或共表達(dá)。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中使一種、兩種、三種或更多種能夠結(jié)合細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸的試劑接觸所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中乳凝集素、膜聯(lián)蛋白V、抗脂質(zhì)抗體或因子VIII輕鏈與正磷酸-L-絲氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白一起接觸所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在不含動(dòng)物來(lái)源組分的細(xì)胞培養(yǎng)基中，其中所述方法進(jìn)一步包括分離所述因子VIII多肽和將所述因子VIII多肽配制到藥物組合物中。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中從培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基分離所述因子VIII多肽，而基本不降低細(xì)胞的生存力，其中優(yōu)選至少85%的細(xì)胞保持存活。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在分離所述因子VIII多肽后，將相同的細(xì)胞用于根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法中。
13.細(xì)胞培養(yǎng)基，其不含血清并且包含:i)選自乳凝集素、膜聯(lián)蛋白V、抗磷脂抗體和因子VIII輕鏈的試劑，和ii)正磷酸-L-絲氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白。
14.能夠結(jié)合磷脂酰絲氨酸的試劑用于提高可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物分離的因子VIII的產(chǎn)量的用途。
【文檔編號(hào)】C07K14/755GK103946235SQ201280057127
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月21日
【發(fā)明者】L.B.約翰遜, M.P.科林德, P.L.諾拜 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克有限公司