酶原激活劑的制作方法
【專利摘要】本文中提供酶原激活分子如酶原激活肽，以及鑒定和使用這些酶原激活分子如酶原激活肽的方法。
【專利說明】酶原激活劑
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求35U.S.C.§ 119下2011年10月14日提交的臨時(shí)美國申請(qǐng)N0.61/547，628、2012年5月17日提交的美國申請(qǐng)N0.61/648，470和2012年6月18日提交的美國申請(qǐng)N0.61/661，180的權(quán)益，其內(nèi)容通過提述完整并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本文中提供酶原激活分子如酶原激活肽，以及鑒定和使用這些酶原激活分子(例如酶原激活肽)的方法。
[0004]序列表
[0005]本申請(qǐng)含有經(jīng)由EFS-Web提交且通過提述完整并入本文的序列表。所述ASCII拷貝在 2012 年 10 月 10 日創(chuàng)建，名為 P4768Rlff0_PCTSequenceListing.txt，且大小為 66，227個(gè)字節(jié)。
[0006]發(fā)明背景
[0007]肝細(xì)胞生長因子(HGF)，亦稱為分散因子(scatter factor)，是血纖維蛋白溶酶原相關(guān)的生長因子家族的成員，而且是細(xì)胞遷移、增殖、存活、活動(dòng)和形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵介導(dǎo)物(Stoker, M.等(1987)Nature327:239-42 ;Nakamura, T.等(1989)Nature342:440-3 ;Bussolin o，F(xiàn).等(1992) J Cell Biol 119:629-41)。已知 HGF 特異性活化Met 受體酪氨酸激酶，導(dǎo)致RAS和PI3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游激活，并且對(duì)于諸如傷口愈合和組織再生的過程是關(guān)鍵性的(Grant, D.S.等(1993) Proc Natl Acad Sci USA90:1937-41 ；ffatanabe, S.等(1994)Biochem Biophys Res Communl99:1453-60 ;Derman, M.P.等(1995)Am JPhysiol268:F1211-7 ；Bevan, D.等(2004)J Patho1203:831-8 ;Nakamura, T.等(2011)JGastroenterol Hepatol 26 Suppll: 188-202)。因此，揭不 Met 受體的 HGF 依賴性活化的新機(jī)制可能提供用于刺激慢性傷口和纖維變性病癥中的組織修復(fù)的新策略(Nakamura, T.等(2Oll)J Gastroenterol Hepatol 26 Suppll:188-202)?
[0008]HGF是一種分泌的胞外蛋白質(zhì)，其作為無活性的單鏈配體存在(原HGF (pro-HGF))，直至在Arg494-Val495肽鍵處的蛋白水解切割產(chǎn)生由二硫鍵連接的α / β異二聚體組成的雙鏈形式，其能活化Met受體(Nakamura, T.等(1989)Nature342:440-3 ；Naldini, L-等(1992)EMBO Jl1:4825-33 ；Shimomura, T.等(1995)EurJ Biochem229:257-61 ；Lee, S.L.等(2000)J Biol Chem275:36720-5；Peek, M.等(2002)J Biol Chem277:47804-9)。HGF的域體系類似于血纖維蛋白溶酶原，其中α鏈包含N末端PAN域，之后是4個(gè)Kringle域重復(fù)(Κ1_4)，β鏈含有C末端胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域(圖1) (Donate, L.E.等(1994)Protein Sci3:2378-94 ；Tordai, H.等(1999)FEBS Lett461:63-7)。特別地，雙鏈HGF和單鏈原HGF均能以高親和力經(jīng)由α鏈的特異性相互作用結(jié)合Met受體；然而，受體活化僅能在原HGF切割成雙鏈形式后發(fā)生(Hartmann, G.等(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:11574-8 ；Lokker, N.A.等(1992)EMBO Jll:2503-10 ；Naldini, L.等(1992) EMBO Jll: 4825-33)。研究表明，在肝硬化和肺纖維化的某些情況中，正常組織修復(fù)過程由于缺少可用原HGF到活性形式的蛋白水解轉(zhuǎn)化而嚴(yán)重受損；從而導(dǎo)致降低的Met信號(hào)傳導(dǎo)(Arakaki, N.等(1995)Hepatology22:1728-34 ；Kaibori, Μ.等(2002)J Surg Res106:108-14 ；Marchand-Adam, S.等(2006)Am J RespirCrit Care Medl74:58-66 ；Phin,S.等(2010)Am J Respir Cell Mol Biol42:286-93)。這不僅突顯了切割步驟在調(diào)節(jié)HGF依賴性Met信號(hào)傳導(dǎo)中的重要性，而且還表明將可用原HGF可逆轉(zhuǎn)化為活性形式(能進(jìn)行Met信號(hào)傳導(dǎo))的變構(gòu)激活劑可能會(huì)得到一種刺激這些適應(yīng)證中的組織修復(fù)的新治療辦法(圖2)。還有許多其他的其中HGF活化具有潛在益處的適應(yīng)證；對(duì)于組織和疾病的綜述和部分列表，參見(Nakamura, T.等(2011) J GastroenterolHepatol 26 Suppll: 188-202)和本文中表 3。
[0009]大量的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)工作已揭示，HGF將胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活化機(jī)制用于 Met 信號(hào)傳導(dǎo)(Kirchhofer, D.等(2004) J Biol Chem279:39915-24 ；Stamos, J.等(2004)EMBO J23:2325-35 ；Kirchhofer, D.等(2007)Proc Natl Acad SciUSA104:5306-11)。當(dāng)原HGF切割后，絲氨酸蛋白酶樣β鏈中新形成的N末端(Val495)(對(duì)應(yīng)于胰凝乳蛋白酶原編號(hào)中的殘基16)插入規(guī)范的‘活化袋(activation pocket) ’(圖3)。詳細(xì)的工作顯示，N末端插入對(duì)于變構(gòu)性活化β鏈?zhǔn)顷P(guān)鍵的，其允許Met結(jié)合和受體信號(hào)傳導(dǎo)的后續(xù)活化。重要的是，研究顯示將β鏈內(nèi)的N末端Val495突變?yōu)镚ly或Asp672突變?yōu)锳sn阻止N末端插入，由此破壞β鏈對(duì)Met的結(jié)合并完全消除了雙鏈HGF的信號(hào)傳導(dǎo)活性(Kirchhofer, D.等(2007) Proc Natl Acad Sci USA104:5306-11)。如此，將原 HGF 轉(zhuǎn)化成Met激動(dòng)劑的關(guān)鍵機(jī)制步驟直接類似于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的活化(Khan, A.R.等(1998)Protein Sci7:815-36 ；Hedstrom, L.(2002)Chem Revl02:4501-24)，盡管事實(shí)上絲氨酸蛋白酶樣β鏈介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而非蛋白水解活性。
[0010]先前已顯示，在基于細(xì)胞的Met信號(hào)傳導(dǎo)測定法中，源自HGFP天然N末端的頭7-10個(gè)殘基的小肽靶向HGFP酶原樣形式(scHGFii)的絲氨酸蛋白酶樣活化袋，變構(gòu)性激活Met結(jié)合，隨后激 活原HGF的未切割形式(scHGF) (Landgraf，K.E.等(2010) J BiolChem285:40362-72)。盡管這確立了通過靶向HGF β的活化袋來變構(gòu)性調(diào)節(jié)原HGF信號(hào)傳導(dǎo)活性的能力，但該辦法的治療潛力由于激活劑肽的非常弱的結(jié)合親和力(KD~2mM)而受到限制(Landgraf, K.E.等(2010) J Biol Chem285:40362-72)。因此，仍然需要 HGF 信號(hào)傳導(dǎo)的有效激活劑。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本文中提供酶原激活分子(例如酶原激活肽(ZAP))，以及鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能調(diào)控包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)的活化并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)。例如，本文中提供酶原激活分子(例如ZAP)，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能通過HGF調(diào)控c-Met的活化，具體地通過與原HGF β鏈域的相互作用。
[0013]HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要的生物學(xué)作用，且其擾動(dòng)涉及傷口愈合、組織再生和組織修復(fù)。本文中提供組合物和使用這些組合物的方法，其用于調(diào)控HGF蛋白，特別是原HGF的β鏈域的活性。由于與HGF有關(guān)的重要功能，本文中的組合物和方法呈現(xiàn)顯著的臨床效用。[0014]如本文中描述的，使用噬菌體展示的N末端肽庫鑒定與HGF0鏈域相互作用的酶原激活分子(例如ZAP)的集合。對(duì)ZAP的表征導(dǎo)致獨(dú)特基序的鑒定，認(rèn)為所述基序賦予分子與HGF，特別是原HGF相互作用的能力，并激活c-Met信號(hào)傳導(dǎo)。如本文中描述的例示性酶原激活分子(例如ZAP)可用于篩選包含胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域和/或胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶樣域的多肽的調(diào)控物(例如激活劑)。此外，這類酶原激活分子(例如ZAP)及其衍生物本身就是用于治療與由包含胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域和/或胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(如HGF)所調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)有關(guān)的病理學(xué)疾病和/或病癥的小分子藥物候選物。
[0015]本文中提供分離的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-Bn(SEQ ID NO:2)，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氣基酸，X3 是 G、D、E、N、Q、D-Gly、D~Asp、D-Glu、D-Asn 或 D-Gln, X4 是 G 或 A，B 是任意氨基酸，而η是0-46的數(shù)字。本文中還提供分離的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP組成為氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO: 3)，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是G、D、E、N、Q或D-氨基酸，X4是G或A，B是任意氨基酸，而η是0-46的數(shù)字。
[0016]在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，X1是1匕1、V或正亮氨酸(SEQ IDNO:4)。在一些實(shí)施方案中，乂丨是匕I或V(SEQ ID NO:5)。在一些實(shí)施方案中，X1是I或V (SEQ ID NO: 6) ο在一些實(shí)施方案中，X1是I (SEQ ID N0:7)。在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，X2是M、L 、1、V、正亮氨酸、F或Y(SEQ ID N0:8)。在一些實(shí)施方案中，X2是1、V、L*F(SEQ ID NO: 9)。在一些實(shí)施方案中，X2是I或V (SEQ ID NO: 10)。在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，乂3是6、0或N(SEQ ID NO: 11)。在一些實(shí)施方案中，X3是G(SEQID NO: 12)。在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，X4是G(SEQ ID NO: 13)。
[0017]在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，X1-X2-X3-XJSEQ ID NO: 14)是IVGG(SEQID NO:15)、 IVDG(SEQ ID NO:16),IVdG,IVGG(SEQ ID NO:17)、 IIGG(SEQ ID NO:18)、VVNG (SEQ ID NO: 19)、VVGG (SEQ ID NO: 20)、IVGG (SEQ ID NO: 21)、LIDG (SEQ ID NO: 22)、IVEG(SEQ ID NO:23)、ITGG(SEQ ID NO:24)、IVNG(SEQ ID NO:25)、IFNG(SEQ ID NO:26)、IYGG(SEQ ID NO: 27)、ILGG(SEQ ID NO: 28)、或 IKGG(SEQ ID NO: 29)，其中 d 是 D-天冬氨酸。
[0018]在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，ZAP特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽，并活化所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽。在一些實(shí)施方案中，ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域并經(jīng)由c-Met激活HGF信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域的活化袋。在一些實(shí)施方案中，ZAP結(jié)合前凝血酶-2 (prethrombin-2)并激活前凝血酶_2或原凝血酶(prothrombin)的酰胺分解活性。在一些實(shí)施方案中，ZAP結(jié)合蛋白C并激活蛋白C的酰胺分解活性。
[0019]在任一種分離的ZAP的一些實(shí)施方案中，ZAP變構(gòu)性活化所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽。
[0020]另外，本文中提供ZAP融合物，其包含綴合至載體的本文中描述的ZAP。在一些實(shí)施方案中，所述載體是生物可降解的聚合物(例如PEG、聚交酯(polylactide)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚己酸內(nèi)酯、及其共聚物、碳水化合物、淀粉、纖維素、殼多糖和木素、或多肽載體(例如Fe和血清清蛋白))。在一些實(shí)施方案中，ZAP對(duì)載體的綴合相比于未綴合載體的ZAP增加ZAP的半衰期和/或生物利用度。
[0021]本文中提供治療個(gè)體中疾病或病癥的方法，包括施用有效量的本文中描述的任一種ZAP或ZAP融合物。在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥的癥狀是纖維化或肝硬化。
[0022]本文中還提供促進(jìn)個(gè)體中的組織再生和/或組織修復(fù)的方法，包括施用有效量的本文中描述的任一種ZAP或ZAP融合物。
[0023]在另一個(gè)方面，本文中提供鑒定能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽并激活所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽的ZAP的方法，所述方法包括(a)使第一樣品與候選ZAP接觸，所述第一樣品包含一種多肽或其片段，所述多肽或其片段包含原形式的(pro-form)絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域，(b)使第二樣品與候選ZAP接觸，所述樣品包含一種多肽或其片段，所述多肽或其片段包含成熟形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域，(c)測定(a)和(b)中所述候選ZAP的結(jié)合的量，其中(a)中所述候選ZAP的結(jié)合比(b)多指示所述候選ZAP能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的所述多肽并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽。
[0024]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在存在所述候選ZAP和靶物的情況下測定包含原形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段的活性，其中所述活性指示所述候選ZAP能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的所述多肽并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽。在一些實(shí)施方案中，所述靶物是c-Met。在一些實(shí)施方案中，所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是HGF，包含原形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段是原 HGF，且包含成熟形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段是成熟的HGF。在一些實(shí)施方案中，包含所述絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是前凝血酶-2或原凝血酶。在一些實(shí)施方案中，包含所述絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是蛋白C。在一些實(shí)施方案中，候選ZAP是本文中描述的一種或多種ZAP或ZAP融合物。
[0025]附圖簡述
[0026]圖1.HGF蛋白。顯示N末端PAN域(N)、4個(gè)Kringle域(K1-K4)和C末端胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域(SP)的HGF域拓?fù)鋵W(xué)的示意圖。原HGF中Arg494-Val495肽鍵的切割(箭頭)產(chǎn)生活化的雙鏈HGF。含有不可切割突變的重組蛋白由倒置黑色三角形指示。
[0027]圖2.原HGF活化的模型。在正常條件下，原HGF經(jīng)歷蛋白水解切割變成HGF的雙鏈活性形式(“蛋白水解活化”途徑)。在其中HGF的正常蛋白水解活化受損的疾病中，結(jié)合原HGF、能變構(gòu)性誘導(dǎo)活性樣形式(原HGF*)的分子(有“ + ”的棒和圓圈)可能是提供對(duì)原HGF的可逆活化(“變構(gòu)性活化”途徑)的有用治療物。
[0028]圖3.與Met復(fù)合的HGF^鏈結(jié)構(gòu)的表面圖((Stamos, J.等(2004)EMBOJ23:2325-35)，PDB1SHY)。在棒圖中顯示的是HGFP鏈N末端的頭8個(gè)殘基(VVNGIPTR) (SEQID NO:30)插入到活化袋，其中描繪了氧、氮和碳原子。在插入活化袋后，Val495的N末端與Asp672的側(cè)鏈形成鹽橋；這些分別對(duì)應(yīng)于胰凝乳蛋白酶原編號(hào)中的殘基16和194。[0029]圖4.用于scHGFβ變構(gòu)性活化的庫設(shè)計(jì)和共有序列。㈧基因_VIII肽(SEQID NO: 117)噬菌體庫設(shè)計(jì)。(B)在噬菌體化scHGFii后衍生的共有序列匯總為標(biāo)志式圖(http: //weblog0.threeplusone.com/create, cgi)。(C) scHGF β 的激活齊Li妝序列基序(SEQID NO:114)。
[0030]圖5.激活scHGF β對(duì)Met結(jié)合的合成肽的結(jié)合親和力。㈧展現(xiàn)scHGF β的變構(gòu)性活化的肽滴定。(B)缺少scHGF β的變構(gòu)性活化的肽滴定。
[0031 ] 圖6.BxPC-3細(xì)胞存活測定法。㈧HGF (400ng/ml)能有力刺激細(xì)胞存活而scHGF (400ng/ml)沒有活性。(B) scHGF的肽滴定顯示對(duì)于IVGG.14(黑色)、IVdG.14 (深灰)和IVDG.14(淺灰)scHGF的變構(gòu)性活化和引發(fā)細(xì)胞存活。IVGG.14和IVdG.14兩者均能將scHGF活化至與㈧中HGF類似的水平。
[0032]圖7.原HGF激活劑肽的經(jīng)修飾的共有基序(SEQ ID NO: 118)。頭4個(gè)位置已被擴(kuò)展為包含通常鑒于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域N末端的殘基。位置5已被修飾為包含類似的疏水性殘基。
[0033]圖8.結(jié)合HGF β V495G的活化袋(淺灰)的IVGG.14激活劑(深灰)的晶體結(jié)構(gòu)。(A)IVGG.14的總體“S形”結(jié)構(gòu)通過兩個(gè)反轉(zhuǎn)角基序創(chuàng)建，其允許穿過活化袋并結(jié)合蛋白表面。(B)組合的靜電(N末端鹽橋)、疏水性(Ilel和Val2)、氫鍵(黑色虛線)和范德瓦爾(van der Waals) (P_W-W_M基序)相互作用促進(jìn)相互作用和變構(gòu)性活化。
[0034]圖9.結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的庫設(shè)計(jì)和基于活性的噬菌體分選。(A)優(yōu)化的15聚體肽庫，其融合噬菌體基因-VIII的N末端并基于結(jié)構(gòu)信息和選擇性隨機(jī)化設(shè)計(jì)。(B)來自對(duì)照溶液分選(直接結(jié)合分類)的 96種噬菌體克隆，或來自基于活性分選(基于活性分類)的96種克隆的2維ELISA結(jié)果。來自噬菌體對(duì)scHGF β的特異性結(jié)合的ELISA信號(hào)沿y軸繪出，而來自scHGF β依賴性Met捕捉的ELISA信號(hào)沿x軸繪出。(C)來自基于活性分選的獨(dú)特的線性和環(huán)狀序列。
[0035]圖10.激活scHGFβ對(duì)Met結(jié)合的優(yōu)化的15聚體線性(ZAP.01，菱形)和環(huán)狀(ZAP.03，方形)合成肽的表觀結(jié)合親和力。ZAP.03的高親和力結(jié)合顯著受損，當(dāng)將任一N末端異亮氨酸替代為甘氨酸(ZAP.03G,圓形)，或?qū)腚装彼崽娲鸀榻z氨酸(ZAP.03S，三角)時(shí)，其消除二硫鍵。
[0036]圖11.BxPC-3細(xì)胞存活測定法。(A)HGF(200ng/ml)能有力地刺激細(xì)胞存活而scHGF (200ng/ml)沒有活性。(B) scHGF的肽滴定顯示對(duì)于ZAP.03 (黑色)、ZAP.01 (深灰)和IVGG.14(淺灰)scHGF的變構(gòu)性活化和引發(fā)細(xì)胞存活。即使在肽的低微摩爾級(jí)濃度，ZAP.03也能將scHGF活化至與(A)中HGF類似的水平。
[0037]圖12.酶原絲氨酸蛋白酶的肽活化。IVGG.147A的滴定增強(qiáng)對(duì)于前凝血酶_2 (空心圓)和蛋白C(實(shí)心圓)的底物水解速率，在存在2mM三肽底物Ile-Pro-Arg-pNA的情況下。
[0038]圖13.結(jié)合HGFi3 V495G的活化袋(淺灰)的ZAP.03激活劑(深灰)的晶體結(jié)構(gòu)。(A)新的環(huán)狀基序由一個(gè)二硫鍵穩(wěn)定，其將ZAP.03的c末端連接至位置5，其先前在IVGG.14中為酪氨酸(圖8)。?)2八?.03享有與1￥66.14(圖8)類似的靜電(N末端鹽橋)、疏水性(Ilel和Ilel2)和氫鍵(黑色虛線)相互作用，但還含有由環(huán)狀基序提供的另外的氫鍵，其有助于更高的結(jié)合親和力和增強(qiáng)的激活劑功能。[0039]發(fā)明詳述
[0040]本文中提供酶原激活分子(例如酶原激活肽(ZAP))，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)并活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)。例如，本文中提供酶原激活分子(例如ZAP)，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能通過HGF調(diào)控c-Met的活化，具體地通過與原HGF^鏈域的相互作用。在一個(gè)方面，這些酶原激活分子通過一種組合辦法生成，其導(dǎo)致能與原HGF的β鏈域以各種親和力相互作用并激活c-Met信號(hào)傳導(dǎo)的酶原激活分子(例如ZAP)的鑒定。如本文中大量描述的，這些酶原激活分子(例如ZAP)的鑒定，以及原HGF的β鏈域與這些酶原激活分子(例如ZAP)之間的結(jié)合相互作用的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步提供了鑒定能與以下多肽相互作用的其他調(diào)控物的手段，所述多肽包含胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶域和/或胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶樣域。鑒于胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶樣蛋白如HGF在多種細(xì)胞和生理學(xué)過程中的重要性，這些調(diào)控物可能在如預(yù)防、治療和/或診斷背景中具有重要效用。 [0041]通用技術(shù)
[0042]除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用常規(guī)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面解釋，如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，，，second edition(Sambrook等,1989) ^iOligonucleotide Synthesis，，(M.J.Gait, ed.，1984) ;“Animal CellCulture，，(R.1.Freshney, ed.，1987) ;“Methods in Enzymo logy ^(Academic Press, Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel 等編，1987,和定期更新)；iiPCR:The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis 等編，1994) ;“A Practical Guide toMolecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988)。
[0043]本發(fā)明中采用或描述的寡核苷酸、多核苷酸、肽、多肽和小分子可使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成。
[0044]定義
[0045]當(dāng)指一種分子時(shí)，“分離的”指已經(jīng)鑒定且與其天然環(huán)境的成分分開和/或從其回收的分子。其天然環(huán)境的污染性成分是干擾診斷或治療用途的材料。
[0046]如本文中使用的，“控制序列”是使可操作連接的編碼序列能在特定宿主生物體中表達(dá)的DNA序列。原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核生物的控制序列啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。
[0047]若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是“可操作連接的”。例如，若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接，或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。
[0048]“活性”多肽或其片段保留活性多肽的天然或天然存在的對(duì)應(yīng)物的生物學(xué)活性。生物學(xué)活性指由活性多肽的天然或天然存在的對(duì)應(yīng)物介導(dǎo)的功能。例如，結(jié)合或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成生物學(xué)活性。
[0049]“親和力”指分子(例如酶原激活分子(例如ZAP))的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域例如HGF的β鏈域的多肽)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有指示，如本文中使用的，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如ZAP和HGF的β鏈域)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì)其配偶體Y的親和力通?？梢杂媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可以通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結(jié)合親和力的具體的說明性和例示性的實(shí)施方案。
[0050]本文中術(shù)語“抗體”以最廣義使用且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。在一些實(shí)施方案中，抗體可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。
[0051]“抗體片段”指完整抗體外的分子，其包含完整抗體中結(jié)合與完整抗體結(jié)合的抗原的一部分?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0052]與參照抗體“結(jié)合相同表位”的抗體指在競爭測定法中將參照抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50%或更多的抗體，反之，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50%或更多。本文中提供例示性的競爭測定法。
[0053]術(shù)語“嵌合 ”抗體指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自一個(gè)特定的來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的剩余部分源自不同來源或物種的抗體。
[0054]抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型?？贵w有5種主要的類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中數(shù)種可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgG1UgG2UgG^IgG4、IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同免疫球蛋白類的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。
[0055]來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的輕鏈可基于其恒定域的氨基酸序列分配為兩種截然不同的類型(稱為kappa ( K )和IambdaO ))之一。
[0056]如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體”指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，只是有可能的變體抗體，其例如含有天然存在的突變或是在單克隆抗體制備物生產(chǎn)期間產(chǎn)生的，這類變體一般以較小量存在。與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。因此，修飾語“單克隆”指示由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如,依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有所有或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，在本文中描述了這類方法和其他用于制備單克隆抗體的例示性方法。
[0057]術(shù)語“嵌合”抗體指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自一個(gè)特定的來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的剩余部分源自不同來源或物種的抗體。
[0058]“人源化”抗體指包含來自非人高變區(qū)(HVR)的氨基酸殘基和來自人框架區(qū)(FR)的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)對(duì)應(yīng)于非人抗體的HVR，且所有或基本上所有FR對(duì)應(yīng)于人抗體的FR。人源化抗體任選地可以包含至少部分自人抗體衍生的抗體恒定區(qū)?？贵w例如非人抗體的“人源化形式”指已經(jīng)經(jīng)過人源化的抗體。
[0059]“人抗體”是具有對(duì)應(yīng)于由人或人細(xì)胞生成的抗體的氨基酸序列的抗體、或者自利用了人抗體全集或其它編碼人抗體的序列的非人來源衍生的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0060]“親和力成熟的”抗體指在一個(gè)或多個(gè)HVR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這類改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。
[0061]“表位標(biāo)記的”多肽指與“標(biāo)簽多肽”融合的嵌合多肽。這類標(biāo)簽提供表位而可制備或獲得針對(duì)其的抗體，但其又不實(shí)質(zhì)性干擾多肽活性。為了減少抗標(biāo)簽抗體與內(nèi)源性表位的反應(yīng)性，標(biāo)簽多肽通常是唯一的。合適的標(biāo)簽多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常在約8個(gè)和約50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個(gè)和約20個(gè)氨基酸殘基之間)。表位標(biāo)簽序列的例子包括來自A型流感病毒的HA、⑶、和c-myc、聚His和FLAG。
[0062]“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物綴合。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷酸三 酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有燒化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基基團(tuán)可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換,用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可綴合至固體或半固體支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊替代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2’_氧-甲基、2’-氧-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α -端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷。可用備選連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯”(thioate))、P (S) S ( “二硫代酸酯”(dithioate))、(0)NR2( “酰胺酯”(amidate))、P (0) R、P (0) 0R’、⑶或CH2 ( “甲縮醛”(formacetal))替代，其中R或R’各自獨(dú)立為H或者替代或未替代的烷基(1-20個(gè)C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括 RNA 和 DNA。
[0063]如本文中使用的，“寡核苷酸” 一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述等同且完全適用于寡核苷酸。
[0064]“酶原激活分子”在用于本文時(shí)指且包括能夠直接或間接地、實(shí)質(zhì)性地、全部或部分地誘導(dǎo)、促進(jìn)或增強(qiáng)包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)的生物學(xué)活性或包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽的靶物(例如c-Met)的活化的任意分子。
[0065]“酶原激活肽”或“ZAP”在用于本文時(shí)指且包括能夠直接或間接地、實(shí)質(zhì)性地、全部或部分地誘導(dǎo)、促進(jìn)或增強(qiáng)包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)的生物學(xué)活性或包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽的靶物(例如c-Met)的活化的任意肽。
[0066]“小分子”指具有例如低于約5kD，低于約4kD，和低于0.6kD的分子量的組合物。
[0067]術(shù)語“肽” 一般指通過肽鍵連接的氨基酸的連續(xù)且相對(duì)短的序列。典型地，但不是必須地，肽的長度為約2至約50個(gè)氨基酸、約4-40個(gè)氨基酸或約10-30個(gè)氨基酸。雖然術(shù)語“多肽”一般指“肽”的較長形式，但是兩個(gè)術(shù)語在本文的有些背景中可以且已經(jīng)互換使用。
[0068]術(shù)語“氨基酸”和“殘基”在本文中可交換使用。
[0069]多肽的“區(qū)域”是2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)序列。在其他實(shí)施方案中，區(qū)域是任意的至少約3個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)連續(xù)的氨基酸?！癈末端區(qū)域”或其變體指包含位于與多肽C末端最接近的1-5個(gè)殘基的多肽區(qū)域?！癗末端區(qū)域”或其變體指包含位于與多肽N末端最接近的1-5個(gè)殘基的多 肽區(qū)域。多肽的“內(nèi)部區(qū)域”指既不位于多肽的N末端也不位于多肽的C末端的多肽區(qū)域。
[0070]術(shù)語“肝細(xì)胞生長因子”、“散射因子”和“HGF”在本文中指天然序列HGF多肽、多肽變體以及天然序列多肽和多肽變體的片段(在本文中進(jìn)一步限定)。本文中描述的HGF多肽可以是從多種來源如從人組織類型或從其他來源分離的，或者是通過重組或合成方法制備的?！疤烊恍蛄蠬GF多肽”包括具有與源自自然界的相應(yīng)HGF多肽相同的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然序列HGF多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。亦參見GenBank:AAA64239.1和Uniprot:P14210。HGF在本文中一般指任何形式的HGF，包括原HGF和成熟的HGF。
[0071]SEQ ID NO:1
[0072]MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCE⑶TTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCE⑶YGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS[0073]“HGF多肽變體”或其變化形式意指如本文中限定的HGF多肽，一般是活性HGF多肽，其與本文中公開的任一種天然序列HGF多肽序列具有至少約80%的氨基酸序列同一性。這類HGF多肽變體包括，例如其中在天然氨基酸序列的N或C末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的HGF多肽。HGF多肽變體一般將與如本文中公開的天然序列HGF多肽序列具有至少約80%的氨基酸序列同一性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。HGF變體多肽一般長度將為至少約10個(gè)氨基酸，或者長度為至少約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600 個(gè)氨基酸或更長。任選地，HGF變體多肽相比于天然HGF多肽序列將具有不超過I個(gè)保守性氨基酸替代，或者不超過2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守性氨基酸替代。
[0074]“原HGF”或“單鏈HGF”在本文中指HGF的分泌性單鏈酶原樣前體形式。原HGF能結(jié)合c-Met,但不能活化C-met。Cnet是已知的HGF受體,經(jīng)由其來生物學(xué)實(shí)現(xiàn)HGF胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。原HGF包含α鏈域和β鏈域。術(shù)語“原HGF的α鏈域”指原HGF的N末端殘基I至494。原HGF的α鏈域由N末端域(N-域)繼之以4個(gè)Kringle域(Κ1-Κ4)組成。N-域含有肝素結(jié)合位點(diǎn)且與血纖維蛋白溶酶原的N末端預(yù)活化(preactivation)肽(PAP)同源。術(shù)語“原HGF的β鏈域”指原HGF內(nèi)的C末端殘基495-728。β鏈域包含絲氨酸蛋白酶樣區(qū)的酶原形式。
[0075]“成熟HGF”或“雙鏈HGF”指二硫鍵連接的α / β異二聚體，其從原HGF殘基494和殘基495之間的蛋白水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。術(shù)語“HGF的α鏈”、“HGF α ”、“HGF α鏈”或“ α鏈”指HGF的片段，其包含蛋白水解切割后原HGF的C末端殘基1-494。術(shù)語“HGF的β鏈”指HGF的片段，其包含蛋白水解切割后原HGF的N末端殘基495-728。
[0076]術(shù)語“絲氨酸蛋白酶”或“絲氨酸蛋白酶樣”指胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶家族的多肽。絲氨酸蛋白酶和蛋白酶樣蛋白的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶家族屬于族(Clan)PA且稱為家族SI (亦稱為家族S01)和/或記載于MEROPS數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk)(Rawlings, N.D.等(2010)Nucleic Acids Res38:D227_33)。
[0077]關(guān)于參照多肽序列的“百分比)氨基酸序列同一性”定義為在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守性替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為測定百分比氨基酸序列同一性目的比對(duì)可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于比對(duì)序列的適宜參數(shù)，包括在比較序列的全長里獲得最大比對(duì)需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2來生成％氨基酸序列同一'I"生值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech, Inc.創(chuàng)作，并且源代碼已與用戶文檔一起提交到美國版權(quán)局(U.S.Copyright Office) ,Washington D.C., 20559,其在美國版權(quán)注冊 N0.TXU510087 下注冊。ALIGN-2 程序可從 Genentech, Inc., South San Francisco,California公開獲得,或可從源代碼匯編。ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)匯編用于UNIX操作系統(tǒng),包括數(shù)字UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)均由ALIGN-2程序設(shè)定且不改變。[0078]在采用ALIGN-2進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，給定的氨基酸序列A對(duì)/與/相對(duì)給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短語表示為對(duì)/與/相對(duì)給定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計(jì)算:
[0079]分?jǐn)?shù)X/Y的100倍
[0080]其中X是由序列比對(duì)程序ALIGN-2在所述程序?qū)和B的比對(duì)中評(píng)為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，而其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。會(huì)領(lǐng)會(huì)的是，當(dāng)氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時(shí)，A對(duì)B的％氨基酸序列同一性將不等于B對(duì)A的％氨基酸序列同一性。除非另外明確說明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那樣使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得。
[0081]“融合蛋白”指具有兩個(gè)共價(jià)連接在一起的部分的多肽，其中每個(gè)部分是從不同蛋白質(zhì)衍生的。所述兩個(gè)部分可通過單個(gè)肽鍵直接連接，或者經(jīng)由包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽接頭。通常，所述兩個(gè)部分和接頭會(huì)彼此處于讀碼框中，并使用重組技術(shù)來生成。
[0082]“病癥”或“病理學(xué)疾患”是任何會(huì)受益于使用本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括組織再生、組織修復(fù)、和傷口愈合、肝硬化如慢性肝硬化、纖維化如肺纖維化。
[0083]如本文中 使用的，“治療”(及其語法變體)指試圖改變所治療個(gè)體的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括但不限于，預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，酶原激活分子(例如ZAP)用于延遲疾病的形成或延緩疾病的進(jìn)展。
[0084]藥劑，例如藥物配制劑的“有效量”指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的“治療有效量”可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。
[0085]術(shù)語“藥物配制劑”指其形式容許其中含有的活性成分的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)會(huì)施用該配制劑的受試者產(chǎn)生不可接受的毒性的別的成分的制備物。
[0086]“藥學(xué)可接受載體”指藥物配制劑中除活性成分以外的成分，其對(duì)受試者是無毒性的。藥學(xué)可接受載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0087]“個(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于，馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如母牛、羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如人和非人靈長類如猴)、家兔和嚙齒動(dòng)物(例如小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體或受試者是人。
[0088]術(shù)語“包裝插頁”用于指通常包括在治療用產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它們包含有關(guān)涉及此類治療用產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、組合療法、禁忌癥和/或警告的信息。
[0089]如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，本文中提述“約”某值或參數(shù)包括(且描述)怎對(duì)該值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。例如，提述“約V,的描述包括對(duì)“X”的描述。
[0090] 理解本文中描述的本發(fā)明的方面和實(shí)施方案包括由方面和實(shí)施方案“組成”和/或“基本由”方面和實(shí)施方案“組成”。如本文中使用的，除非另外指示，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。
[0091 ] 絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域活化和信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控物
[0092]本文中提供酶原激活分子(例如ZAP)，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)并活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)。例如，本文中提供酶原激活分子(例如ZAP)，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法，所述酶原激活分子能通過HGF調(diào)控c-Met的活化，具體地通過與原HGFii鏈域的相互作用。一種調(diào)控包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)與其靶物(例如c-Met)之間相互作用的方式是活化包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)。任何活化包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)的分子均可以是候選酶原激活分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的篩選技術(shù)能鑒定這些分子。酶原激活分子的例子包括:(I)小的有機(jī)和無機(jī)化合物，⑵小肽，(3)抗體及衍生物，⑷與包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)密切相關(guān)的肽，(5)核酸適體(aptamer)。
[0093]在任意酶原激活分子(例如ZAP)的一些實(shí)施方案中，以及用于鑒定和使用酶原激活分子(例如ZAP)的方法中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是以下任一種的酶原或酶原樣形式:HGF、巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)、FVI1、FIX、FX、FX1、FXI1、Glu-血纖維蛋白溶酶原、Ly s-血纖維蛋白溶酶原、蛋白C、原凝血酶、血漿激肽釋放酶(PlasmaKallikrein)、Prostasin、腸激酶、胰蛋白酶2、胰蛋白酶1、胰凝乳蛋白酶B、Hepsin、HGFA>Matriptase、Testisin、類胰蛋白酶alphal、類胰蛋白酶betal、類胰蛋白酶beta2、類胰蛋白酶gamma、神經(jīng)胰蛋白酶(Neurotrypsin)、載脂蛋白A、MASPU MASP2、PSA KLK3、觸珠蛋白、補(bǔ)體Clr、補(bǔ)體Cls、尿激酶uPA、tPA、或補(bǔ)體因子D。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是HGF、MSP、Hepsin、HGFA或Matriptase。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是HGF。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是前凝血酶-2或原凝血酶。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是蛋白C。
[0094]小分子酶原激活分子
[0095]在一些實(shí)施方案中，所述酶原激活分子是小分子。小分子可以是包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)的有用調(diào)控物，其通過結(jié)合并活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)。例如，本文中提供能通過HGF(具體是通過與原HGF的β鏈域相互作用)調(diào)控c-Met活化的小分子。小分子調(diào)控物的例子包括小肽、肽樣分子、可溶性和合成的、無肽基有機(jī)或無機(jī)化合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、擬肽類(peptidomimetics)、碳水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)或無機(jī)分子。在一些實(shí)施方案中，所述小分子是ZAP?；瘜W(xué)和/或生物學(xué)混合物如真菌、細(xì)菌或藻類提取物的庫是本領(lǐng)域中已知的且可使用任一種測定法來篩選。已描述了用于合成分子庫的方法的例子(Carell 等，Angewandte Chemie International Edition.33:2059-2061 (1994)；Carell 等，Angewandte Chemie International Edition.33:2061-2064(1994)；Cho 等，Science.261: 1303-5 (1993) ；Deffitt 等，Proc Nat I Acad Sci U SA.90:6909-13(1993) ;Gallop 等，J Med Chem.37:1233-51 (1994) ; Zuckermann 等，J MedChem.37:2678-85(1994)。
[0096]化合物的庫可在溶液中(Houghten等，Biotechniques.13:412-21 (1992))或珠上(Lam 等，Nature.354:82-84(1991))、芯片上(Fodor 等，Nature.364:555-6(1993))、細(xì)菌、抱子(Ladner 等，美國專利 N0.5，223，409，1993)，plasmids (Cull 等，Proc NatlAcad Sci USA.89:1865-9 (1992))或卩遼菌體上呈現(xiàn)(Cwirla 等，Proc Natl AcadSci U S A.87:6378-82(1990) ；Devlin 等，Science.249:404-6(1990) ；Felici 等，JMol Biol.222:301-10(1991) ;Ladner 等，美國專利 N0.5，223，409，1993 ;Scott 和Smith, Science.249:386-90 (1990))。一種無細(xì)胞測定法包括使包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)與已知的酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)接觸以形成測定混合物，使所述測定混合物與候選酶原激活分子(例如ZAP)接觸，并測定所述候選化合物與包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)或酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)相互作用的能力，其中測定所述測試化合物與包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)或酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)相互作用的能力包括測定包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)/酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)復(fù)合物是否有可檢測的特征受到調(diào)控。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步測定酶原激活分子(例如ZAP)活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)的能力。例如，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)與酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)的結(jié)合相互作用，如通過形成的復(fù)合物的量測定的，可以指示測試化合物是否能調(diào)控包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)與酶原激活分子(如本文中描述的一種或多種ZAP)之間的相互作用。復(fù)合物的 量可通過本領(lǐng)域已知的方法評(píng)估，其中一些在本文中描述，例如ELISA(包括競爭性結(jié)合ELISA)、酵母雙雜交和接近(proximity)(例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移、酶-底物)測定法。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步測定酶原激活分子(例如ZAP)活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)的能力，如實(shí)施例3中描述的。
[0097]酶原激活肽(ZAP)、多肽和抗體酶原激活分子
[0098]在一些實(shí)施方案中，所述酶原激活分子是ZAP、多肽或抗體，其調(diào)控包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽(例如HGF)與其細(xì)胞和/或生理學(xué)靶物(例如c-Met)之間的生物學(xué)活性。
[0099]在一個(gè)方面，本文中提供ZAP，其中ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BjSEQ IDNO: 2)，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是G、D、E、N、D-Gly、D-Asp、D-Glu、D-Asn 或 D-GlnQ，X4 是 G 或 A，B 是任意氣基酸，而 η 是 0-46 的數(shù)字。本文中還提供ZAP，其中ZAP由或基本由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID N0:31)組成，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是6、D、E、N或Q，X4是G或A，B是任意氨基酸，而η是0_46的數(shù)字。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中X1是V，X3不是N(即X3是6、0、E或Q) (SEQ ID NO: 32)。
[0100]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，X1是M、L、1、V或正亮氨酸(SEQ ID NO:4)。在一些實(shí)施方案中，乂1是1、I或V(SEQ ID NO: 5)。在一些實(shí)施方案中，X1是I或V (SEQ IDNO:6)。在一些實(shí)施方案中，X1是I (SEQ ID NO: 7)。
[0101]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，X2是M、L、1、V、正亮氨酸、F或Y(SEQ ID N0:8)。在一些實(shí)施方案中，\是1、V、L或F(SEQ ID N0:9)。在一些實(shí)施方案中，X2是I或V (SEQID NO:10)。
[0102]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，&是6、0或N(SEQ ID NO: 11)。在一些實(shí)施方案中，X3 是 G(SEQ ID NO: 12)。
[0103]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，X4是G(SEQ ID NO: 13)。
[0104]例如，本文中提供ZAP，其中ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO: 33)，其中X1是1匕1、V或正亮氨酸，X2是1匕1、V、正亮氨酸、F或Y，&是6、03^或0，X4是G或A，B是任意氨基酸，而η是0-46的數(shù)字。本文中還提供ZAP，其中ZAP由或基本由氛基酸序列X「X2_X3_X4_Bn(SEQ ID NO: 33)組成，其中X1是M、L、1、V或正売氛酸，X2是M、L、1、V、正亮氨酸、F或Y，X3是G、D、E、N或Q，X4是G或A，B是任意氨基酸，而η是0_46的數(shù)字。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中X1是V，X3不是N(即X3是G、D、E或Q) (SEQID NO:32)。
[0105]本文中提供ZAP，其中ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO: 34)，其中X1是L、I或V, X2是L 、1、V或F, X3是G、D或N, X4是G或A, B是任意氣基酸，而η是0-46的數(shù)字。本文中還提供ZAP，其中ZAP由或基本由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO:34)組成，其中乂1是1^、1或￥,乂2是1^、1、￥或？,乂3是6、0或1乂4是6或4,13是任意氛基酸，而η是0-46的數(shù)字。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中X1是V，X3不是Ν(即X3是G、D、E 或 Q) (SEQ ID NO:35)。
[0106]本文中還提供ZAP，其中ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO: 36)，其中X1是I，X2是I或V, X3是G, X4是G, B是任意氨基酸，而η是0_46的數(shù)字。本文中還提供ZAP，其中ZAP由或基本由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO:36)組成，其中X1是I，X2是I或V，X3是G, X4是G, B是任意氨基酸，而η是0_46的數(shù)字。
[0107]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:X「mBn(SEQ ID NO:2),X1-X2-X3-X4(SEQID NO:14)為 IVGG(SEQ ID NO:15)、 IVDG(SEQ ID NO:16)、 IVdG、 IVGG(SEQ ID NO:17)、IIGG (SEQ ID NO: 18)、VVNG (SEQ ID NO: 19)、VVGG (SEQ ID NO: 20)、IVGG (SEQ ID NO:21)、LIDG(SEQ ID NO:22)、 IVEG(SEQ ID NO:23)、 ITGG(SEQ ID NO:24)、 IVNG(SEQ ID NO:25)、IFNG(SEQ ID NO:26)、IYGG(SEQ ID NO:27)、ILGG(SEQ ID NO:28)或IKGG(SEQ ID NO:29)，其中d是D-天冬氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=X1-X2-X3-X4-BJSEQ ID NO:2),X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO:14)為 IVGG(SEQ ID NO:15)、IVDG(SEQ ID NO:16)、IVdG、IVGG(SEQID NO: 17)、IIGG (SEQ ID NO: 18)、WGG (SEQ ID NO: 20)、IVGG (SEQ ID NO: 21)、LIDG (SEQ IDNO:22)、 IVEG(SEQ ID NO:23)、 ITGG(SEQ ID NO:24)、 IVNG(SEQ ID NO:25)、 IFNG(SEQ IDNO: 26)、IYGG(SEQ ID NO: 27)、ILGG(SEQ ID NO: 28)或 IKGG(SEQ ID NO: 29)，其中 d是D-天冬氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:X「mBn(SEQ ID NO:2),X1-X2-X3-X4(SEQID NO:14)為 IVGG(SEQ ID NO:15)、 IVDG(SEQ ID NO:16)、 IVdG,IVGG(SEQ ID NO:17)或IIGG (SEQ ID NO: 18)，其中d是D-天冬氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP不包含VVNG (SEQ ID NO: 19)，不由或基本由其組成。
[0108]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP還包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQ ID NO:37)，其中X5是Y或F，X6是P，X7是W，X8是W，X9是M、I或V，Xltl是D或E，X11是V或A。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP還包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQ ID NO: 119)，其中 X5 是 Y、C、D 或 F，X6 是 Y或 P，X7 是 W 或 Y，X8 是 W 或 D，X9 是 M、I 或 V，Xltl 是 D、P 或 E，X11 是 V、H、R、I 或 A。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP還包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO: 120),其中X5 是 Y、C、D 或 S，X6 是 P，X7 是 W 或 Y，X8 是 W，X9 是 M、I 或 V，X10 是 P、D 或 E，X11 是 H、R、V或A，X12是不存在、P或E，X13是G或E，X14是D、C或S，而X15是A或I。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP還包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQ ID NO: 121)，X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO: 122),其中X5是任意氨基酸，X6是P，X7是任意氨基酸，X8是W，Xg-Xi5是任意氨基酸。在一些實(shí)施方案中，X5是C。在一些實(shí)施方案中，X14是C。
[0109]在任一種ZA P的一些實(shí)施方案中，η是大于如下任意數(shù)字的數(shù)字:約1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、15、20、25或30。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，η是小于如下任意數(shù)字的數(shù)字:約 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25 或 30。在任一種 ZAP 的一些實(shí)施方案中，η是約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15。在一些實(shí)施方案中，η 是約 5、6、7 或 8。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，η是任意的介于約3-15、3-7、3-10、3-12、5-12或5_10之間的數(shù)字。
[0110]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IVGGYPWWMDV(SEQ ID NO:38),IVDGYPffffMDV(SEQ ID NO:39), IVdGYPffffMDV, IVGGYhyPffffMDV(SEQ ID NO:40)、IIGGYhyPffffMDV (SEQ ID NO: 41)、VVNGIPTRTNI (SEQ ID NO:42), VVGGHPGNSPff (SEQ IDNO:43)、IVGGKVCPKGE(SEQ ID NO:44)、VVGGEDAKPGQ(SEQ ID NO:45)、IVGGQECKDGE(SEQ IDNO:46)、IVGGTASVRGE(SEQ ID NO:47)、VVGGLVALRGA(SEQ ID NO:48)、VVGGCVAHPHS(SEQ IDNO:49),VVGGCVAHPHS(SEQ ID NO:50)、LIDGKMTRRGD(SEQ ID NO:51)、IVEGSDAEIGM(SEQ IDNO:52)、IVGGTNSSffGE(SEQ ID NO:53)、ITGGSSAVAGQ(SEQ ID NO:54)、IVGGSNAKEGA(SEQ IDNO:55)、IVGGYICEENS(SEQ ID NO:56)、IVGGYNCEENS(SEQ ID NO:57)、IVNGEDAVPGS(SEQ IDNO:58),IVGGRDTSLGR(SEQ ID NO:59)、IIGGSSSLPGS(SEQ ID NO:60)、WGGTDADEGE(SEQ IDN0:61)、IVGGEDAELGR(SEQ ID NO:62)、IVGGQEAPRSK(SEQ ID NO:63)、IVGGQEAPRSK(SEQ IDNO:64)、IVGGQEAPRSK(SEQ ID NO:65)、IVGGHAAPAGA(SEQ ID NO:66),1IGGKNSLRGG(SEQ IDNO:67),IVGGCVAHPHS(SEQ ID NO:68)、IFNGRPAQKGT(SEQ ID NO:69)、IYGGQKAKP⑶(SEQ IDNO:70)、IVGGffECEKHS(SEQ ID NO:71)、ILGGHLDAKGS(SEQ ID NO:72)、IIGGQKAKMGN(SEQ IDN0:73)、IIGGSDADIKN(SEQ ID NO:74)、IIGGEFTTIEN(SEQ ID NO:75)、IKGGLFADIAS(SEQ IDN0:76)JP/*ILGGREAEAHA(SEQ ID NO:77)，其中d是D-天冬氨酸而hyP是羥脯氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IVGGYPWWMDV(SEQ ID NO:38)、IVDGYPffWMDV(SEQ IDNO:39), IVdGYPffWMDV, IVGGYhyPffWMDV(SEQ ID NO:40), IIGGYhyPffWMDV(SEQ ID N0:41)、VVGGHPGNSPff (SEQ ID NO:43),IVGGKVCPKGE (SEQ ID NO:44)、WGGEDAKPGQ(SEQ ID NO:45),IVGGQECKDGE(SEQ ID NO:46)、IVGGTASVRGE(SEQ ID NO:47)、WGGLVALRGA(SEQ ID NO:48)、VVGGCVAHPHS(SEQ ID NO:49),VVGGCVAHPHS(SEQ ID NO:50)、LIDGKMTRRGD(SEQ ID NO:51)、IVEGSDAEIGM(SEQ ID NO:52),IVGGTNSSffGE(SEQ ID NO:53)、ITGGSSAVAGQ(SEQ ID NO:54)、IVGGSNAKEGA(SEQ ID NO:55)、IVGGYICEENS(SEQ ID NO:56)、IVGGYNCEENS(SEQ ID NO:57)、IVNGEDAVPGS(SEQ ID NO:58),IVGGRDTSLGR(SEQ ID NO:59)、IIGGSSSLPGS(SEQ ID NO:60)、VVGGTDADEGE(SEQ ID NO:61)、IVGGEDAELGR(SEQ ID NO:62)、IVGGQEAPRSK(SEQ ID NO:63),IVGGQEAPRSK(SEQ ID NO:64)、IVG GQEAPRSK(SEQ ID NO:65)、IVGGHAAPAGA(SEQ ID NO:66)、IIGGKNSLRGG(SEQ ID NO:67)、IVGGCVAHPHS(SEQ ID NO:68)、IFNGRPAQKGT(SEQ ID NO:69)、IYGGQKAKPGD(SEQ ID NO:70)、IVGGWECEKHS(SEQ ID NO:71)、ILGGHLDAKGS(SEQ ID NO:72),IIGGQKAKMGN(SEQ ID NO:73)、IIGGSDADIKN(SEQ ID NO:74)、IIGGEFTTIEN(SEQ ID NO:75),IKGGLFADIAS (SEQ ID NO: 76)，和 / 或 ILGGREAEAHA (SEQ ID NO: 77)，其中 d 是 D-天冬氨酸而hyP是羥脯氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=IVGGYPffWMDV(SEQ IDNO:38)、IVDGYPffWMDV(SEQ ID NO:39), IVdGYPffWMDV, IVGGYhyPffWMDV(SEQ ID NO:40)，和/或IIGGYhyPffWMDV(SEQ ID NO:41)，其中d是D-天冬氨酸而hyP是羥脯氨酸。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP不包含VVNGIPTRTNI(SEQ ID NO: 42)，不由或基本由其組成。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:iiggdpywvphpgda(seq id no: 123)。在任一種zap的一些實(shí)施方案中，其中所述zap包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IIGGCPYWMDREECI(SEQ ID NO: 124)。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IIGGSPYWMDREESI(SEQ ID NO: 125)。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IVGGCYffffVPI (SEQ ID NO: 126)。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:VGGDPYWVPHPGDA(SEQID NO:127)。
[0111] 在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成=IVGGDYffffVPI (SEQ IDNO:128)，IVGGDFYSSYff(SEQ ID NO:129)，IVGGDGMPffffI(SEQ ID NO:130)，IVGGYPffWMDV(SEQID NO: 38) , IVGGDPVYVLY (SEQ ID NO: 131), IVGGYPffffITG(SEQ IDNO:132)，IVGGYPffffVDV(SEQ ID NO:133)，IVGGYPAWMEY(SEQ ID NO:134)，IVGGSDFPffffV(SEQID NO: 135) , IVGGLffEMffVT(SEQ ID NO:1 36)，I VGGEPAYWYW ( SEQ IDNO:137)，IVGGHPMSPFS(SEQ ID NO:138)，IVGGDPffffFVS(SEQ ID NO:139)，IVGGPHKAFLL(SEQID NO: 140) , IVGGEPVffYVff (SEQ ID NO:1 4 I)，I VGGYPVYFLN(SEQ IDNO:142)，IVGGEPVYYVT(SEQ ID NO:143)，IVGGCKRSYffE(SEQ ID NO: 144)，IVGGTRCNDffI(SEQID NO: 145)，IVGGSACLIAM(SEQ ID NO: 146) , IVGGVRCffVSN(SEQ IDNO:147), IVGGLDVEYEL(SEQ ID NO:148), IVGGMRLCGYI(SEQ ID NO:149),IVGGNKIffSVS(SEQID NO:150), IVGGDYYffVVQ (SEQ ID NO:151), IVGGKffQRKRV(SEQ ID NO:152),和 / 或IVGGFVFffCDQ(SEQ ID NO:153)。
[0112]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IIGGDPVWDITYTYA(SEQID NO:174),IIGGDPYffYPHPGTV(SEQ ID NO:154),IVGGDPYffVPHPGDA(SEQ IDNO:127), IIGGEPAffVffYEDCM(SEQ ID NO:155), IIGGDPffffTPHPSFV(SEQ ID NO:156)、IVGGDPffffVDHMYLT(SEQ ID NO:157), IVGGEPVWVPWCVYD(SEQ ID NO:158),IIGGDPVffVLSTECG(SEQ ID NO:159), I IGGEPffffVDFVEDY(SEQ ID NO:160),IIGGCPYWMDREECI (SEQ ID NO: 124)，和 / 或 IVGGCPYWMDREECL(SEQ ID NO: 161)。
[0113]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP包含下述氨基酸序列、由下述氨基酸序列組成、或基本上由下述氨基酸序列組成:IIGGCPTYCMSTGCA(SEQ IDNO:162)、 IIGGCPLDDGVARCL(SEQ ID NO:163),IIGGCPIDGRVffACG(SEQ ID NO:164)、IIGGCPAAVSNSVCY(SEQ ID NO:165)、IIGGCPAGSELAVCT (SEQ ID NO:166),和 / 或IIGGCPLYCMITGCA(SEQ ID NO:167)。
[0114]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP是線性的。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，其中所述ZAP是環(huán)狀的。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP包含二硫鍵。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP包含分子內(nèi)二硫鍵。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP包含Cys-5和Cys_14之間的分子內(nèi)二硫鍵。
[0115]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽并活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是以下任一種的酶原或酶原樣形式:HGF、MSP、FVI1、FIX、FX、FX1、FXI1、Glu-血纖維蛋白溶酶原、Lys-血纖維蛋白溶酶原、蛋白C、原凝血酶、血楽；激肽釋放酶、Prostasin、腸激酶、胰蛋白酶2、胰蛋白酶
1、胰凝乳蛋白酶B、Hepsin、HGFA> Matriptase、Testisin、類胰蛋白酶alphal、類胰蛋白酶betal、類胰蛋白酶beta2、類胰蛋白酶gamma、神經(jīng)胰蛋白酶、載脂蛋白A、MASP1、MASP2、PSAKLK3、觸珠蛋白、補(bǔ)體Clr、補(bǔ)體Cls、尿激酶uPA、tPA或補(bǔ)體因子D。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是HGF、MSP、Hepsin、HGFA或Matriptase。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是前凝血酶-2或原凝血酶。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是蛋白C。在一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是MSP。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP變構(gòu)性活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽。
[0116]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽是HGF。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域并經(jīng)由c-Met激活HGF信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域的活化袋。在一些實(shí)施方案中，所述ZAP變構(gòu)性活化HGF。
[0117]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP具有如由低于任意的約1.0mM,500 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ Μ、10 μ Μ、5 μ M或I μ M的Kd測定的對(duì)包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽的結(jié)合親和力。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP具有如由低于任意的約 1.0mM,500 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ Μ、10 μ Μ、5 μ M或 I μ M 的 Kd測定的對(duì)HGF 的結(jié)合親和力。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP具有如由低于任意的約1.0πιΜ、500μΜ、100μΜ、50μΜ、25μΜ、10μΜ、5μΜ或ΙμΜ的Kd測定的對(duì)原HGFP鏈域的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，由Kd測定的結(jié)合親和力通過本領(lǐng)域中已知的任意方法，特別是實(shí)施例2中描述的方法來測定。
[0118]在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP可以是分離的。在任一種ZAP的一些實(shí)施方案中，所述ZAP是合成的ZAP，多肽鏈經(jīng)由化學(xué)合成創(chuàng)建。
[0119]在一些實(shí)施方案中，所述酶原激活分子(如ZAP)可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過適宜的純化方案從細(xì)胞或組織來源分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶原激活分子(如ZAP)通過重組DNA技術(shù)生成。作為重組表達(dá)的備選方案，酶原激活分子(如ZAP)可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成。
[0120]還提供突變體或變體酶原激活分子(如ZAP)，其任意殘基可從這些酶原激活分子(如ZAP)的相應(yīng)殘基變化，而仍然編碼保持調(diào)控活性的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶原激活分子(如ZAP)/包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)/靶物(例如c-Met)的變體與參照結(jié)合劑肽/多肽/配體具有至少50%、60 %、70%、80 %、90 %、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性。一般地，所述變體展現(xiàn)出與參照酶原激活分子(如ZAP)/包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)/靶物(例如c-Met)基本相同或更大的結(jié)合親和力 ，例如參照酶原激活分子(如ZAP)/包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽(例如HGF)/靶物(例如c-Met)的結(jié)合親和力的至少0.75倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.25倍或1.5倍，基于本領(lǐng)域接受的結(jié)合測定定量單位/度量。
[0121]一般而言，本文中的變體包括其中序列中特定位置處的殘基已被其他氨基酸替代的變體，而且還包括在親本蛋白質(zhì)/肽的兩個(gè)殘基之間插入另外的殘基(一個(gè)或多個(gè))的可能性以及從親本序列缺失一個(gè)或多個(gè)殘基或向親本序列添加一個(gè)或多個(gè)殘基的可能性。任意氨基酸替代、插入或缺失均由本發(fā)明涵蓋。在有利的情況下，所述替代是保守性替代，如本文中描述的。
[0122]在一些實(shí)施方案中，所述酶原激活分子(例如ZAP)是分離的多肽。污染性成分包括通常會(huì)干擾多肽的診斷性或治療性用途的材料，且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性材料。具有優(yōu)選按干重量計(jì)低于約30 %的不想要的污染材料(污染物)，優(yōu)選低于約20%，約10%，且優(yōu)選低于約5%污染物的制備物視為基本分離的。優(yōu)選地，分離的、重組生成的肽/多肽或其生物學(xué)活性部分基本沒有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基優(yōu)選代表低于約20%，優(yōu)選低于約10%，和優(yōu)選低于約5%體積的肽/多肽制備物。污染物的例子包括細(xì)胞殘片、培養(yǎng)基以及在肽/多肽的體外合成期間使用和產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0123]肽/多肽的保守性替代顯示于表1的標(biāo)題“優(yōu)選替代”下。如果這類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么可引入更多的實(shí)質(zhì)性變化(名為表1中的“例示性替代”或如下文還參照氨基酸類描述的)，并篩選產(chǎn)物。[0124]表1
【權(quán)利要求】
1.一種分離的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-Bn(SEQ IDNO: 2)，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是G、D、E、N、Q、D-Gly、D~Asp、D-Glu、D-Asn、或 D-Gln，X4 是 G 或 A，B 是任意氣基酸，而 η 是 0-46的數(shù)字。
2.一種分離的酶原激活肽(ZAP)，其中所述ZAP由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-BJSEQ IDNO:2)組成，其中X1是較大的疏水性氨基酸，X2是較大的疏水性氨基酸或芳香族氨基酸，X3是 G、D、E、N、Q、D-Gly、D-Asp、D-Glu、D-Asn、或 D-Gln, X4 是 G 或 A，B 是任意氣基酸，而 η 是0-46的數(shù)字。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中乂1是1匕1、￥或正亮氨酸(SEQID N0:4)。
4.權(quán)利要求3的分離的ZAP，其中乂1是匕1、或V(SEQID NO:5)。
5.權(quán)利要求4的分離的ZAP，其中所述X1是I(SEQ ID NO:7)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中所述X2是M、L、1、V、正亮氨酸、F、或Y(SEQID NO:8)。
7.權(quán)利要求6的分離的ZAP，其中X2是1、V、L或F(SEQID NO:9)。
8.權(quán)利要求7的分離的ZAP，其中X2是I或V(SEQID NO: 10)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中&是6、0、或N(SEQID NO: 11)。
10.權(quán)利要求9的分離的ZAP，其中X3是G(SEQID NO: 12)。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中X4是6姊0ID NO:13)。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的分離的ZAP,其中X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO: 14)是IVGG(SEQ ID NO:15)、 IVDG(SEQ ID NO:16),IVdG,IVGG(SEQ ID NO:17)、 IIGG(SEQ IDNO: 18)、VVNG(SEQ ID NO: 19)、VVGG(SEQ ID NO:20), IVGG(SEQ ID NO:21)、LIDG(SEQ IDNO:22)、 IVEG(SEQ ID NO:23)、 ITGG(SEQ ID NO:24)、 IVNG(SEQ ID NO:25)、 IFNG(SEQ IDNO:26)、IYGG(SEQ ID NO: 27)、ILGG(SEQ ID NO: 28)、或 IKGG(SEQ ID NO:29)、其中 d是D-天冬氨酸。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中所述ZAP特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽，并活化包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽。
14.權(quán)利要求13的分離的ZAP，其中所述ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域并經(jīng)由c-Met激活HGF信號(hào)傳導(dǎo)。
15.權(quán)利要求14的分離的ZAP，其中所述ZAP特異性結(jié)合原HGF的β鏈域的活化袋。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的分離的ZAP，其中所述ZAP變構(gòu)性活化所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽。
17.—種ZAP融合物，其包含綴合于載體的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的ZAP。
18.權(quán)利要求17的ZAP融合物，其中所述載體是生物可降解的聚合物(例如PEG、聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚己酸內(nèi)酯、及其共聚物、碳水化合物、淀粉、纖維素、殼多糖和木素、或多肽載體(例如Fe和血清清蛋白))。
19.權(quán)利要求17-18中任一項(xiàng)的ZAP融合物，其中所述ZAP對(duì)載體的綴合相比于未綴合載體的ZAP增加ZAP的半衰期和/或生物利用度。
20.一種治療個(gè)體中疾病或病癥的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的ZAP或權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的ZAP融合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病或病癥的癥狀是纖維化或肝硬化。
22.一種促進(jìn)個(gè)體中的組織再生和/或組織修復(fù)的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的ZAP或權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的ZAP融合物。
23.一種鑒定能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的多肽并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽的ZAP的方法，所述方法包括(a)使第一樣品與候選ZAP接觸，所述樣品包含一種多肽或其片段，所述多肽或其片段包含原形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域，(b)使第二樣品與候選ZAP接觸，所述第二樣品包含一種多肽或其片段，所述多肽或其片段包含成熟形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域，(C)測定(a)和(b)中所述候選ZAP的結(jié)合量，其中(a)中所述候選ZAP的結(jié)合比(b)多指示所述候選ZAP能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的所述多肽并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法還包括在存在所述候選ZAP和靶物的情況下測定包含原形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段的活性，其中所述活性指示所述候選ZAP能特異性結(jié)合包含絲氨酸蛋白酶域或絲氨酸蛋白酶樣域的所述多肽并激活包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述靶物是c-Met。
26.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的多肽是HGF，所述包含原形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段是原HGF，且所述包含成熟形式的絲氨酸蛋白酶酶原域或絲氨酸蛋白酶樣酶原域的所述多肽或其片段是成熟的HGF。
27.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述候選ZAP是權(quán)利要求1_16中任一項(xiàng)的一種或多種ZAP，或權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的ZAP融合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/475GK103998054SQ201280061441
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】K.E.蘭德格拉芙, R.A.拉扎魯斯 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司